Introducción

En México, la superficie sembrada de fresa (Fragaria x ananassa) en el año 2018 fue de 13,562 ha y en 2022 se redujo a 7,872 ha (SIAP, 2022), esta disminución se debe a problemas fitosanitarios que afectan su producción, asociados con diferentes especies de hongos, entre ellos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia spp. (^{Golzar et al., 2007}), Phytophthora spp. (Serret-López et al., 2016) y Botrytis cinerea (^{Boddy, 2016}), esta situación repercute en pérdidas de hasta 50 % de la producción (^{Bárcenas-Santana et al., 2019}). Para el control de estos hongos, se ha recurrido principalmente al uso de agroquímicos, sin embargo, el uso y dosis inadecuadas de estos ha generado efectos negativos en el ambiente y en el humano, también los hongos han desarrollado resistencia a fungicidas, aun así, su uso se intensifica y se han vuelto indispensables para la seguridad alimentaria mundial (^{Zubrod et al., 2019}). Esta situación ha motivado a investigadores y productores a explorar alternativas, como los extractos de plantas o compuestos derivados de las mismas que se han utilizado con éxito en el control de hongos fitopatógenos. Los extractos vegetales tienen la ventaja de contener más de un compuesto antifúngico, por lo que el desarrollo de resistencia del patógeno es menos probable si los diferentes compuestos afectan a un proceso metabólico diferente (Shuping y Eloff, 2017). Es importante considerar que en los extractos el rendimiento y la composición química es variable y depende de las condiciones climáticas, el sitio de cultivo y el tiempo de cosecha (Santos-Gomes et al., 2001; ^{Bhat et al., 2016}). Además, debido a su naturaleza volátil y a la termolabilidad de sus componentes, son muy susceptibles a la degradación (^{Odak et al., 2018}). Por lo anterior, el conocimiento científico previo de los recursos naturales o de las condiciones de manejo, tanto en campo como en almacenamiento, resulta indispensable para el aprovechamiento sustentable local de plantas y su transformación a insumos de biocontrol de hongos fitopatógenos como una vía de sustitución de pesticidas en sistemas de producción agrícola.

Tagetes (Asteraceae) es un recurso vegetal que en México está representado aproximadamente por 35 especies, varias con potencial en el control de hongos (Serrato, 2014), los extractos acuosos de algunas especies de Tagetes se han evaluado mostrando resultados promisorios, por ejemplo, T. erecta o cempasúchil es efectivo en el control de Fusarium oxysporum (^{Wang et al., 2022}) y Rhizoctonia solani (^{Espejo et al., 2010}), en tanto que in vitro, el aceite esencial de T. lemmoni o rudilla inhibe totalmente el crecimiento micelial de B. cinerea (^{Larios-Palacios et al., 2020}). Durante el proceso de hidrodestilación de plantas aromáticas se obtiene un extracto acuoso conocido como hidrosol, agua aromática, hidroflorato o hidrolato, su obtención es rápida, barata y se caracteriza por contener aceite esencial en concentraciones bajas (< 1 mL L^-1), además de algunos componentes de aceite polares, oxigenados e hidrófilos que forman enlaces de hidrógeno con el agua (Tisserand y Young 2014; ^{Labadie et al., 2016}; Taglienti et al., 2022). Los hidrolatos se utilizan en perfumería, cosmética, como saborizantes de alimentos, aromaterapia y terapias tradicionales (Rajeswara, 2013). Los estudios sobre el efecto biológico de los hidrolatos aún son limitados en comparación con los realizados con aceites esenciales (^{Yann-Olivier et al., 2018}). En el área agrícola, se han usado con éxito hidrolatos de Ocimum basilicum, Cuminum cyminum, Echinophora tenuifolia, Daucus carota subsp. sativus, Rosmarinus officinalis y Satureja hortensis para controlar algunos hongos fitopatógenos como Alternaria citri, Alternaria mali, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp tulipae, Penicillium expansum y Rhizoctonia solani (^{Boyraz y Özcan, 2005}; Boyraz y Özcan, 2006; ^{Zatla et al., 2017}). Por mucho tiempo, a los hidrolatos se les ha definido como productos de desecho de la hidrodestilación, pero en la actualidad se empiezan a utilizar como una alternativa para controlar hongos fitopatógenos. Por ello, la exploración y evaluación de otras especies aromáticas en el control de hongos de alta incidencia en cultivos como la fresa es indispensable. Considerando que Tagetes es un recurso natural abundante en México y, por lo tanto, fuente potencial de hidrolato como insumo para el biocontrol de hongos fitopatógenos, el objetivo de esta investigación fue caracterizar la composición química en hidrolatos de especies de Tagetes y evaluar su efecto in vitro e in vivo contra hongos asociados a enfermedades en fresa.

Materiales y Métodos

Muestreo vegetal. En el campo experimental de la Universidad Autónoma Chapingo (19.491733, -98.873179), en el mes de mayo de 2022 bajo condiciones de invernadero se cultivaron plantas de Tagetes: T. coronopifolia, T. minuta, T. parryi y T. terniflora, las cuales en etapa de floración fueron recolectadas en el mes de octubre y con tijeras de poda se cortaron en segmentos de 2 cm aproximadamente. La cantidad de 4 kg de una mezcla de flores (25 %), hojas (35 %) y tallos (40 %) se introdujo en matraz de destilador tipo italiano y posteriormente se agregaron 2 L de agua potable, se encendió el termostato (135±5 °C) y durante 40 min se hizo la hidrodestilación (Uddin et al., 2023). Se obtuvieron 400 mL kg^-1 de hidrolato fresco, se depositó en frascos de plástico y se conservó a una temperatura de 4 °C hasta su uso. Tres especímenes de cada especie fueron ingresados al Herbario Jorge Espinoza Salas de la Preparatoria Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo con números de registro 36282, 36280, 33299 y 36281, respectivamente.

Identificación de compuestos químicos. Los hidrolatos se analizaron en un Cromatógrafo de Gases (CG) Agilent 7890B acoplado a Detector Selectivo de Masas (MSD) Agilent 5977A (CRO-E-003) y equipado con una columna DB-WAX Ultra Inert 60 m x 250 μm x 0.25 μm. La rampa de temperatura fue 40 °C por 1 min hasta 240 °C a una velocidad de 9 °C min^-1. Se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 1 mL min^-1 durante los 24 min que duró la corrida. Los hidrolatos se filtraron en un microfiltro de PTFE de 45 μm, enseguida, se disolvieron 100 μL de la muestra en 400 μL de diclorometano grado HPLC, el extracto se concentró hasta un volumen de 1 mL y se inyectó 1 μL al cromatógrafo de gases en modo splitless. Los compuestos se identificaron con base en los patrones de fragmentación de los espectros de masas, los cuales se compararon con los espectros de masas depositados en la base de datos del NIST 14 (National Institute of Standards and Technology) y la base de datos de fragancias Flavor (Agilent Technologies). Se realizó la determinación de los índices de retención de Kovats con alcanos C7-C40 (Sigma-Aldrich). Los índices de retención de Kovats experimentales se compararon con los índices de Kovats de la literatura (NIST:webbok.nist.gov/chemistry/) considerando que el índice de Kovats experimental coincidiera (± 50 unidades) con el de la literatura para la identificación correcta del compuesto. La abundancia relativa de cada compuesto se estimó con base en el área de los picos.

Procedencia de los hongos. Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici y Rhizoctonia solani fueron aislados a partir muestras de chile manzano (Capsicum pubescens) recolectadas en una plantación de chile manzano ubicado en el campo experimental agrícola Chapingo y Botrytis cinerea se aisló a partir de muestras de flores de rosa silvestre (Rosa sp.) recolectadas en el municipio de Acaxochitlán, Hidalgo. El tejido vegetal fue desinfestado con hipoclorito de sodio al 1 % y lavado tres veces con agua bidestilada, después, en medio de cultivo Agar Dextrosa y Papa (PDA) (BD Bioxon) se colocaron fragmentos de 5 mm del tejido vegetal para aislar los hongos y el oomiceto se aisló en medio de cultivo que contenía 20 g de harina de maíz, 18 g de agar-agar, 0.8 mL de pimaricina, 0.02 g de rifamicina y 0.25 g L^-1 de ampicilina diluida en agua destilada. Las cajas Petri se dejaron a temperatura ambiente y fueron monitoreadas cada 24 h hasta observar crecimiento micelial. A las 72 h, se observó crecimiento y se transfirió inoculo a nuevo medio de cultivo para obtener cultivos puros. Después, F. oxysporum, R. solani y el oomiceto P. capsici fueron identificados mediante su morfología (Nelson et al., 1983; ^{Gutiérrez et al., 2006}; ^{Leslie y Summerell, 2006}; Plancarte et al., 2017). B. cinerea también se identificó mediante su morfología y con pruebas de patogenicidad en frutos de fresa (^{Barnett y Hunter, 1986}; Terrones-Salgado et al., 2019); además, se hizo extracción de ADN con método SDS (Dodecil Sulfato Sódico), después se hizo amplificación en PCR utilizando iniciadores NL4 y ITS5HP (Toju et al, 2012; ^{Hudagula et al., 2022}). El programa térmico se fijó a 94 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 56 72 °C durante 1 1 2.3 s, respectivamente y una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos amplificados de las reacciones de PCR fueron separados por electroforesis utilizando geles de agarosa al 1.2 %. Los fragmentos amplificados y purificados se enviaron a Macrogen para la secuenciación. Las secuencias en formato FASTA se compararon con la base de datos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), con lo cual se corroboró la identidad del hongo y el número de acceso en GenBank para B. cinerea es PP401673.1. Para la identificación molecular de los otros organismos, la extracción de ADN se hizo con el método CTAB (^{Weising et al., 2005}) con modificaciones, el micelio se obtuvo de cajas Petri con crecimiento de F. oxysporum, P. capsici y R. solani y se colocó en morteros, se agregó nitrógeno líquido y el micelio se maceró con pistilo estéril. En tubos Eppendorf de 2 mL se agregó 1 mL de CTAB 2 % + 0.2 % β-mercaptoetanol y se agregó el micelio macerado, se agitó por inmersión, se incubó a 55 °C en termoblok durante 20 min con agitación cada 5 min. Posteriormente, los tubos se centrifugaron durante 5 min a 12,000 x g, con micropipetas se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se agregaron 1.2 volumen de isopropanol al 100 %, se agitó por inmersión y se llevaron a centrifugar durante 10 min a 12,000 x g, se descartó el sobrenadante y se hizo un lavado con etanol al 70 %, los tubos con el ADN precipitado se centrifugaron durante 10 min a 12,000 x g y al final se decantó el etanol, los tubos se colocaron invertidos sobre papel absorbente hasta que el pellet se secó, finalmente a cada tubo se le adicionaron 50 µL de TE y se mantuvieron a -20 durante 24 h. La concentración de ADN se determinó en un espectrofotómetro a 260 nm en un Nanodrop V3.5.2 (Coleman Technologies Inc. For Nanodrop Technologies). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µL, se usaron iniciadores NL4-ITS5SHP, ITS4-ITS5HP, ITS1-NL4, ITS1-ITS4B para amplificar la región (Toju et al., 2012; Hudagula et al., 2022), iniciadores NMSI-NMS2 para amplificar la subunidad pequeña del ribosoma y los iniciadores EF1-EF2 (Raja et al., 2017; ^{Deng et al., 2022}) para amplificar el gen TEF. Las condiciones de PCR para la región ITS y subunidad pequeña del ribosoma fueron las siguientes: un primer ciclo de pre-desnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 1 min, alineamiento a 58 °C durante 45 segundos y extensión a 72 °C durante 1 min y finalmente con una extensión a 72 °C durante 10 min. Las condiciones de PCR para TEF fueron: un primer ciclo de pre-desnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 min, alineamiento a 55 °C durante 45 s y extensión a 72 °C durante 1.5 min y finalmente con una extensión a 72 °C durante 10 min. El producto de amplificación por PCR se visualizó en electroforesis, se preparó un gel de agarosa al 1.2 % con buffer TAE 1x, corrido a 100 volts durante 1h. Para el revelado de bandas, el gel se tiñó con bromuro de etidio durante 15 min, después se visualizó con software Qwanty One (BioRad). El tamaño de las bandas se estimó tomando como referencia los marcadores de peso molecular 1 kb (Invitrogen) que fueron colocadas en los extremos. Los productos amplificados se conservaron a 4 °C para su análisis. Los fragmentos amplificados y purificados se enviaron a Macrogen para la secuenciación. Las secuencias en formato FASTA se compararon con la base de datos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), con lo cual se corroboró la identidad de los hongos, después se hizo el registro en la base datos del GenBank. El número de registro para cada hongo es: F. oxysporum (PP729638.1), R. solani (PP713022.1) y P. capsici (PP922286.1).

Evaluación in vitro. Se preparó medio PDA mezclado con hidrolato en cuatro concentraciones (100, 75, 50 y 25 % v/v) por cada especie, las concentraciones del hidrolato se prepararon mediante diluciones con agua bidestilada y se obtuvieron 16 tratamientos de hidrolato y el testigo con PDA. Como testigos de referencia se usaron fungicidas comerciales de la Distribuidora Técnica Industrial, S. A. de C.V. y Syngenta Agro, S.A de C.V. distribuidos en Artículos Entomológicos S. A. de C. V. Texcoco. Promyl (Benomilo: Metil 1-(butilcarbamoil) bencimidazol-2-ilcarbamato) se usó para Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum (^{Vega-López y Granados-Montero, 2023}) y Ridomil Gold (N-(metoxiacetil)-N(2,6-xilil)-D-alaninato de metilo) para Phytophthora capsici (Pons-Hernández et al., 2020). De cada fungicida se usó 1.5 g L^-1. Después de preparar el medio de cultivo, en el centro de cada caja Petri que contenía el medio de cultivo combinado con hidrolato se colocó un disco (3.5 mm) con micelio de cada hongo (colonias de 10 días de edad) y después se incubaron en condiciones de oscuridad con las siguientes temperaturas: B. cinerea a 20 °C, P. capsici a 27 °C, F. oxysporum y R. solani a 30 °C. Cada 24 h se midió el crecimiento radial con un vernier digital.

Evaluación in vivo. Solo los tratamientos que tuvieron el mayor efecto de inhibición en condiciones in vitro se retomaron para su evaluación in vivo. La evaluación se hizo en un invernadero y se usaron plantas de fresa var. “FESTIVAL” provenientes de Zamora, Michoacán de cinco meses de edad en fase de floración mantenidas en maceta con tezontle rojo; la fertilización se hizo con solución Steiner al 100 % con riegos semanales y con aplicación semanal de fertilizante foliar PEKA^® (1 mL L^-1) (Producto elaborado por Química Sagal y distribuido en Agroquímicos Texcoco S.A. de C. V.). Cuando las plantas estaban en fructificación, se seleccionaron cuatro frutos maduros a los que se les hizo solo una perforación de 0.2 cm de profundidad con aguja de disección esterilizada con alcohol y a cada planta se le asperjaron 20 mL de hidrolato con atomizador, 24 h después de la aplicación de hidrolatos se inocularon las plantas con una suspensión de esporas 1 x 10⁶ de F. oxysporum y B. cinerea preparada con agua bidestilada y 1 mL L^-1 de Tween 20, la aplicación de las esporas se hizo con atomizador, P. capsici y R. solani se inocularon mediante micelio. Las plantas inoculadas se cubrieron con una bolsa de polietileno durante 48 h para mantener la humedad, posteriormente, las hojas, frutos maduros, frutos inmaduros y flores fueron monitoreadas cada 24 h hasta las 72 h para la detección de síntomas causados por los patógenos (B. cinerea, F. oxysporum, P. capsici y R. solani).

Diseño experimental y análisis de datos. El experimento in vitro se analizó bajo un Diseño Completamente al Azar (DCA) con cinco repeticiones cada uno, una caja Petri fue una unidad experimental. Con los datos del crecimiento radial se calculó el porcentaje de inhibición (^{Kagezi et al., 2015}). El experimento in vivo se hizo con un DCA, se usaron cuatro macetas por tratamiento, una maceta fue considerada una unidad experimental, con los datos registrados sobre los frutos y flores enfermos y no enfermos se estimó la incidencia de la enfermedad (^{Macías et al., 2016}). Los datos se sometieron a un análisis de varianza y pruebas de medias de Tukey (p ≤ 0.05) en Software académico SAS.

Resultados y Discusión

Compuestos químicos. En el hidrolato de T. parryi se identificaron 14 compuestos, en T. minuta 13, en T. coronopifolia 11 y un total de 9 en T. terniflora (Figura 1). En el hidrolato de T. parryi, los compuestos mayoritarios fueron el 3-Hexen-1-ol (25.5 %), isopiperitanona (14.9 %), 1,3-Di-terc-butilbenceno (6.1 %) y α-terpineol (5.9 %) (Cuadro 1). Al realizar una comparación con compuestos encontrados en aceite esencial de la misma especie, ^{Díaz-Cedillo y Serrato-Cruz (2011}) identificaron siete compuestos principales: canfeno, 3, 6, 6-trimetil2-norpinanol, anisol, 4-isopropil-1-metil-2-ciclohexenol, cineol, eugenol y α-terpineol y ^{González-Velasco et al. (2022}) registraron 21 compuestos, entre ellos, verbenona, dihidrotagetona, tagetona, eugenol y α-terpineol, la mayoría de estos compuestos son monoterpenos y sesquiterpenos. En el hidrolato de T. parryi únicamente el α-terpineol y la dihidrotagetona fueron similares a lo reportado en aceite esencial, por lo que gran parte de los compuestos resultaron diferentes de lo consignado para el aceite esencial. En el hidrolato de T. coronopifolia se encontró dihidrotagetona (53.9 %), cis-tagetona (11.9 %), (Z)-tagetenona (9.7 %) y trans-tagetona (5.9 %) (Cuadro 1); ningún compuesto encontrado en la muestra de hidrolato coincidió con lo reportado para el aceite esencial por Díaz-Cedillo et al. (2013): (1S) -6,6-dimetil-2-metilenbiciclo [3.1.1] heptan-3-ona, verbenona, 2-oxo-decanoato de metilo y crisantenona. En hidrolato de T. terniflora la dihidrotagetona (45 %), eucaliptol (13.2 %), trans-3-Hexen-1-ol (10.8 %) y cis-tagetona (4.5 %) (Cuadro 1) fueron los mayoritarios. Solo el compuesto cis-tagetona fue común en el aceite esencial e hidrolato analizado (^{Lizarraga et al., 2017}).

Figura 1 Cromatogramas de hidrolatos de Tagetes parryi (Tp), T. terniflora (Tt), T. coronopifolia, (Tc) y T. minuta (Tm), donde se observan los picos de los compuestos identificados. 

En el hidrolato de T. minuta el compuesto mayoritario fue el 3-Hexen-1-ol (16.4 %), benceno, 1,3-bis(1,1-dimetiletil)(14.6 %), cis-tagetona (10.1 %) y dihidrotagetona (5.6 %) (Cuadro 1). Solo la dihidrotagetona fue común con lo que reportan ^{Karimian et al. (2014}) para esta especie cuyo aceite esencial contiene compuestos como: dihidrotagetona, E-ocimeno, tagetona, cis-β-ocimeno, Z-ocimeno, limoneno y epoxiocimeno. Los compuestos 3-Hexen-1-ol, (E)-, dihidrotagetona y cis-tagetona fueron comunes en los hidrolatos de las especies de Tagetes en estudio (Cuadro 1), mientras que, al comparar la composición química de los hidrolatos con la de aceites esenciales, estos no coinciden en compuestos ni en abundancia, por lo que la composición química de hidrolatos y aceites esenciales siempre es diferente, cuantitativa y cualitativamente (^{D’Amato et al., 2018}). En otros estudios se ha encontrado que tanto en hidrolatos como en los aceites esenciales los monoterpenos y los monoterpenos oxigenados son abundantes, pero no se encuentran los mismos compuestos (^{Vuko et al., 2021}). ^{Inouye et al. (2008}) compararon 43 hidrolatos con aceites esenciales obtenidos de mismo proceso de destilación al vapor y encontraron que 18 de los 43 hidrolatos analizados mostraron un componente mayoritario diferente al del aceite. Los aceites esenciales de Tagetes son ricos en monoterpenos, además de cantidades bajas de sesquiterpenos y compuestos oxigenados (Salehi et al., 2018). En este estudio, los compuestos mayoritarios en las cuatro especies pertenecen a monoterpenos y en menor cantidad a sesquiterpenos, compuestos fenólicos y algunos alcoholes (Cuadro 1). Aunque ya se tenía información sobre la composición de hidrolatos de dos especies de América del Sur (Rajeswara et al., 2006; ^{Lima et al., 2009}), la identificación de los compuestos en hidrolatos de las cuatro especies de Tagetes de México constituyen otro antecedente importante para avanzar en el conocimiento fitoquímico del género.

Evaluación in vitro. Los tratamientos evaluados mostraron efectos inhibitorios significativos sobre B. cinerea (p < 0.0001), F. oxysporum (p < 0.0053), P. capsici (p < 0.0001) y R. solani (p < 0.0001) (Cuadro 2). El hidrolato al 100 % de T. parryi inhibió el crecimiento micelial de B. cinerea en 71.3 %, sin diferencia estadística respecto al efecto producido por el fungicida comercial, incluso, diluciones de este hidrolato en 50 y 75 % mostraron diferencias estadísticas con el testigo; mientras que, con hidrolato al 100 % o diluido de las otras especies de Tagetes, la inhibición del micelio fue menor a 40 %, en la mayoría, sin diferencia estadística respecto del testigo (Cuadro 2). En P. capsici, el hidrolato de T. coronopifolia al 75 y al 100 % fue efectivo para inhibir totalmente el crecimiento micelial, al igual que el fungicida; con hidrolatos de T. minuta, T. parryi y T. terniflora en diluciones de 50 y 75 % la inhibición de P. capsici fue significativa (p < 0.0001) con respecto al testigo, pero no respecto al fungicida. Ninguna concentración de los hidrolatos evaluados mostró un efecto fungistático contra F. oxysporum y R. solani. Los hidrolatos de T. minuta, T. parryi y T. terniflora inhibieron estos hongos en 26.6 %, en el caso de T. coronopifolia al 100 %, se inhibió a F. oxysporum y R. solani en 25 y 34.4 %, respectivamente (Cuadro 2). El efecto inhibitorio de los aceites esenciales e hidrolatos es debido a los monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos (^{Hu et al., 2019}; ^{Hill, 2022}). Los monoterpenos son pequeños y pasan entre las moléculas grasas que forman la membrana celular y afectan funciones dentro de la célula, mientras que los sesquiterpenos no son tan pequeños para pasar por la membrana celular, pero tienen formas únicas que les permiten adherirse a los espacios

de estructuras proteínicas tridimensionales y afectan la actividad proteínica (^{Hill, 2022}). ^{Hu et al. (2019}) mencionan que los compuestos fenólicos pueden interferir con las membranas, las paredes celulares y la acción de las enzimas. En el hidrolato de T. parryi se encontró una mayor diversidad de grupos de compuestos, entre estos se encontró el compuesto fenólico 1,3-Di-terc-butilbenceno (Cuadro 1). Al respecto, ^{Zatla et al. (2017}) mencionan que los compuestos fenólicos de Daucus carota subsp. sativus tienen actividad antifúngica contra B. cinerea. ^{Belabbés et al. (2017}) atribuyen el efecto antifúngico contra Penicillium expansum a los sesquiterpenos oxigenados encontrados en el hidrolato de Calendula arvensis. En T. parryi, T. coronopifolia y en T. minuta se encontró el sesquiterpeno 11-tetradecadianoato de metilo con una abundancia relativa entre 1.6 y 2.5 % (Cuadro 1) y el efecto inhibitorio de estos hidrolatos fue mayor (Cuadro 2) a lo observado con T. terniflora, que no contenía este compuesto. También, los aceites con abundancia de monoterpenos inhiben el crecimiento de hongos (Stević et al., 2014), lo que permite resaltar que los hidrolatos de Tagetes analizados tienen abundantes monoterpenos (Cuadro 1). Aunque el efecto antifúngico se atribuye a los compuestos mayoritarios, es el efecto sinérgico de todos los compuestos los que causan los efectos antifúngicos y también algunos compuestos son más activos que otros (^{Dhifi et al., 2016}).

Evaluación in vivo. Los tratamientos con hidrolatos al 100 % de las cuatro especies de Tagetes mostraron la mayor inhibición in vitro (Cuadro 2), por ello, se retomaron para su evaluación in vivo. Las plantas de fresa no mostraron efecto fitotóxico debido a la aplicación de los hidrolatos de Tagetes, lo cual da buena expectativa para futuras evaluaciones en otras especies vegetales. Las plantas testigo inoculadas con B. cinerea presentaron síntomas de la enfermedad, tanto en frutos como en flores. Por otro lado, las plantas inoculadas con F. oxysporum, P. capsici y R. solani no mostraron síntomas de enfermedad en las flores, pero sí en el fruto perforado (Figura 2). Los frutos de fresa son muy perecederos, además, si el fruto presenta algún daño mecánico o lesión facilita la infección por patógenos (^{Ángel-García et al., 2018}); la falta de incidencia de la enfermedad en flores posiblemente esté relacionada con la ausencia de lesión y porque estos hongos afectan principalmente las raíces, la corona y frutos (^{Koike y Gordon, 2015}; ^{Awad, 2016}; ^{Barboza et al., 2016}). El hidrolato de T. parryi fue efectivo como tratamiento preventivo contra B. cinerea, debido a que los frutos perforados (Figura 2A) y las flores (Figura 2B) no presentaron incidencia del hongo, por tal motivo, este hidrolato, representa un insumo alternativo a los fungicidas químicos que tienen efectos negativos en el ambiente y han inducido resistencia en este hongo (Leroux, 2004). ^{Zatla et al. (2017}) evaluaron el efecto del hidrolato de Daucus carota subsp. sativus en frutos de fresa y este fue efectivo como tratamiento preventivo al inhibir totalmente a B. cinerea hasta el quinto día, estos autores atribuyen el efecto a la abundancia de compuestos fenólicos. Por ello, el efecto observado con el hidrolato de T. parryi también puede atribuirse al compuesto fenólico 1,3-Di-terc-butilbenceno en conjunto con los otros monoterpenos mayoritarios y sesquiterpenos encontrados en el hidrolato (Cuadro 1). Por otra parte, con la aplicación del hidrolato de T. terniflora en los frutos (Figura 2A) no se observaron síntomas de la enfermedad, pero las flores sí se infectaron y con el hidrolato de T. minuta se observó un efecto contrario, las flores no se infectaron y los frutos sí fueron infectados por el hongo (Figura 2B); con este resultado se contempla que una aplicación conjunta de estos hidrolatos podría ser efectiva contra este hongo. El hidrolato de T. coronopifolia no funcionó como tratamiento preventivo.

Figura 2 Incidencia de B. cinerea, R. solani, F. oxysporum y P. capsici en frutos (A) y flores (B) de fresa a los tres días posteriores a su inoculación en plantas testigo (TO) y sometidas a tratamientos con hidrolatos al 100 % de Tagetes coronopifolia (H100C), T. minuta (H100M), T. parryi (H100P) y T. terniflora (H100T). 

Conclusiones

Los hidrolatos de las especies de Tagetes ensayadas contienen entre 46 y 72 % de monoterpenos y en menor cantidad algunos alcoholes (0-33 %), sesquiterpenos (0-27 %) y compuestos fenólicos (0-8 %). Aunque en la evaluación in vitro se observó efecto fungistático con algunos hidrolatos, este efecto no se mantuvo en la aplicación in vivo, solo la aplicación del hidrolato de T. parryi es efectivo como tratamiento preventivo contra B. cinerea en plantas de fresa en floración y fructificación.