Introducción

En México, se produjeron en los últimos cinco años aproximadamente 1,000 millones de plantas forestales, éstas incluyeron especies de clima árido, templado y tropical y, de esta producción, el estado de Yucatán produjo aproximadamente 10 millones para diversas acciones de reforestación o restauración. Las principales especies producidas fueron: C. odorata, S. macrophylla, Tabebuia rosea, Brosimun alicastrum, Cordia dodecandra, principalmente (SNIGF, 2021). Entre los factores limitantes en el proceso de producción, se encuentran las enfermedades de pudri- ciones en tallo y raíz, causadas por Fusarium spp. (^{Kisekka, 2022}). De acuerdo con la información proporcionada por los viveristas, las pérdidas de producción oscilan entre el 30 y 50 %.

El género Fusarium cuenta con aproximadamente 1,779 especies, con distri- bución cosmopolita (^{Sun et al., 2023}). Son ubicuos en la naturaleza, ya que pue- den tolerar cualquier condición ambiental. Se les puede encontrar en el aire, agua, suelo, plantas y restos vegetales. Una gran cantidad de sus especies son patógenas de plantas, productoras de micotoxinas y, las cuales inducen una amplia gama de enfermedades que afectan a varios cultivos. Los síntomas que ocasiona incluyen: pudrición de raíz y tallo, cancros, marchitez vascular, pudrición de frutos y semi- llas, principalmente (^{Ekwomadu y Mwanza, 2023}).

En viveros de regiones templadas, caracterizados por su clima húmedo o subhú- medo con temperaturas promedio entre 12 y 18 °C y precipitación promedio anual entre 600 y 1500 mm (GeoEnciclopedia, 2022), su vegetación la constituyen bos- ques de pinos, de encinos y de pinos-encinos (^{Galicia et al., 2018}); Al respecto, F. circinatum en plantas de pinos, es el causante de la principal enfermedad conocida como “secadera”; esta enfermedad se caracteriza por la pudrición de raíces, lo que disminuye la calidad de la planta, con pérdidas de producción de hasta un 40 % (^{García-Díaz et al., 2017}). En regiones tropicales, donde la temperatura es mayor a 18 °C y la precipitación anual oscila entre 800 y 4000 mm (GeoEnciclopedia, 2022) y su vegetación está compuesto por diversas especies de tipo perennifolias, subperennifolias, caducifolias y subcaducifolias (Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, 2017), se identificó a Fusarium sp. como responsable de las pudriciones de tallo en Eucalyptus pellita (^{Arsensi y Mardji, 2021}) y a F. sola- ni como agente causal de pudriciones de raíces en Tectona grandis (^{Kiran et al., 2021}).

En México, es escasa la información referente al diagnóstico y etiología de los agentes causales de enfermedades fúngicas observadas en viveros forestales tropi- cales; así como, de los métodos empleados para su control. En la actualidad, el con- trol de estas enfermedades en plantas forestales que progresan en viveros es a base de fungicidas sintéticos, debido a su rápida respuesta para controlar al fitopatógeno y a su fácil aplicación (^{Kisekka, 2022}). Aunque en ocasiones, las aplicaciones se realizan sin éxito, ya que no se realizan estudios previos de sensibilidad in vitro e in vivo a los fungicidas locales disponibles.

En la producción de plantas en los viveros, la buena sanidad es la base de todo proyecto de producción o de reforestación, ya que al establecer en campo plantas enfermas, éstas tienen menores probabilidades de sobrevivir y además, se convier- ten en fuentes de inóculos para plantas sanas. Por lo tanto, para establecer un mé- todo de control para resolver los problemas fitosanitarios que afectan a las plantas que se producen en vivero, es indispensable conocer los agentes causales y, este conocimiento permite diseñar estrategias de control eficientes y la aplicación de productos específicos para su manejo, y con ello también disminuir la contamina- ción ambiental. Debido a esto, el objetivo del trabajo fue identificar el agente causal asociado con la pudrición y necrosis de tallo y raíz de C. odorata y S. macrophylla y su sensibilidad in vitro a fungicidas convencionales.

Materiales y Métodos

Colecta de las muestras. Durante el año 2023 en el vivero México Primero locali- zado a 88° 58´48.15¨ W y 19° 59´10.56¨ N, en el municipio de Tzucacab, Yucatán se colectaron plantas de C. odorata y S. macrophylla de tres y seis semanas poste- riores a la germinación, respectivamente y que mostraban síntomas de necrosis y pudrición de la base de tallo y raíz (Figura 1). Las muestras se guardaron en bolsas de papel estraza para después colocarlas dentro bolsas de plástico, se etiquetaron y se trasladaron al Laboratorio de Fitopatología del Tecnológico Nacional de México, Campus Conkal, para el aislamiento e identificación del (los) agente (s) causal (es).

Aislamientos a partir de síntomas. Los tallos y las raíces de las plantas con sín- tomas de necrosis y pudrición se lavaron con agua de la llave para eliminar los residuos del sustrato. Del tejido dañado se realizaron cortes de aproximadamente 0.5 a 1 cm². Para eliminar contaminantes externos, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 2 % de producto comercial durante 2 minutos. Posteriormente, se en- juagaron tres veces con agua destilada estéril por dos minutos en cada enjuague y se secaron con papel absorbente estéril; por último, se colocaron cinco fragmentos de aproximadamente 0.5 a 1 cm² en cajas Petri con medio de cultivo a base de Papa

Figura 1 Plantas con síntomas de necrosis y pudrición en tallo y raíz. A, B y C) Plantas de Cedrela odorata. D, E y F) Plantas de Swietenia macrophylla. 

Dextrosa Agar (PDA) y se incubaron a 28±2 °C. A las 48 h, se observó desarrollo de micelio y se reaislaron en cajas Petri con medio de cultivo PDA. Los crecimien- tos miceliales reaislados se purificaron mediante puntas de hifa en crecimiento y posteriormente a partir de esporas se realizaron cultivos monospóricos (Ríos-Her- nández et al., 2021), de los cuales, se obtuvieron tres aislados de C. odorata y dos aislados de S. macrophylla.

Identificación morfológica. Para la identificación morfológica de los aislados fún- gicos a nivel de género, se tomaron con una aguja de disección estéril, muestras de micelio de aproximadamente 5 mm de diámetro, se depositaron en cajas Petri con medio PDA y se incubaron a 28±2 °C, se monitorearon hasta que presentaron las estructuras de reproducción y con ello se consideraron las características de los crecimientos como: tipo de micelio, color de los aislados, tipo y forma de esporas y cuerpos fructíferos (^{Barnett y Hunter 1998}; ^{Leslie et al., 2006}). Se realizaron preparaciones semipermanentes y se observaron las características morfológicas en un microscopio (Axiostar Plus, Carl Zeiss), provisto con reglilla de medición ocular, previamente calibrada para cada objetivo según el caso, y se midió la longitud y el ancho (n=100) de macroconidios y microconidios.

Identificación molecular. Considerando que los cinco aislados presentaron carac- terísticas morfológicas similares, se eligió aleatoriamente un aislado de cada hospe- dante para la identificación molecular y consistió en la extracción de ADN de cada hongo mediante el Kit DNeasy (QUIAGEN). A partir del ADN extraído se amplificó el espaciador transcrito interno (ITS) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los oligonucleótidos universales ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATT- GATATGC-3’) e ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) (^{White et al.,1990}) y el factor de elongación-1α con los oligonucleótidos EF-1 (5′-ATGGGTA- AGGARGACAAGAC-3′) y EF-2 (5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′) (^{Ríos-Hernández et al., 2021}), con las siguientes condiciones de amplificación: Desna- turalización inicial por 30 s a 94 °C, seguido de 38 ciclos (desnaturalización por 30 s a 90 °C, alineación por 45 s a 58 °C y extensión por 1 min a 72 °C) y con extensión final por 5 min a 72 °C (^{Uc-Várguez et al., 2018}), la amplificación se realizó en un termociclador AB (Applied Biosystems) y los productos amplificados fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Los productos de PCR se enviaron a purificar y secuenciar a Macrogen Genome Center ubicado en Seoul, República de Korea. Las secuencias resultantes fueron editadas con el Software BioEdit (versión, 7.7.1. disponible en internet) y posteriormente fueron comparadas con secuencias reportadas en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2024), usando la herramienta BLAST, dispo- nible en internet.

Concentración Mínima Inhibitoria de Germinación de Esporas y Concentra- ción Mínima Letal. Para estimar la actividad antifúngica de seis ingredientes acti- vos de fungicidas convencionales (Cuadro 1) sobre los aislados fúngicos de C. odo- rata y S. macrophylla, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la germinación de esporas. Mediante el método de microdilución en microplacas de poliestireno estéril de 96 pozos con medio de cultivo Papa Dextrosa al doble de su concentración (CLSI, 2017; CLSI, 2020). Se añadió a cada pozo de la microplaca 100 μL de caldo Papa Dextrosa y, a los pozos de la fila utilizados como control negativo, se agregó 100 μL de agua destilada estéril. En seguida, en cada pozo de la primera columna se incorporaron los fungicidas a evaluar, así, a los pozos de la primera columna, se le añadió 100 μL de la solución fungicida correspondiente, se mezclaron y se tomó 100 μL de la mezcla de cada pozo y se transfirieron en los pozos de la segunda columna y, así continuamente, de modo que la concentración

de la solución fungicida quedó al 50 % desde el primer pozo. Al finalizar las di- luciones, se adicionaron a cada pozo 100 μL con esporas del hongo previamente contabilizadas en una cámara de Neubauer a una concentración ajustada de 1 x 10⁵ esporas mL^-1; así mismo, a los pozos de la fila utilizados como control positivo es- tuvieron provistos de caldo papa dextrosa y esporas del hongo en las concentracio- nes descritas, de esta manera cada pozo tuvo un volumen de 200 μL y, por último, el contenido de cada pozo se mezcló (^{Harčárová et al., 2021}; ^{Ríos-Hernández et al., 2021}). Las microplacas se incubaron a 29 °C; el ensayo se estableció en un diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones, con la información que se obtuvo se realizaron análisis de varianza previa transformación de datos con la instrucción en el paquete estadístico de SAS ver. 9.4 (y=arsin(sqrt(y/100)), las comparaciones de medias se realizaron por el método de Tukey (p≤0.05). Se evaluó la inhibición y la germinación de esporas del hongo a las 24, 48 y 72 horas me- diante el uso de rezasurina (^{Sharma et al., 2016}; ^{Balouri et al., 2016}; ^{Kumar et al., 2016}; Ríos-Hernández et al., 2021) como indicador de oxidación-reducción para verificar la viabilidad de las esporas por un cambio de tinción azul (no fluorescen- te) a rosa-rojo (fluorescente) como resultado de la reducción química del medio de cultivo por el crecimiento celular del microorganismo (^{Elshikh et al., 2016}; ^{Caso et al., 2021}). Después de dos horas de incubación se determinó la CMI de cada fungicida, el cual, consistió en la concentración más baja del fungicida que evitó el crecimiento micelial del hongo (^{Kowalska-Krochmal y Dudek-Wicher, 2021}). Posteriormente se calculó la Concentración Mínima Letal (CML), definido como la concentración más baja del fungicida en la que no existe crecimiento del hongo 24 h después de un subcultivo en medio libre de fungicida (^{Perczak et al., 2019}; Harčárová et al., 2021; Ríos-Hernández et al., 2021); la CML se determinó por triplicado en medio de cultivo PDA, para ello se utilizó 5 μL del contenido fúngico que se inhibió a partir de la CMI y cuatro concentraciones mayores a la CMI y se incubaron a 29 °C; a las 24 horas se observó la presencia o ausencia de crecimiento fúngico, después de este periodo, cuando se observó crecimiento fúngico se con- sideró al producto con actividad fungistático y la ausencia de crecimiento como actividad fungicida (Ríos-Hernández et al., 2021).

Resultados y Discusión

Identificación morfológica. Las características morfológicas de los cinco aislados provenientes de necrosis, pudrición de tallo y de raíz de C. odorata y S. macrophy- lla (Figura 2), mostraron micelio septado y liso en los primeros cuatro y cinco días de crecimiento y se volvió algodonoso de tonalidades blanco a crema pálido a partir de los 8 días. En monofiálides largas se produjeron abundantes microconidios hia- linos, ovalados y fusiformes generalmente de cero a un septo de 8-25 μm de largo

Figura 2 A y D) Vista de Fusarium solani de 14 días de desarrollo aislado de Cedrela odorata y Swietenia macrophylla, B) Micelio septado y microconidios de F. solani, C) Macroconidios (3-4 septos) y microconidios (0-1 septo) de F. solani observadas al objetivo 100X, E) Macroconidios y microconidios observadas a 40X y F) Esporodo- quios 

y de 3.5-5 μm de ancho; esporodoquios de forma irregular de color crema pálido y abundantes macroconidios hialinos, robustos poco curvados de tres a cuatro septos de 24-36 μm de largo y de 4-5 μm de ancho; se observaron clamidosporas simples y dobles de forma globosa y pared gruesa. Las características de estos aislados co- incidieron con los descritos para Fusarium solani (^{Leslie et al., 2006}; ^{Hafizi et al., 2013}; ^{Omar et al., 2018}; ^{Kurt et al., 2020}).

Identificación molecular. Las secuencias resultantes de los fragmentos amplifi- cados de la región ITS (600 pb) de los dos aislados provenientes de C. odorata y S. macrophylla, al compararlas con secuencias registradas en la base de datos del NCBI, mostraron una similitud del 99.26 y 99.79 %, respectivamente, con secuen- cias correspondientes a F. solani y F. falciforme. Por consiguiente, el análisis de las secuencias de los fragmentos de los genes que codifican al factor de elongación- 1α (700 pb) de los mismos aislados presentaron una similitud de 99.83 y 95.73%, respectivamente, con secuencias de F. solani y F. falciforme. Considerando las características morfológicas y la estrecha similitud molecular de las secuencias analizadas, se concluye que los dos aislados procedentes de necrosis, pudrición de tallo y de raíz de C. odorata y S. macrophylla corresponden a F. solani, dado que F. falciforme es un miembro del complejo de F. solani; este grupo integra diversi- dad de genotipos causada por la variabilidad genética y plasticidad ecológica que la caracteriza (^{Sabahi et al., 2023}). Este constituye el primer reporte de F. solani, asociada con la producción de plantas de vivero en C. odorata y S. macrophylla en el sureste de México.

Determinación de la CMI y la CML de los fungicidas de síntesis química con- tra F. solani. El Procloraz inhibió la germinación de esporas y en consecuencia el crecimiento de F. solani a partir de 2.44 ppm, así como, en las concentraciones mayores a éste; al observarse una tinción azul (no fluorescente) en las esporas tra- tadas, comparado con las esporas del control positivo que cambió de tinción azul a rosa-rojo (fluorescente) lo que indicó crecimiento celular del hongo. Al determinar la CML el efecto del fungicida continuó, y en las muestras fúngicas provenien- tes de las esporas tratadas con las concentraciones del fungicida subcultivadas en medio PDA libre de fungicida, no se observó crecimiento micelial durante las 24 h de la evaluación con respecto a las muestras fúngicas del control positivo que si desarrollaron crecimiento micelial (Figura 3). Con base a estos resultados 2.44 ppm fue la CMI y la CML del Procloraz (Cuadro 2). Con lo que se evidenció que el Procloraz causó la muerte de las esporas al no ocurrir la germinación y el creci- miento micelial. Estos resultados se relacionan directamente con el modo de acción del fungicida el cual, interrumpe la biosíntesis de los esteroles (^{Medina-Osti et al., 2022}), en particular contra el ergosterol, componente esencial de la membrana plas-

Figura 3 Efecto fungicida de Procloraz y Mancozeb sobre la solución de esporas de Fusarium solani provenientes de la microdilución en placa después de dos días de evaluación. A) Distribución en cajas petri con medio PDA de cin- co CMI obtenidas de Procloraz, B y C) Sin crecimiento micelial de F. solani en las CMI de Procloraz evaluadas después de 24 y 48 h, D) Distribución en cajas petri con medio PDA de cinco CMI obtenidas de Mancozeb, E y F) Sin crecimiento micelial de F. solani en las CMI de Mancozeb evaluadas después de 24 y 48 h. 

mática que mantiene rigidez y permeabilidad de las esporas. Cuando se altera este componente puede existir una lisis de la estructura de la membrana, lo que afecta el transporte de nutrientes y la síntesis de quitina, los cuales, son esenciales para el crecimiento micelial. En F. oxysporum y Colletotrichum acutatum con la inhibición del ergosterol, observaron daños estructurales que causaron esporas encogidas y arrugadas y en consecuencia inviabilidad de los hongos (^{Kim et al., 2019}). Misma efectividad se encontraron en otros estudios, a concentraciones de 4, 40 y 400 ppm de Procloraz en el que inhibieron el crecimiento de F. graminearum, F. proliferatum y F. verticillioides causantes de la pudrición de la aurícula del maíz (Massiello et al., 2019) y, en Fusarium sp. causante de la marchitez vascular de los cítricos con 100 ppm inhibió su crecimiento micelial en un 92 % (^{Ortiz-Martínez et al., 2022}). El ensayo de la CMI para el Carbendazim fue a partir de 11.38 ppm (Cuadro 2).

Sin embargo, al evaluar el efecto del fungicida y estimar la CML se observó cre- cimiento micelial cuando se subcultivaron en medio PDA libre de fungida, lo que hace suponer, que este producto tuvo efecto fungistático y no fungicida. Resultados diferentes observaron en aislados de papaya causando pudrición de raíces, este fungicida a 150 ppm, inhibió el crecimiento micelial entre 93.5 a 95.3 % (^{Kumar et al., 2020}) y a 750 ppm inhibió el 100 % del crecimiento de F. solani causante de la marchitez vascular del tomate (^{Ayvar-Serna et al., 2021}). Con relación al Benomilo la CMI fue a partir de 14.06 ppm (Cuadro 2), la inhibición de la germinación de esporas de F. solani, no obstante, al igual que con el Carbendazim cuando se evaluó la CML, las esporas recuperaron su viabilidad, al mostrar crecimiento micelial, lo que también sugirió efecto fungistático a estas dosis. En estudios con dosis mayo- res a 250 ppm inhibió el 100% su crecimiento micelial (^{Coronel et al., 2022}). Pero en F. oxysporum responsables de la marchitez y colapso de las plantas de fresa a concentraciones desde 5 ppm inhibió el crecimiento micelial (^{Vega-López y Gra- nado-Montero, 2023}). Lo anterior, hace suponer que la efectividad del fungicida también está en función de la especie y cepa del fitopatógeno. El Carbendazim y el Benomilo son catalogados como preventivos y curativos actúan en la inhibición de las proteínas motoras y del citoesqueleto, específicamente en el ensamble de la β tubulina en la mitosis, lo que afecta la división y el desplazamiento celular, así como la formación del apresorio y, en general el crecimiento micelial (Alburque- que y Gusqui, 2018; FRAC, 2024); Por otro lado, ninguna de las concentraciones evaluadas de Fosetyl-Al mostró actividad antifúngica al permitir el crecimiento del hongo, lo que confirmó la poca efectividad y selectividad de este ingrediente activo con efecto oomicida (^{Cristóbal-Alejo et al., 2013}). Aunque hay pocos casos de resistencia en algunos fitopatógenos, la frecuencia de uso puede disminuir su efectividad para el control de los hongos fitopatógenos (FRAC, 2024).

En lo que se refiere al Captan y Mancozeb, la CMI fue 7.81 ppm (Cuadro 2), a partir de ésta concentración mostraron inhibición de la germinación de esporas del hongo hasta las concentraciones mayores a éste evaluadas, ya que en estas concentraciones se determinó la inhibición de la germinación de las esporas, al no observarse cambio de tinción de la rezasurina en las microplacas con respecto a los controles positivos, en los cuales, se observó cambio de tinción de la rezasurina, sin embargo, en el ensayo para determinar el efecto del fungicida y la CML, solo con el Mancozeb a ésta misma concentración se obtuvo la CML sobre F. solani; ya que no se observó crecimiento micelial del hongo en esta concentración y los demás evaluados al subcultivar en medio PDA libre de fungida, muestras fúngicas provenientes de las microplacas con las concentraciones de fungicida (Figura 2), lo que indicó que este fungicida no solo inhibió la germinación de las esporas mien- tras estuvo en contacto con ellas sino que causó su muerte, por eso no desarrollaron micelio. Caso contrario ocurrió con el Captan, en el cual, si desarrolló crecimiento mice- lial similar al control positivo, lo que supone que solo impidió la germinación de las esporas en el tiempo que estuvieron en contacto en las microplacas. Estos resulta- dos podrían indicar que a pesar que ambos fungicidas son de contacto y su forma de acción es multisitio, entre los cuales afectan la germinación de las esporas (FRAC, 2024), también podrían influir la concentración y el tiempo de la exposición del hongo al fungicida, por lo que las 48 h en las que se mantuvieron las esporas en contacto con las cantidades de captan, fueron insuficientes para penetrar sus célu- las. En evaluaciones recientes mostraron su eficacia contra especies de Fusarium, así, al evaluarlos contra F. incarnatum hongo asociado a daños en semilla de pasto, el Captan y el Mancozeb a concentraciones de 200 y 300 ppm inhibieron su creci- miento micelial en 97.8 y 93%, respectivamente (Zárate-Ramos et al., 2021). En contra de F. falciforme recientemente identificado como patógeno de raíz y tallo de guanábana a concentraciones de 12,500 y 10,000 ppm inhibieron del 95 al 100% el crecimiento del hongo (^{Cambero-Ayón et al., 2023}). Además, el Captan interfiere con el mecanismo de la respiración del hongo lo que dificulta la germinación y el desarrollo micelial y, el Mancozeb actúa en la modificación e inactivación de las proteínas sensibles a redox como las de la transcripción, traducción y estrés oxida- tivo del ADN (Zárate-Ramos et al., 2021).

Finalmente, solo el Procloraz y el Mancozeb mostraron efecto fungicida al no observarse crecimiento micelial de F. solani durante el ensayo para determinar la CML después de 24 y 48 h de subcultivado en medio PDA libre de los fungicidas, lo que confirmó la muerte de las esporas. Mientras que para el caso del Carben- dazim, Benomilo y Captan presentaron un efecto fungistático, ya que durante la prueba para determinar la CML, hubo crecimiento micelial después de 24 y 48 h de exponer al hongo en medio de cultivo PDA en ausencia de fungicida, lo que eviden- ció que estos fungicidas no mataron a las esporas y solo inhibieron su germinación mientras estuvieron en contacto con ellas, pero al sacarlas de este medio con los fungicidas, recuperaron la viabilidad y continuaron con su crecimiento (Cuadro 2 y Figura 3).

Conclusiones

Las características morfotaxonómicas y el análisis de las secuencias molecula- res de los aislados provenientes de necrosis y pudriciones de tallo y de raíz de C. odorata y S. macrophylla correspondieron a F. solani, por lo que se asoció a esta especie como el probable factor biótico, responsable del 30 al 50 % de las pérdidas de producción de plantas estimado por viveristas en el sureste de México. El Procloraz y el Mancozeb mostraron in vitro mejor efecto antifúngico contra F. solani, con promedios de CMI y CML de 2.44 y 7.81 ppm, respectivamente.