Introducción

El género Agave es uno de los más representativos de México, con alrededor de 211 especies, de las cuales 159 tienen presencia en nuestro territorio, es decir, 75.3 % del total (^{García et al, 2019}). De ellas se obtienen diversos productos como alimentos, bebidas y fibras, entre otros (^{García, 2007}). Sus usos en México están ligados al desarrollo económico, social, cultural y ecológico de numerosas poblaciones. En las últimas décadas, el Agave ha tenido un creciente auge social y económico por ser utilizado como materia prima para la elaboración de bebidas alcohólicas fermentadas y destiladas como el pulque, el mezcal y el tequila. En México, se recolectan varias especies de agave silvestre para destilar mezcal entre las cuales destacan A. marmorata, A. karwinskii, A. potatorum, A. angustifolia, A. cupreata, A. horrida y para la elaboración del pulque se recolecta una sola especie, A. salmiana. De acuerdo a la lista roja de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza y Recursos Naturales (IUCN) y la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT) el Agave se ha vuelto presa de sobre-colecta a través del saqueo ilegal. La falta de propagación sexual han reducido las poblaciones silvestres y amenazan la variabilidad y estructura genética en los cultivares, además que la inflorescencia es removida usualmente para asegurar la acumulación de azúcares en la piña, impidiendo eventualmente la formación de semillas (^{Peña et al. 2006}), lo que confirma la necesidad de preservar el germoplasma de estas especies en peligro de extinción y amenazadas a partir de semillas, mediante estrategias basadas en el desarrollo y optimización de protocolos para desinfección y propagación in vitro.

La desinfección de las semillas de agave es un paso crucial en el cultivo in vitro, ya que el éxito de los sistemas de propagación depende en gran medida del control y prevención de la contaminación. Los fitopatógenos provocan pérdidas cuantiosas de material vegetal en los procesos productivos o de investigación.

El propósito de desinfectar la semilla es erradicar microorganismos contaminantes presentes en la cubierta de la semilla y embrión, así las plantas que se obtengan estarán libres de bacterias y hongos asociados a las semillas. Además de prevenir la contaminación y las enfermedades, la desinfección de las semillas de Agave también puede mejorar las tasas de germinación, la cual es esencial para el éxito del cultivo in vitro de Agave, ya que una tasa de germinación baja puede afectar la eficiencia y productividad del proceso de cultivo in vitro (^{Zurita et al., 2014}; ^{Flores et al., 2019}) Por lo tanto, es importante seguir los procedimientos de desinfección adecuados para garantizar el éxito del cultivo logrando mejorar la calidad, sanidad, rendimiento y conservación del germoplasma.

Actualmente, se han reportado diversos protocolos de desinfección de semillas en especies como A. victoria reginae (^{Domínguez et al., 2008}; ^{Ramírez et al., 2008}), A. fourcroydes (^{Monja, 2013}), A. angustifolia (^{Arzate et al., 2016}), A. marmorata (^{Álvarez et al., 2020}) y A. tequilana (^{Delgado et al., 2021}), en los cuales la mayoría de los autores coinciden en el uso de Etanol e Hipoclorito de Sodio y Calcio. Sin embargo, en Agave no se ha reportado el uso de Cloruro de Mercurio (HgCl2), Peróxido de Hidrogeno (H2O2) y fungicidas, así como la tasa de contaminación y los microrganismos contaminantes encontrados los cuales en grandes porcentajes encarecen la producción, por lo que, al contar con un protocolo eficiente de desinfección puede ayudar a reducir estos costos.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar 12 tratamientos (Cuadro 2) para generar un protocolo eficiente de desinfección in vitro en semillas de seis especies de Agave mezcalero A. marmorata, A. karwinskii, A. potatorum, A. angustifolia, A. cupreata, A. horrida y un pulquero A. salmiana, utilizando cinco desinfectantes que permitan una amplia desinfección: Peróxido de Hidrógeno (H2O2), Hipoclorito de Sodio comercial (NaClO), Hipoclorito de Calcio Ca(ClO)2, Sulfato de Cobre (PENTAMAX®), Cloruro de Mercurio II (HgCl ) y Etanol (C H O).

Materiales y Métodos

El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, ubicado en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Fitomejoramiento de la Facultad de Ciencias Agrícolas, de la Universidad Autónoma del Estado de México, Campus Universitario “El Cerrillo”, Toluca, Estado de México.

Material biológico. Se utilizaron semillas maduras de siete especies de Agave, colectadas en diferentes Estados de la República Mexicana en un periodo de 1 a 7 años, conservadas en un banco de germoplasma durante su almacenamiento (Cuadro 1).

Desinfección del material biológico. Se evaluaron 12 tratamientos con soluciones desinfectantes y combinaciones diferentes (Cuadro 2) más un testigo (T0), seleccionados con base a los reportes obtenidos en la desinfección de semillas de otros géneros, los cuales presentaron resultados aceptables para desinfección (Flores et al., 2008; ^{Billard et al., 2014}; ^{Tamayo et al., 2017}; ^{Campos et al., 2020}; ^{Zúñiga y Beauregard, 2020}). Los desinfectantes utilizados fueron; Peróxido de Hidrógeno (H O ) al 3 % por 24 h, Hipoclorito de Sodio comercial (Cloralex® al 4 %) (NaClO) concentración final de 5 % v/v) por 5 min, Hipoclorito de Calcio Ca(ClO)2 al 8 % (p/v) por 15 min, Sulfato de Cobre nombre comercial PENTAMAX® al 30% (v/v) por 10 min, Cloruro de Mercurio II (HgCl2) al 0.1 % (p/v) por 10 min. Se evaluaron los 12 tratamientos con 10 semillas por tratamiento (cada semilla se consideró como una unidad experimental) y para cada tratamiento se consideraron tres repeticiones, evaluándose un total de 390 semillas por especie (considerándose un control). Se monitoreo el experimento cada semana, durante un período de 30 días.

Inicialmente las semillas se colocaron en tubos Falcón estériles con capacidad de 50 mL y fueron lavadas con 15 mL de agua de ósmosis estéril más 1 mL de jabón comercial (Axión®) y dos gotas de Tween 20® por 15 minutos manteniéndolas en agitación; pasado el tiempo se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril. Seguidamente, se sumergieron en 15 mL de etanol al 70% (v/v) por un minuto y se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril. Posteriormente, se aplicaron los

tratamientos de desinfección, las semillas se mantuvieron en agitación constante en todos los tratamientos y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril después del tiempo de aplicación de cada desinfectante para eliminar los residuos de los desinfectantes, a excepción de los tratamientos con H2O2. Todo se realizó en condiciones de asepsia, dentro de una campana de flujo laminar.

Germinación de la semilla. Después de su desinfección, las semillas fueron sembradas en frascos de cultivo de 100 mL, colocando 10 semillas por frasco. En cada frasco se adicionaron 20 mL de medio de cultivo con sales MS (^{Murashige y Skoog, 1962}), suplementado con 30 gL-1 sacarosa, 0.5 gL-1 de carbón activado, sin reguladores de crecimiento vegetal y gelificado con 8 g L-1 de Agar. El pH del medio se ajustó a 5.7 y se esterilizó en autoclave a 1.5 kg/cm2 de presión y una temperatura de 121.5 °C durante 15 minutos. Los cultivos se incubaron durante 30 días en un cuarto de incubación con un fotoperiodo de 16 h luz y ocho horas de oscuridad, con una intensidad lumínica de 18.83 µM m-2 s-1 a una temperatura de 25 ± 2 °C, se consideró una semilla germinada cuando la radícula fue visible.

Identificación de microorganismos contaminantes encontrados en las semillas de Agave. Se aislaron los microorganismos contaminantes (hongos, bacterias y levaduras) encontrados en los tratamientos que presentaron contaminación y se sembraron en cajas Petri con medio PDA (Agar Dextrosa-Papa), para su aislamiento y purificación, posteriormente se enviaron al Laboratorio de Microbiología del Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Universidad Autónoma del Estado de México, para su identificación taxonómica, en donde las muestras fueron resembradas en medio PDA y Agar sabouraud a 25 ± 2 °C por 26 días, monitoreadas constantemente para su identificación morfológica, utilizando tinciones de lactofenol. Para la identificación de bacterias las muestras fueron sembradas en agar sangre y agar TSA (Agar Triptona-Soja) incubadas a 36°C y monitoreando constantemente por 5 días.

Variables evaluadas. Durante los 30 días del experimento, se evaluaron semanalmente las siguientes variables:

Porcentaje de contaminación de las semillas: ([Número de semillas contaminadas* 100] ¸ número total de semillas sembradas) Porcentaje de germinación de las semillas: ([Número de semillas que germinaron* 100] ¸ número total de semillas sembradas) Días a germinación: Se registró el número promedio de días a la emergencia de la radícula por semilla en cada especie.

Análisis estadístico. El diseño experimental para el presente trabajo tuvo una distribución completamente al azar en un arreglo bifactorial, con tres repeticiones. Los datos registrados en las variables de contaminación y germinación en las semillas se sometieron a un Análisis de Varianza de Clasificación Simple (ANOVA) y se realizó una prueba de comparación entre las medias Tukey (p<0.05), con ayuda del Sofware InfoStat. 2017.

Resultados

El análisis de varianza para contaminación y germinación reveló un coeficiente de determinación de 0.78 y 0.97, respectivamente, indicando que el modelo utilizado fue adecuado para explicar la variabilidad de estas variables; así mismo el coeficiente de variación fue 34 % para contaminación y 103 % para germinación, explicando esto último por factores extrínsecos (tratamientos) e intrínsecos (genético fisiológicos) de cada semilla y especie y confirmados estadísticamente al registrarse diferencias altamente significativas (p<0.01) en la interacción especies x tratamientos, indicando que al menos un tratamiento fue eficiente para ambas variables (contaminación y germinación) en por lo menos una especie (Cuadro 3).

Germinación. Al procesar los datos de germinación, las pruebas de medias mostraron diferencias estadísticas significativas (p<0.05) en los diferentes tratamientos, la respuesta de germinación fue muy variable en los diferentes tratamientos e independiente para todas las especies, puesto que cada especie respondió de manera diferente y su tiempo de germinación también fue variable, en su mayoría esta variable fue baja (0 - 20 %) (Cuadro 4).

Sin embargo, los resultados coinciden con los obtenidos en la variable contaminación. El único tratamiento que estimuló la germinación para las siete especies de Agave fue el tratamiento 12, en donde el porcentaje de germinación para la mayoría de las especies estuvo por arriba de los demás tratamientos, en A. marmorata (90%), A. angustifolia (85 %), A. salmiana (50 %), A. horrida (30 %), A. potatorum (30 %), A. cupreata (30 %), y A. karwinskii (20 %). Por otro lado, A. marmorata fue la que tuvo una mejor respuesta, alcanzando un promedio de 90 % de germinación, además de ser la especie más temprana, germinando a los 8 días después de la siembra, resultando así la especie que se diferenció estadísticamente del resto (Cuadro 4).

Sin embargo, a pesar del bajo porcentaje de geminación para los otros tratamientos (0 - 20 %) ninguna de las plántulas obtenidas presentó anormalidades en su germinación y desarrollo, independientemente del tratamiento utilizado y de la especie (Figura 1).

Figura 1 Germinación de semillas de A. salmiana. A) Emergencia y elongación radicular. (14 dds) B) Elongación de la plúmula. (21 dds) C) Diferenciación de los cotiledones y desarrollo de la raíz. (30 dds) D) Germinación y desarrollo completo. (14-30 dds) E) Plántulas normales completamente desarrolladas de A. salmiana. (50 dds); dds días después de la siembra. 

Identificación de patógenos

Contaminación. La prueba de Tukey (p<0.05) determinó que existen diferencias altamente significativas entre todos los tratamientos aplicados, puesto que la mayoría de tratamientos disminuyeron diferencialmente la contaminación en las semillas. Sin embargo, estadísticamente sólo un tratamiento fue mejor al resto (Tratamiento 12), y se disminuyó completamente la contaminación (100 %) para todas las especies estudiadas, el cual consistió en aplicar Peróxido de Hidrógeno (H2O2) al 3 % por 24 h, PENTAMAX (PM) al 30 % (v/v) por 10 min y Cloruro de Mercurio II (HgCl2) al 0.1 % (p/v) por 10 min. En contraste a lo anterior, los niveles más altos de contaminación se observaron en los tratamientos con Hipoclorito de Calcio e Hipoclorito de Sodio. Es importante aclarar que la contaminación de las semillas de Agave spp., en los diferentes tratamientos fue principalmente por hongos y en menor frecuencia por bacterias (Cuadro 4).

Identificación de microorganismos contaminantes. De manera general y por primera vez, se detectaron seis géneros de microorganismos asociados a las semillas de Agave. Los resultados del estudio taxonómico para las seis muestras analizadas revelaron cuatro géneros de hongos: Monilinia sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. y Alternaria alternata, una bacteria; Bacillus sp., y una levadura, Schizosaccharomyces sp. (Figura 2). Es de resaltar que en el aislamiento de microorganismos contaminantes Aspergillus y Penicillium se presentaron en todas las especies, mientras que otros fueron exclusivos de algunas especies, Schizosaccharomyces sp., se presentó en A. marmorata, Alternaria alternata en A. angustifolia y Monilinia sp., en A. horrida.

Figura 2 Cepas de patógenos encontrados en las semillas de Agave spp. A) Schizosaccharomyces sp. B) Bacillus sp. C) Penicilllium sp. D) Alternaria alternata. E) Aspergillus sp. F) Monilinia sp. 

Al evaluar la eficiencia de los tratamientos sobre el control de los patógenos, se pudo observar que la mayoría de los tratamientos tuvieron un control efectivo sobre bacterias, pero deficiente para hongos, esto en comparación con el tratamiento testigo. Sin embargo, el H2O2 presentó resultados favorables por encima de los demás tratamientos incluso en aquel donde se utilizó el desinfectante solo (Cuadro 5).

Cuadro 5 Microorganismos contaminantes presentes en las semillas de agave después de aplicar los tratamientos. 

Tratamientos		A. salmiana			A. angustifolia			A. horrida			A. marmorata			A. potatorum			A. karwiskii			A. cupreata
		H	B	L	H	B	L	H	B	L	H	B	L	H	B	L	H	B	L	H	B	L
1	Ca(ClO)2	X						X	X								X	X	X
2	NaOCl	X									X	X			X
3	Ca(ClO)2/NaOCl				X						X						X	X	X
4	H2O2				X
5	PM/ Ca(ClO)2	X			X										X		X
6	PM/NaOCl				X										X
7	PM/ Ca(ClO)2/NaOCl	X			X										X		X
8	PM/H2O2							X
9	PM/HgCl2/ Ca(ClO)2				X			X
10	PM/HgCl2/NaOCl	X			X
11	PM/HgCl/Ca(ClO)2/NaOCl	X			X												X
12	PM/HgCl2/H2O2

H: Hongos; B: Bacterias; L: Levaduras. X: Microorganismos presentes.

Discusión

Germinación. Los porcentajes de germinación totales para la mayoría de las especies fueron mayores a los reportados por ^{Ramírez et al. (2016)} para A. mapisaga. (70 %) y A. angustifolia con 28 % de germinación. Además, las semillas de las siete especies de Agave presentaron germinación arriba del 50 % incluso en las especies con más años de colecta como A. horrida y A. salmiana coincidiendo con ^{Castillo et al. (2022}) quien reportó que semillas de A. victoriae reginae fueron viables después de un año de haber sido recolectadas y sugiere que es posible almacenar las semillas de esta especie al menos durante un año y tener porcentajes de germinación aceptables. De acuerdo, con los resultados de este estudio las semillas presentaron una viabilidad por arriba del 50 % siendo almacenadas en un banco de germoplasma por periodos más largos, sin embargo, se sugiere para próximos estudios, iniciar con la prueba de viabilidad con cloruro de tetrazolio, lo que dará claridad en la viabilidad obtenida.

Además, al analizar los días de germinación se puede afirmar que las semillas no presentaron latencia, característica propia de otras especies de Agave (^{Freeman et al., 1977}; ^{Freeman, 1975}). Esta ausencia de latencia en las semillas evaluadas es similar a las reportadas por ^{Peña et al. (2006}) para semillas almacenadas durante dos años de A. salmiana, que tuvieron menor latencia que aquellas sembradas en el mismo año de recolección.

Finalmente, en los tratamientos donde no hubo germinación para alguna especie, destacando el tratamiento testigo (T0) en el cual ninguna especie germinó se puede atribuir a la presencia de hongos y bacterias (contaminación), puesto que, las semillas afectadas por hongos fitopatógenos pueden presentar esclerotización, estromatización, decoloración, necrosis, pudrición de la radícula, reducción de tamaño, aborto e incapacidad germinativa (^{Ellis y Gálvez, 1980}; ^{Agarwal y Sinclair, 1987}).

Contaminación. En Agave no se han reportado datos específicos para el tema de la desinfección. En el presente trabajo, el número promedio de semillas contaminadas más bajo (010 %) se presentó en los tratamientos en los que se aplicó H2O2, sin embargo, al aplicar H2O2 al 3 % por 24 h en combinación con Sulfato de Cobre (PENTAMAX®) al 30% por 10 min y Cloruro de Mercurio II al 0.1 % por 10 min se logró una desinfección total de las semillas. En este género no se han reportado resultados similares con estos desinfectantes. Sin embargo, ^{Flores et al. (2019}) obtuvo altos niveles de desinfección aplicando H2O2 (3 % v/v) por 24 horas, en agitación contante. Esto puede deberse a que el peróxido de hidrógeno ejerce su actividad oxidante con la producción de radicales libres, que provocan un daño oxidativo a las proteínas y los lípidos en la membrana celular de los patógenos, comprobando su capacidad bactericida, viricida y fungicida. Cuando el H2O2 se mantiene en agitación, se reduce la demanda de oxígeno, por lo cual el H2O2 tiene mayor capacidad de oxidación que el cloro o el dióxido de cloro, además sus moléculas no dejan residuos tóxicos al liberar oxígeno (^{CNIB, 2023}; ^{Rodríguez et al., 2009}).

Por otra parte, ^{Bedoya et al. (2016}) reportaron que la inmersión de hojas de Aloysia triphylla en HgCl2 al 0.2 % p/v durante 5 minutos permitió la obtención de más de un 80% de explantes viables y libres de contaminación. En cuanto a la desinfección con fungicidas, ^{Barney (2003}) disminuyó los hongos endófitos en plántulas de Lepanthes rupestris o Lolium perenne al aplicar Propiconazol o el Procloraz. En resumen, todos los desinfectantes anteriores son eficientes, sin embargo, para agave el H2O2 en combinación HgCl2 y sulfato de cobre es altamente eficiente para reducir la contaminación en semillas, permitiendo obtener un 100% de desinfección en las siete especies evaluadas.

Un nivel de contaminación intermedio se logró al aplicar Ca(ClO)2 y NaOCl, contrastando esto con los resultados obtenidos en otras especies. ^{Martínez et al. (2003}) obtuvieron semillas de Agave victoriae reginae libres de patógenos utilizando NaOCl como desinfectante, el cual ha sido probado con efectividad contra bacterias, virus y hongos, ya que al ser diluido en agua se forma el ácido hipocloroso (HClO) que penetra fácilmente en las células de los microorganismos y actúa sobre sus proteínas y ácidos nucleicos (Auccasi, 2016); no obstante, según ^{Lenntech (2008)} para lograr una desinfección exitosa debe aplicarse una concentración adecuada al grado de infección de los organismos patógenos. Esto coincide con ^{Álvarez et al., (2008}) que mencionan la buena efectividad del cloro y etanol como desinfectantes en bacterias patógenas, pero deficiente contra hongos y virus.

Mientras que los niveles más altos de contaminación se observaron en semillas libres de soluciones químicas (tratamiento testigo), el cual mostró una contaminación total en las semillas, por lo cual se puede deducir que no basta únicamente con lavar la semilla con agua corriente o jabón, se tienen que aplicar desinfectantes químicos para reducir la presencia de agentes patógenos. Finalmente, al hacer la comparación de diferentes especies y soluciones utilizadas los resultados evidencian la efectividad obtenida de cada una para Agave spp.

Identificación de microorganismos. De acuerdo con el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (^{INTA, 2022}), los tres géneros fúngicos pueden ser clasificados en tres grupos funcionales: hongos de campo (Fusarium y Trichoderma), hongos de almacenamiento (Aspergillus y Penicillium) y hongos contaminantes genéricos (Monilia y Rhizopus), cada uno con origen y hábitat particular.

Aspergillus y Penicillium, son géneros típicos en condiciones de almacenamiento, con habilidad para invadir semillas y granos de bajo contenido de humedad, crecer en amplio rango de temperaturas y con pocas excepciones, infectar antes de la cosecha. Colonizan activamente las semillas, donde causan deterioro y reducción en la germinación, a través de principios enzimáticos y toxinas (^{Howlett, 2006}), confirmando con esto que aquellas semillas que presentaron una gran infestación de estos géneros no germinaron, siendo esta la principal razón. En semillas de moringa el género Aspergillus resultó ser el más versátil, al liderar las frecuencias de aparición, estando presente en la semilla de moringa tanto externa como internamente (^{Sabu et al., 2022}). En relación a Monilinia, es poca la información que se tiene al respecto, puesto que no se ha reportado en Agave u otras semillas. Habita mayormente regiones húmedas y ataca principalmente a frutales, siendo agente causal de la podredumbre marrón (^{Malvárez et al., 2001}). Se comporta como un patógeno de heridas, puesto que infecta frutos a partir de lesiones provocadas por insectos y/o roces mecánicos (^{Zúñiga et al., 2011}).

Alternaria alternata, se detectó con la mayor incidencia y exclusivamente en A. angustifolia. Este patógeno es un hongo saprófito y se dispersa por esporas a través de las corrientes de aire y mediante la movilización de semillas infectadas (^{DGSV, 2023}). A. alternata causa enfermedades en varias plantas de importancia económica como brócoli, tomate, chile, papa, cítricos, manzana, etc. (^{Meena y Samal, 2019}). ^{Kurowski y Wysocka (2009}) señalan que A. alternata está presente como un contaminante común en semillas de cereales y es la principal enfermedad fúngica aislada en semillas de amaranto y semillas de avena (^{Noelting et al., 2016}; ^{Leyva et al., 2014}), sin embargo, no se tienen reportes para A. angustifolia.

Finalmente, de los géneros Bacillus sp. y Schizosaccharomyces sp., se tienen reportes como agentes benéficos principalmente Bacillus, el cual se ha reportado como uno de los principales géneros de antagonismo microbiano y como agente de control biológico para la agricultura, además en Agave se ha reportado como agente endófito que promueve el crecimiento y desarrollo de las plantas (^{Beltran et al., 2014}). Sin embargo, en este trabajo de investigación ambos géneros se encontraron como agentes saprofitos contaminantes en semillas de Agave, de los cuales no hay reportes en otras semillas lo que podría abrir la puerta para investigaciones futuras.

Conclusiones

Se evaluaron los 12 tratamientos propuestos y los resultados muestran que el tratamiento 12 consistente en Peróxido de Hidrógeno al 3 % por 24 h en combinación con Sulfato de Cobre (PENTAMAX®) al 30 % (v/v) por 10 min y Cloruro de Mercurio II al 0.1 % (p/v) por 10 min, fue el mejor en el control de microorganismos contaminantes presentes en las semillas de Agave spp., logrando un 100 % de desinfección y una germinación del 20 al 90 % dependiendo la especie, por lo que se recomienda para la desinfección de semillas de Agave spp.

Por primera vez en semillas de Agave se realizó la identificación taxonómica de los microorganismos contaminantes encontrados, reportando cuatro hongos (Penicilllium sp., Alternaria alternata, Aspergillus sp., Monilinia sp.), una bacteria (Bacillus sp.) y una levadura (Schizosaccharomyces sp.), de los cuales Alternaria alternata., Monilinia sp., y Schizosaccharomyces sp., fueron específicos para A. angustifolia, A. horrida y A. karwiski, respectivamente. Además de reportar por primera vez los agentes desinfectantes que los controlan.