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Introducción
A nivel mundial, la citricultura está sufriendo graves estragos causados por el daño que el Huanglongbing (HLB) genera en todas las especies y variedades de cítricos (Ghosh et al., 2022). El HLB es causado por tres diferentes especies del género Candidatus Liberibacter (CL): CL americanus (CLam), causando HLB en cultivares de Brasil (Teixeira et al., 2005), CL africanus (CLaf), presente en el con- tinente africano (da Graςa et al., 2022) y CL asiaticus (CLas), la más distribuida a nivel mundial (Ajene et al., 2020), y presente en zonas citrícolas de México (Huang et al., 2022).
A pesar de que se considera que todas las especies de cítricos de importancia agrícola son susceptibles a la enfermedad, existe un gradiente de susceptibilidad entre las diferentes especies, siendo principalmente marcada la diferencia entre cítricos ácidos y dulces (McCollum et al., 2016; Gao et al. 2023). La naranja Va- lencia (C. sinensis), considerada un cítrico dulce, es uno de los cítricos más im- portantes en México, tanto en extensión sembrada como en derrama económica (SIAP, 2022); sin embargo, a su vez, es una de las especies más susceptibles al HLB. Numerosos estudios con el uso de herramientas ómicas han demostrado que la infección por CLas ocasiona significativas alteraciones metabólicas, fisiológicas y moleculares en C. sinensis (Fu et al., 2016; Chin et al., 2020; Curtolo et al., 2020; Lally et al., 2021; Ribeiro et al., 2023), las cuales culminan en grandes pérdidas económicas (Li et al., 2020). Por otro lado, algunas especies de cítricos ácidos han sido reportadas como menos susceptibles o tolerantes al HLB, por ejemplo: el limón rugoso (C. jambhiri) (Yu et al., 2017), la lima australiana (C. australasica) (Weber et al., 2022) y el limón persa (C. latifolia) (Sivager et al., 2021).
El caso del limón persa es de alta importancia para México, y Veracruz es el
principal productor y exportador de este fruto a nivel mundial. Por lo cual, es pri- mordial comprender los mecanismos que están involucrados en la tolerancia al HLB. A este respecto, primero se asoció dicha tolerancia a una mayor capacidad de mantener sin alterar algunas funciones fisiológicas como la fotosíntesis, la conduc- tancia estomática y la transpiración (Sivager et al., 2021). Posteriormente, se obser- vó que, a diferencia de lo observado en Poncirus trifoliata (Rawat et al., 2017), la familia de genes CDR no está relacionada con la tolerancia (Flores-de la Rosa et al., 2023). Recientemente se secuenció y ensambló el transcriptoma del limón persa infectado con CLas, en el cual se observó diferentes genes expresados diferencial- mente, pero fue de especial importancia notar genes relacionados con la inmunidad activada por efectores (ETI, por siglas en inglés) que mostraban un incremento en la expresión, como es el caso del gen RPS2 (Estrella-Maldonado et al., 2023).
El gen RPS2 pertenece a un complejo conformado por los genes RPM1-RIN4- RPS2. La relación que existe entre estos genes está intrincadamente relacionada con la respuesta de la planta a la infección por ciertos patógenos. Por ejemplo, el gen RPM1 funge como un receptor de efectores de la bacteria Pseudomonas syringae y activa ETI en Arabidopsis (Rose et al., 2012), dicha activación es me- diada por la fosforilación del gen RIN4 (Lee et al., 2015), es decir, RIN4 induce la expresión de RPM1. Por otro lado, el gen RPS2 puede activar la inmunidad contra la bacteria antes mencionada; no obstante, su interacción con el gen RIN4 es de re- gulación negativa, es decir, la expresión de RPS2 inhibe a RIN4 y viceversa (Alam et al., 2021).
Interesantemente, evidencia experimental demostró que la sobre expresión del gen RIN4 facilita la colonización de CLas en el floema de cítricos y la generación de síntomas de HLB (Cheng et al., 2022), lo que sugiere que el grado de susceptibi- lidad al HLB podría estar asociado al nivel de actividad del gen RIN4. Por lo tanto, con base en lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue comparar la expresión de los genes del complejo RPM1-RIN4-RPS2 en dos especies con respuesta con- trastante al HLB: la naranja Valencia, altamente susceptible, y el limón persa, con una tolerancia alta a la infección por CLas.
Se obtuvo la secuencia de los transcritos de los genes ClRPM1, ClRIN4 y Cl- RPS2 a partir del transcriptoma de limón persa ensamblado por Estrella-Maldona- do et al. (2023), para lo cual se realizó un análisis BLAST local utilizando las se- cuencias de los genes CsRPM1, CsRIN4 y CsRPS2 recuperadas de la base de datos Citrus Genome Database (https://www.citrusgenomedb.org/). Posteriormente, se realizó un alineamiento entre los homólogos de cada especie, mediante el software en línea T-COFFE (https://tcoffee.crg.eu/apps/tcoffee/index.html). En la Figura 1 se presenta el alineamiento de los genes CsRIN4 y ClRIN4.
Una vez identificados y obtenidos los genes, se diseñaron iniciadores para me- dir su expresión, lo cual se realizó en el software en línea Eurofins (https://euro- finsgenomics.eu/en/ecom/tools/pcr-primer-design/). Se generaron los siguientes iniciadores: para el gen RPM1 se obtuvieron los iniciadores RPM1-F (5´-GCCCT- GGATTTGCTGAAG-3´) y RPM1-R (5´- GCAATATTCAACAACTCTGGGA-3´)
con los cuales se esperaba obtener un producto de 130 pb; para el gen RIN4 se dise- ñaron los iniciadores RIN4-F (5´- GCGAGAGGAGAGAAACAGTGCAGG -3´) y RIN4-R (5´- GACGATGATGGGGTGTGGTGGA -3´) diseñados para obtener un producto de 165 pb; por último, para el gen RPS2 se obtuvieron los iniciadores RPS2-F (5´-TGGTTCGATATGTAGTGGGG-3´) y RPS2-R (5´-CTGCTTCACT-GCTGTTAGAC-3´) para obtener un producto de 135 pb. Todas las reacciones de amplificación se llevaron a cabo a 60 °C para la temperatura de alineamiento. Para realizar los ensayos de expresión del complejo, se obtuvieron muestras de hojas fisiológicamente maduras con síntomas de HLB de naranja Valencia y limón persa (Figura 1). Los tejidos se colectaron de tres árboles diferentes de cada espe- cie. La colecta se realizó de una parcela experimental, infectada naturalmente con CLas, que se localiza en el INIFAP Campo Experimental Ixtacuaco (CEIXTA), ubicado a 112 msnm (20° 02’ 36’’ N. 97° 05’ 52.5’’ OE). Los árboles tienen siete años de edad y estaban injertados en el portainjerto Swingle. Las muestras fueron congeladas inmediatamente en nitrógeno líquido y llevadas al laboratorio de Diag- nóstico Fitosanitario del CEIXTA. El tejido fue macerado y dividido en dos partes, una para la detección de CLas y la otra para el ensayo de expresión.
Para la detección de CLas, se realizó la extracción de ADN utilizando el proto- colo descrito por Rodríguez-Quibrera et al. (2022), tras lo cual se realizó el análisis de integridad y calidad de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa (1 %, 90 V por 60 min) y espectrofotometría nanodrop, respectivamente. Posteriormente, se utilizó parcialmente el protocolo descrito por Lin et al. (2010), que consiste en la amplificación de un fragmento del gen 16S ribosomal con los iniciadores Las-O- F (5′-CGGTGAATGTATTAAGCTGAGGCGTTCC-3′) y Las-O-R (5′-TACCCA- CAACAAAATGAGATACACCAACAACTTC-3′).
Para los ensayos de expresión génica del complejo en estudio, se realizó la ex- tracción de ARN mediante un protocolo basado en CTAB al 2 % (Estrella-Mal- donado et al., 2023). El ARN obtenido fue analizado para su integridad y calidad mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa (1 %, 90 V por 60 min) y espectrofotometría nanodrop, respectivamente. Los ARN obtenidos de alta calidad fueron tratados para eliminar el ADN residual mediante la enzima DNAsa RQ1 (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se realizó la síntesis del ADNc, partiendo de una concentración de 500 ng µL-1 de ARN tratado con DNAsa, mediante la enzima M-MLV (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó la amplificación de los genes del complejo en estudio mediante RT-PCR. Para esta amplificación, la reacción fue buffer de PCR 1X, MgCl2 25 mM, 10 mM de cada dNTP, 10 µM de cada iniciador, 1 U de DNA Taq polimerasa y 300 ng de ADNc, teniendo un volumen final de reacción de 10 µL. El ciclo térmico de ampli- ficación consistió en una desnaturalización inicial a 94 °C, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento a 60 °C por 30 s y polimerización a 72 °C por 15 s, tras lo cual se realizó una extensión final a 72 °C por 3 min. El producto de la amplificación fue analizado mediante gel de agarosa al 2 %, teñido en bromuro de etidio al 1.2 % y visualizado en luz UV. Se utilizó el gen F-box como control endógeno (Mafra et al., 2012). Cada muestra se amplificó por triplicado como réplica técnica.
Respecto a la detección del agente causal del HLB en las muestras, se obtuvo un fragmento único de 470 pb (datos no mostrados) en las muestras sintomáticas (Figura 2) de limón persa (tres muestras) y naranja Valencia (tres muestras), lo que corrobora la infección de las muestras con CLas de acuerdo al protocolo utilizado. De acuerdo a los resultados de expresión génica, en la amplificación por RT- PCR se observó que en lo relativo al gen RPM1 no hay diferencia observable entre las muestras de naranja Valencia y limón persa. Por otro lado, para el gen RPS2 se observó diferencia en la intensidad de la banda amplificada, siendo mayor en limón persa que en naranja, sugiriendo que existe diferencia en la actividad de este gen ante la infección por CLas, lo que concuerda con lo observado previamente por Estrella-Maldondo et al. (2023). Sin embargo, la principal diferencia se observó en la amplificación del gen RIN4, este gen se ve claramente amplificado en naranja Va- lencia, mientras que no es detectable la amplificación de dicho gen en limón persa. Esto sugiere que existe una mayor actividad del gen RIN4 en una especie altamente susceptible al HLB, en contraste con una especie con un alto nivel de tolerancia como el limón persa, similar a lo que se ha propuesto de la participación del gen RIN4 en la infección de CLas (Cheng et al., 2022). Los resultados se muestran en
la Figura 3.
Recientemente se ha descrito que el HLB es una enfermedad que está más re- lacionada con una respuesta de defensa exacerbada y descontrolada ante CLas que en sí por el daño causado por el patógeno (Ma et al., 2022), por lo cual comprender los mecanismos que se alteran en la defensa de la planta es imprescindible para el diseño de estrategias de control de esta enfermedad. Los resultados obtenidos en el presente estudio son evidencia que soportan la hipótesis de que la infección por CLas y el desarrollo del HLB está facilitado por la expresión del gen RIN4. Este fenómeno se ha observado en otros patosistemas, en los cuales RIN4 actúa como un represor de la Inmunidad Activada por Patrones Moleculares (PTI) (Ray et al., 2019), especialmente inactivando la respuesta por RPS2 (Belkhadir et al., 2004), mientras que su fosforilación induce la activación de ETI (Xu et al., 2017). Es importante destacar que la sobre expresión de RIN4 ha demostrado que inhibe la deposición de calosa en respuesta a los patógenos (Afzal et al., 2011; Ray et al., 2019), dicha inhibición de la producción de calosa es uno de los mecanismos que utiliza CLas para translocarse dentro del floema (Bernardini et al., 2022), mientras que el incremento de calosa en zonas con baja presencia de CLas se debe más a la respuesta descontrolada de la planta (Archor et al., 2020; Ma et al., 2022).
Figura 2 Síntomas de HLB presentes en hojas de limón persa (A) naranja Valencia (B) y frutos de limón persa (C) y na- ranja Valencia (D).
Figura 3 Expresión del complejo RPM1-RIN4-RPS2 mediante RT-PCR en naranja Valencia, especie altamente susceptible al HLB, y limón Persa especie con un alto nivel de tolerancia al HLB.
El presente estudio muestra evidencia de que existe una expresión diferencial del gen RIN4 entre cítricos infectados naturalmente con CLas (seis muestras ana- lizadas), de acuerdo a su nivel de susceptibilidad al HLB. Es necesario realizar estudios adicionales que confirmen esta hipótesis; sin embargo, nuestros resultados sugieren que el gen RIN4 es un blanco molecular importante para la inducción de tolerancia al HLB mediante herramientas biotecnológicas (Sun et al., 2019).
