Dentro de las especies de chile cultivadas en México se encuentra el chile habanero (Capsicum chinensis) producido en Campeche, Quintana Roo, Yucatán y Tabasco. En 2015 la producción de chile habanero en Tabasco fue de 3,055.5 t (SIAP, 2015). Sin embargo, en los últimos años, este cultivo se ha introducido a municipios propiamente cacaoteros. En México, se ha reportado la marchitez del chile, atacando diferentes tipos de chiles y causando pérdidas hasta un 40% en varios estados de la república mexicana (^{Silva-Rojas et al., 2009}; ^{Pérez-Moreno et al., 2005}; ^{Pérez-Acevedo et al., 2017}). Sin embargo, en Tabasco se presume la presencia de P. capsici con la marchitez del chile habanero (^{López-López et al., 2018}) basados en la sintomatología, por lo que se requiere la corroboración de la presencia de P. capsici. ^{Montes y de los Santos, (1989)} y ^{Ortiz-García (1996}) señalan la presencia de P. capsici en cacao de acuerdo con los criterios de ^{Tsao y Alizadeth (1988}) posteriormente señalada por Uchida et al. (1992) como P. tropicalis. Considerando que las especies de Phytophthora que atacan tanto al cacao y al chile están filogenéticamente relacionadas en el clade 2 (^{Martin et al., 2012}). Asimismo, ^{Donahoo y Lamour (2008}) señalan que cuando existen poblaciones superpuestas, de ambas especies de Phytophthora, puede darse la hibridación después de la generación F; situación que documenta in vitro^{Hurtado-González y Lamour (2009}) con cepas de pepino y calabaza en USA, al igual que ^{Ortiz-García (1996)} con cepas de Phytophthora de calabaza de Francia y de cacao de México. Con base a lo anterior, y dada la importancia que tiene el cacao en Tabasco, y la ampliación de la superficie cultivada del chile habanero en la zona cacaotera de Tabasco, hizo imprescindible determinar el agente causal de la marchitez del chile habanero en las áreas cacaoteras donde se está incentivando la producción de chile habanero, en municipios de Tabasco.

Área de estudio. El área de estudio fue un transecto de 82 km que inicia en el C-34, Huimanguillo y finaliza en Acachapa y Colmena, Centro, en dirección oeste-este, pasando por comunidades cacaoteras de Huimanguillo, Cárdenas y Cunduacán en la subzona hidrológica 1 y llegando a la subzona 2, en Acachapa y Colmena, Centro Tabasco (Figura 1) en cuyas vecindades se ubican comunidades tradicionalmente cacaoteras con plantaciones de chile habanero.

Colecta y aislamiento. De enero a mayo de 2018, se visitaron 15 plantaciones de chile habanero en cuatro municipios de Tabasco: Huimanguillo (1), Cárdenas (2), Cunduacán (9) y Centro (3) donde las plantas de chile con síntomas de diferente grado de marchitez se colectaron. Para aislar los microrganismos asociados, se cortaron pequeños fragmentos de tejido, desinfectados, lavados y secos se sembraron en medio de cultivo V8-Agar y se incubaron a 25±1 °C en obscuridad durante siete días en una incubadora Prendo®. Los cultivos se purificaron utilizando el método de punta de hifa siguiendo la metodología de ^{Ortiz-García (1996}). La identificación a nivel de género se apegó a las claves de ^{Barnett y Hunter (1972}) para Fusarium y ^{Erwin y Ribeiro (1996}) para Phytophthora.

Figura 1 Transecto de comunidades de los municipios de Huimanguillo, Cárdenas, Cunduacán en la subzona 1, y del Centro, en la subzona 2 en Tabasco, donde se colectaron plantas de chile habanero con marchitamiento, en la zona hidrológica Grijalva 

Pruebas de patogenicidad en plantas de chile habanero. La prueba de patogenicidad se realizó con cada microrganismo aislados de plantas marchitas de chile habanero de 60 días de edad, Phytophthora CH132; Fusarium CH2, CH3, CH7, CH11 y CH16, además, se empleó la cepa de P. capsici CPV302 de colecciones nacionales. Así, un par de discos de 0.5 cm de diámetro, de colonias jóvenes, se colocaron adherido a la base del tallo para infectarlo por contacto micelial e incubadas en cámara húmeda. La supervisión diaria permitió registrar los cambios morfológicos en las 35 plantas de chile habanero empleadas en esta prueba con los siete aislamientos (cinco plantas por aislamiento) por un periodo de 16 días; además, de cinco plantas no inoculadas tomadas como testigo.

Prueba de patogenicidad sobre mazorca de cacao. Con las cepas CH132 (Phytophthora aislada de chile habanero), PC161.2, PC219 (P. capsici aisladas de chile empleadas como referencia) y CPM04 (de Phytophthora aisladas de cacao de Tabasco como testigos positivos), se realizó la prueba de patogenicidad sobre mazorcas de cacao. Para esta prueba se emplearon mazorcas, en etapa de madurez fisiológica de cacao del ecotipo Guayaquil. Éstas, después de lavadas por inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 1% por un minuto y, después lavadas en tres recipientes con agua destilada estéril, fueron introducidas en una caja plástica igualmente esterilizada, con una tela esterilizada y húmeda en el fondo para aclimatarlas por 12 horas. Posteriormente, en una cámara de flujo laminar, fueron tomados y depositados sobre la epidermis de las mazorcas (sin heridas y en línea recta) cuatro discos de 0.5 mm de diámetro de la zona de crecimiento de las colonias de Phytophthora, con cinco días de crecimiento. Las cajas se taparon e incubaron a 25±1 °C en obscuridad durante siete días en una incubadora Prendo^®.

Identificación morfológica. La formación de esporangios se indujo de acuerdo con ^{Pérez-Acevedo et al. (2017}). El aislamiento obtenido del chile habanero (CH132) se confrontó con los tipos de compatibilidad conocidos de A1 (PVM-161.2) y A2 (CPV-219) de P. capsici. En una caja con medio de cultivo Ejote-Agar, se colocó un disco de 5 mm del aislamiento CH132 a 1 cm de distancia del aislamiento de referencia (A1 o A2). Las cajas se mantuvieron a 25±1 °C en una incubadora Prendo^® en oscuridad por dos semanas y se examinaron al microscopio compuesto Cole Parmer^® (^{Fernández-Pavía et al., 2004}). Las características morfológicas se compararon con ^{Stamps et al. (1990}).

Identificación molecular. Para extraer el ADN se siguió el protocolo de ^{Leslie y Summerell (2006}) con modificaciones. La región del gen mitocondrial COI (citocromo oxidasa c subunidad 1) fue amplificada con los iniciadores COIF-1 (5’ -TCAWCWMGATGGCTTTTTTCAAC-3’) y COIR-1 (5’-RRHWACKTGACTDATRATACCAAA-3’) que amplifican 727 pb. Las amplificaciones de PCR se realizaron en un termociclador Eppendorf MasterCycler^® Gradient. Las condiciones para la amplificación fueron: 2 min a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 55 °C y un paso final de extensión a 72 °C durante 10 min (^{Robideau et al., 2011}). Los fragmentos de ADN fueron purificados con el kit Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System-Promega, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los productos de PCR fueron secuenciados en Macrogen (Seúl, República de Corea). Las secuencias obtenidas se ensamblaron y editaron usando el programa PreGap y Gap. Se creó una secuencia consenso, y se alinearon empleando el software ClustalX2. La identidad de las secuencias primero se realizó por medio del programa web Blast^® blastn suite en NCBI (https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi). Para confirmar la identidad de los aislados con secuencias ex-tipo, se llevó a cabo un análisis genético en MEGA^® (Molecular Evolutionary Genetics Analisys) aplicando el método Máxima Verosimilitud con 100 repeticiones bootstrap. Se utilizó el modelo de ^{Tamura-Nei para inferir la evolución (Tamura y Nei, 1993}), se utilizó a Pythium oopapillum como grupo externo.

Aislados obtenidos. Las comunidades de la subzona hidrológica 1, de donde se colectaron plantas de chile habanero enfermas fueron C-34, en Huimanguillo (S16), Rio Seco (S2) en Cárdenas, Miahuatlán (S11), Cumuapa (S3) y San Pedro (S7) en Cunduacán, donde se encontraron asociados los aislados de Fusarium (CH2, CH3, CH7, CH11 y CH16). Las plantas colectadas mostraron marchitamiento ligero en el follaje sin necrosamiento foliar o necrosis de tallo. En los tres sitios de muestreos del municipio de Centro, se colectaron plantas con necrosis foliar y daños tal como señala ^{Pérez-Moreno et al. (2005}), y donde se obtuvo el aislado CH132 de Phytophthora, en Acachapa y Colmena (S13).

Pruebas de patogenicidad en plántulas de chile. A los seis ddi (días después de la inoculación) con las cepas CH132 se registraron puntos necróticos en la base del tallo y marchitez del follaje (Figura 2 A). A los 16 días se observó una necrosis del tallo y hojas secas (Figura 2 B).

De las plantas marchitas y necrosis en el tallo, se re-aisló Phytophthora confirmando los postulados de Koch, señalando a CH132 como patógena y causante la marchitez del chile. Los daños de marchitez y necrosamiento en la base del tallo causada por la cepa CH132 (Phytophthora) fue similar al causado por la cepa CPV302 de P. capsici. Las plantas testigo y las plantas inoculadas con cepas e de Fusarium (CH2, CH3, CH7, CH11 y CH16) no mostraron síntomas.

Prueba de Patogenicidad en mazorcas de Cacao. Las mazorcas de cacao inoculadas con los discos de micelio de las colonias aisladas de cacao (CPMO 04) a los cuatro días de incubación, dos de los cuatro puntos de inoculación mostraron los síntomas típicos de ataque de la mancha negra (^{Ortiz-García, 1996}). Sin embargo, las cepas de Phytophthora aisladas de chile de Tabasco y las cepas empleadas como referencia, no presentaron daño sobre la corteza.

Figura 2 Prueba de patogenicidad de cepas de Phytophthora: Testigo, CPV302 y CH132 (de izquierda a derecha) en plán tulas de chile habanero. Síntomas a los nueve ddi (A). Síntomas a los 16 ddi (B). 

Caracterización morfología. El asilamiento CH132 presentó micelio cenocítico, esporangios caducos, con predominio de formas obpiriforme y limoniforme. El promedio de 50 esporangios fue 73.72 µm de largo y 37.3 µm de ancho; y relación largo/ancho de 2.02. Papila de 4.91 µm y pedicelos largos de 189.8 µm, y sin clamidosporas. La oospora es esférica, plerótica, con un promedio de 25.04 µm de largo, 24.57 µm ancho y 3.07 µm de grosor (Figura 3). Anteridio anfígino, con un promedio de 12.6 µm de largo y 11.5 µm ancho. El oogonio mostró un promedio de 29.5 µm de largo y 27.8 µm de ancho. Dimensiones son similares a lo reportado para P. capsici por ^{Stamps et al. (1990}). El tipo de compatibilidad del aislamiento CH132 es heterotálica, tipo A2.

Figura 3 Características morfológicas del aislamiento CH132. A: Esporangios papilados (≥3.5 μm) de forma limoniforme y obpiriforme y con pedicelo largo (>20 μm). B: Oospora esférica y plerótica, pared del oogonio lisa y anteridio anfígino. Barras 20 μm. 

Caracterización molecular. La amplificación del ADN del aislamiento CH132, mediante PCR con los oligonucleótidos COIF-1 y COIR-1 originó un producto de PCR de 727 pb. El tamaño de los productos de PCR son similares a lo reportado por ^{Choi et al. (2015}) con el uso de COI. El análisis BLAST permitió determinar que el aislamiento CH132 tiene un 100% de similitud con las especies de P. capsici (No. de accesión AY129166, MH136864, MH013474, MH013475 y HQ261267). Esto se confirmó con el análisis filogenético bajo el criterio de máxima verosimilitud, donde se observa la similitud del aislado CH132 con dos de P. capsici aislados Capsicun annuum (Figura 4).

Figura 4 Análisis filogenético, de máxima verosimilitud de Phytophthora capsici con otras especies de Phytophthora del clado 2 con Pythium oopapillum grupoexterno. Los valores bootstrap (1000 repeticiones) de máxima verosimilitud en porcentajes se indican en los puntos de la rama. La barra de la escala indica 0.010 sustituciones por sitio por rama. 

La detección de cepa de P. capsici, representa un hecho de alerta, debido a que es habitante del suelo, donde sobrevive por varios años; además de la diversidad de hortalizas que ataca (^{Pérez-Moreno et al., 2005}; ^{Erwin y Ribeiro, 1996}). Asimismo, la amplia dispersión que se puede tener al emplear semillas infectadas (^{Morales-Valenzuela et al., 2002}). La baja incidencia de plantas marchitas en los sitios de muestreo, pudo deberse a que el 100% de las plantaciones de chile se establecieron por trasplante de plántulas desarrolladas en vivero, y que son áreas abiertas al cultivo de chile uno o dos años atrás, por lo que se puede esperar que aún no sea alta la incidencia del patógeno en dichas zonas. La marchitez en plantas de chile no es exclusiva del ataque de Phytophthora, también puede deberse al ataque de otros patógenos como Fusarium o Rhizoctonia (^{Vásquez et al., 2009}; ^{Anaya-López et al., 2011}; ^{Lozano et al., 2015}; ^{Pérez-Acevedo et al., 2017}). Esto puede ser posible porque en el suelo habitan una gran diversidad de microorganismos como hongos, bacterias con la capacidad de causar marchitez en el cultivo de chile (^{Pérez-Acevedo et al., 2017}). Existen especies de Fusarium no patogénicas o formas especiales que han sido probadas para reducir la incidencia y severidad de enfermedades. Es importante comprender que la ampliación del cultivo de chile hacia las zonas cacaoteras, favorece un escenario con sobrepoblaciones de Phytophthora de cacao y chile, que a mediano plazo, podría lamentarse por la reproducción sexual entre ambas especies (^{Hurtado-González y Lamour, 2009}) dada la evidencia que P. capsici está cerca de la zona cacaotera, con signo de compatibilidad A2 y que P. capsici^{Tsao y Alizadeh (1988}), cuya proporción de compatibilidad A1 supera el 95% en la planicie y de 70% en las partes altas de Tabasco (^{Ortiz-García, 1996}).

En conclusión, se identificó a P. capsici en plantas de chile habanero en zonas previamente cacaoteras (Acachapa y Colmena, Centro, Tabasco), donde el aislamiento de Phytophthora (CH132) fue patogénico en plantas de chile y no así de aislamientos de Fusarium en la prueba de patogenicidad. Por lo anterior, se sugiere que la producción de chile debe canalizarse en zonas no cacaotera de Tabasco.