Introducción

Diferentes cactus se han cultivado e introducido en algunas partes del mundo como ornamentales y comestibles. Los cactus son susceptibles a las infecciones por fitoplasmas y desarrollan enfermedades con síntomas caracterizados por un crecimiento en forma de escoba de bruja y patrones de mosaico verde en la epidermis (^{Cai et al., 2008}). El movimiento global de bulbos, esquejes y semillas de plantas de ornato y consumo humano ha permitido la introducción de nuevos patógenos a diversos nichos ecológicos (^{Miedaner y Garbelotto, 2024}). Cuando la flora nativa es susceptible a un patógeno introducido puede dar lugar a una rápida declinación lo que puede ocasionar su extinción (Miedaner y Garbelotto, 2024). En los últimos años se han observado con mayor frecuencia plantas ornamentales con síntomas de fitoplasmas, patógenos con amplia plasticidad genética que les permite alojarse e infectar a cualquier tipo de planta, un ejemplo es ‘Candidatus Phytoplasma asteris’, el cual se ha encontrado en más de 80 especies monocotiledóneas y dicotiledóneas en diferentes partes del mundo (^{Lee et al., 2009}). Los fitoplasmas son parásitos obligados de plantas e insectos y en la mayoría de los casos necesitan de ambos hospedantes para dispersarse en la naturaleza (Whitcomb y Tully, 1989), estas bacterias se caracterizan por tener un genoma pequeño, como consecuencia de esto, una limitada capacidad metabólica, por lo que forzosamente requieren de un insecto vector y una planta hospedante para reproducirse. Los fitoplasmas son patógenos que han colonizado ambos reinos: animal y vegetal, y los síntomas que inducen interfieren en el desarrollo de la planta ya que causan proliferación, virescencia y filodia, principalmente (^{Bertaccini, 2015}).

Considerando la importancia de generar conocimiento científico de los patóge-

nos emergentes con potencial de ser diseminados de manera fácil y eficiente por insectos vectores a cultivos de interés económico, es necesario conocer los diferentes grupos de fitoplasmas que pueden estar presentes en los cactus ornamentales que, por sus características fenotípicas se comercializan ampliamente en el centro de México, convirtiéndose en fuente de inóculo. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue detectar e identificar al fitoplasma asociado a engrosamiento y proliferación de cladodios en un cactus ornamental.

Detección de fitoplasmas. Se obtuvieron cuatro muestras de nopal con sínto ma de ‘escoba de bruja’ provenientes de cuatro viveros de Texcoco, Estado de México (Figura 1B-C). La extracción de ADN se realizó con el método CTAB 2 %, y la amplificación del ADNr (100 ng µL-1) se realizó con iniciadores universales para fitoplasmas, P1 (5´-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3´) y P7 (5´-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3´) (^{Deng y Hiruki, 1991}; ^{Schneider et al., 1995}) que amplifican 1.8 kb, seguido de una segunda PCR (reacción anidada) con el par R16F2n (5´-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3´) y R16R2(5´TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3´)

Figura 1 A) Amplificaciones de ADNr 16S de fitoplasmas obtenidos con los iniciadores R16F2n/R16R2. Carril M; Marcador molecular 100 pb, carril +; ADN proveniente de Dimorphotheca sinuata infectada con “Candidatus Phytoplasma asteris” (16SrI-B), carril -; Control negativo, PCR sin templete, carril 1-4; muestras de nopal (Opuntia sp.) con síntoma de ‘escoba de bruja’, proveniente de viveros ubicados en Texcoco, Estado De México; B-C) Síntomas de “escoba de bruja” en nopal ornamental. 

(^{Gundersen y Lee, 1996}) que amplifican 1.2 kb. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Techne® TC-300, con un protocolo de amplificación descrito previamente por ^{Ortega-Acosta et al. (2019}). Como control positivo se utilizó ADN de Dimorphotheca sinuata infectada con ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ (16SrI-B). De la PCR anidada se cargaron 5 µL de producto amplificado y se observaron en un gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de etidio y se visualizó en un transiluminador UV.

Análisis de RFLP. Aproximadamente 500 ng de cada uno de los productos obtenidos de la segunda PCR con los iniciadores R16F2n/R16R2 se sometieron a un análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) utilizando las siguientes enzimas de restricción; RsaI, MseI (Tru 91), KpnI, EcoRI (Promega, USA) y HaeIII (Sigma-Aldrich, USA) a 37 °C durante 4 h. Para este análisis solo se consideraron las enzimas claves que se utilizan para identificar grupos de fitoplasmas. El número y tamaño de los fragmentos resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa 3 %. Los patrones de restricción obtenidos se compararon con los publicados previamente (^{Lee et al., 1998}) y con los obtenidos en la herramienta iPhyClassifier de una cepa de referencia del subgrupo 16SrII-C (^{Zhao et al., 2009}).

Secuenciación y análisis filogenético. Los productos obtenidos de PCR anidada se purificaron, y se secuenciaron en ambas direcciones (Macrogen Inc. Corea) y posteriormente se generó un árbol filogenético con el método neighbor-joining en MEGA X (^{Kumar et al., 2018}) utilizando secuencias de diferentes grupos y subgrupos de fitoplasmas. En este caso, Acheloplasma laidlawii se utilizó como grupo externo.

Los resultados obtenidos indicaron la presencia de fitoplasmas en las cuatro muestras de cactus ornamentales con síntomas de ‘escoba de bruja’ (Figura 1A). La secuencia consenso obtenida en este estudio se depositó en el Banco de Genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information) con el número de acceso 0N413680.1. El análisis BLAST de la secuencia, indicó 100 % de similitud con secuencias de cactus witches’ broom phytoplasma (grupo 16SrII, subgrupo C) (números de acceso MH644006-MH644007). El análisis de patrones electroforéticos con enzimas de restricción confirmó que el fitoplasma en estudio es miembro del subgrupo 16SrII-C (Figura 2B). Por otro lado, el perfil electroforético in silico de la cepa de referencia AJ293216.2 del subgrupo 16SrII-C (Figura 2C) que considera 17 enzimas de restricción, estuvo en concordancia con el resultado de RFLP obtenido con la digestión hecha en el laboratorio con las cinco enzimas clave que dan certeza del grupo al que pertenece determinado fitoplasma. El análisis filogenético ubicó al fitoplasma en estudio (0N413680), en el subgrupo 16Sr II-C (Figura 3).

Los fitoplasmas requieren para su reproducción a diversos hospedantes, ya sean vegetales o insectos. Algunos insectos reportados como vectores de fitoplasmas son: Macrosteles quadrilineatus, Haplaxius crudus, Dictyophara europaea, Euscelidius variegatus y Hyalesthes obsoletus, entre otros (^{Alma et al., 2019}). En plantas

Figura 2 Análisis RFLP del ADNr 16S de fitoplasmas amplificado con los iniciadores R16F2n/R16R2 y digeridos con cinco enzimas de restricción: EcoRI, HaeIII, KpnI, MseI y RsaI M: marcador molecular 100 pb (Promega, USA); A) Control positivo ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ (I-B); B) Muestra sintomática de nopal de este estudio (Número de acceso: 0N413680); C) Patrones de restricción in silico, generados a partir de las secuencias del gen DNAr 16S del Cactus witches’-broom phytoplasma 16SrII-C (Número de acceso: AJ293216.2) de los sitios de reconocimiento de 17 enzimas de restricción. 

se encuentran en el floema, incluyendo las células inmaduras de este tejido que aún conservan sus núcleos mientras que en insectos vectores se localizan en diversos tejidos de manera intra o extracelular (^{Bertaccini et al., 2014}). En plantas ornamentales se han identificado 14 grupos de fitoplasmas de los 16 que existen, así como 30 subgrupos, todos ellos induciendo diferentes sintomatologías (^{Bellardi et al, 2018}). ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ es el principal grupo que infecta especies ornamentales en todo el mundo. Hasta ahora, se ha informado que más de 60 especies de plantas ornamentales están infectadas con fitoplasmas en todo el mundo (^{Madhupriya, 2016}).

Recientemente, se reportó en Turquía a ‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia’related strain (16SrII-B group) en un cactus ornamental que mostraba síntomas similares a los observados en las plantas de este estudio (^{Ayvaci et al., 2021}). En México se han reportado varios grupos de fitoplasmas asociados al nopal tunero que tienen “engrosamiento del cladodio” o “planta macho”, enfermedad más importante en este cultivo ya que disminuye significativamente la producción en todas las zonas nopaleras del país (^{Hernández-Pérez et al., 2009}; ^{Suaste et al., 2012}; ^{Aguilar, 2019}). Los síntomas de esta enfermedad consisten en un amarillamiento parcial de la planta, reducción gradual del tamaño de la penca y fruto, engrosamiento y desarrollo cordiforme del cladodio, así como la inhibición de la brotación vegetativa y floral; en etapas finales se detiene la producción de la planta sin que ésta muera. En esta sintomatología se han encontrado asociados a diferentes grupos de fitoplasmas, entre los que se encuentran el 16SrII (Hernández-Pérez et al., 2009), 16SrI (‘Candidatus Phytoplasma asteris’) (^{Zak et al., 2011}), 16SrXIII (^{Suaste et al., 2012}) y al 16SrVI (‘Candidatus Phytoplasma trifolii’) (Aguilar, 2019). A pesar de la amplia distribución geográfica de los fitoplasmas, su gama de hospedantes e

Figura 3 Árbol filogenético construido por el método de neighbor-joining con secuencias del ADNr 16S depositadas en el Banco de Genes, se muestra la relación entre los fitoplasmas del grupo 16SrI y 16SrII con el fitoplasmas que induce ‘escoba de bruja’ en nopal (Opuntia sp.) (Número de acceso: 0N413680.1). La barra indica el número de sustituciones por nucleótidos. 

importancia como microrganismos fitopatógenos, existe poco entendimiento sobre las rutas de defensa que tiene la planta para evitar su establecimiento, lo cual puede dar lugar a estrategias alternativas para su manejo y así disminuir su impacto en la agricultura. Por otro lado, en México existen normas que regulan el establecimiento y movilidad de este tipo de ornamentales como la ^{Ley General de Vida Silvestre (2000)} y la ^{Norma Oficial Mexicana de Protección a Especies Nativas de México de Flora y Fauna Silvestre (2002)}. Asimismo, la comercialización internacional de cactáceas está regulada por la ^{Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (2008)}. Respecto a los recursos fitogenéticos para la agricultura y la alimentación contamos con la ^{Ley Federal de Producción, Certificación y Comercio de Semillas (2007)}. En la comercialización, el uso de signos distintivos está regulado en el ámbito internacional por los Acuerdos sobre Derechos de Propiedad Intelectual y Comercio en la Organización Mundial de Comercio y en México a diferencia de otros países se ha permitido que estos patógenos se establezcan en diferentes especies de cactáceas ornamentales, los cuales se pueden convertir en una fuente importante de inoculo para otros cultivos, aunado a esto, tampoco se conocen los insectos vectores que pueden estar involucrados en su trasmisión hacia otros cultivos de importancia agrícola.

Por otro lado, la ventaja que se tiene ahora para identificar con criterios filogenéticos y moleculares permite de manera precisa conocer la asociación de más de un fitoplasma en hospedantes con la misma o diferente sintomatología, o bien, los síntomas ocasionados por un solo grupo de fitoplamas como el 16SrI. Esto ha permitido que el concepto de enfermedad en el caso de los fitoplasmas esté cambiando; en muchos de los casos se indica que las propiedades biológicas características de un determinado fitoplasma están vinculadas con un grupo o subgrupo establecido con criterios filogenéticos, por lo que estas propiedades biológicas solo se pueden utilizar como criterios secundarios para considerar a un fitoplasma como agente causal de una enfermedad.

Con base en los resultados obtenidos, se establece que un fitoplasma del subgrupo16SrII-C está asociado con el síntoma de ‘escoba de bruja’ de un cactus ornamental (Opuntia sp.).