El cafeto es uno de los cultivos más importantes en el mundo, debido a que es crucial para la economía de al menos 60 países y es la principal fuente de ingresos de 100 millones de personas (^{Talhinhas et al., 2017}). En México, este cultivo es estratégico ya que en su producción se emplean 500 000 productores en 14 estados y 480 municipios (^{SAGARPA, 2017}). Los principales estados productores de café cereza son Chiapas (357 733 t), Veracruz (192 341 t) y Puebla (112 228 t). En este último, el valor de la producción asciende a 778 526 miles de pesos (^{SIAP, 2018}). Sin embargo, el cultivo es afectado por la roya, enfermedad causada por el hongo Hemileia vastatrix. Los síntomas de la enfermedad se observan en hojas, inicialmente como manchas cloróticas que se tornan necróticas con el avance de la infección. El efecto varía desde defoliación menor hasta pérdida del 50% en el rendimiento (^{Avelino et al., 2015}, ^{Zambolim, 2016}; Talhinhas et al., 2017). La aplicación de fungicidas preventivos y sistémicos que contienen cobre, epoxiconazol o pyraclostrobin es la principal forma de control del patógeno en las diversas regiones productoras (Zambolim, 2016; Talhinhas et al., 2017). En México, el SENASICA impulsó un progama de control basado en un exitoso Sistema de Vigilancia que logró la contención epidémica regional del brote epidémico de 2012-2013 (^{PVEF-CAFETO, 2018}). En la Sierra Norte de Puebla, la cafeticultura se realiza tradicionalmente con un uso mínimo de insumos, lo que ha propiciado que la producción se oriente hacia el manejo orgánico, pero ha favorecido que la enfermedad se presente año tras año, causando pérdidas variables en la producción. Las variedades comúnmente utilizadas son Typica, Garnica y Mundo Novo (^{Benitez-García et al., 2015}). Diversas investigaciones han demostrado el uso potencial de biofungicidas. Estos productos son elaborados a partir de plantas y microorganismos para el control de hongos. En México se ha identificado a Acremonium byssoides, Calcarisporium arbuscula, C. ovalisporum, Sporothrix guttuliformis, Fusarium pallidoroserum, Verticillum lecanii, Simplicillium sp. y Lecanicillium sp. con potencial para controlar a H. vastatrix (^{Carrión y Rico-Gray, 2002}; ^{Gómez-De La Cruz et al., 2018}). Otros estudios realizados en condiciones de invernadero y laboratorio han indicado el potencial de biofungicidas formulados a partir de Cinnamomum zeylanicum, Cymbopogon nardus, Cymbopogon citratus, Corymbia citriodora, Melaleuca alternifolia, Thymus vulgaris, Azadirachta indica, Syzygium aromaticum y Allium sativum para el control de H. vastatrix. Este tipo de productos representa una alternativa de manejo para la producción de café orgánico, el cual es valorado a nivel mundial (^{Borges et al., 2012}; ^{Silva et al., 2014}). Su aplicación en el control de la roya es una opción de bajo costo y menor impacto ambiental, con menor riesgo en la generación de resistencia de H. vastatrix, en comparación con el uso de fungicidas sintéticos (Avelino et al., 2015; ^{Ibañez y Blackman, 2016}; Talhinhas et al., 2017). Sin embargo, es necesario analizar el efecto de formulaciones elaboradas a partir de plantas o de microorganismos en el progreso de la enfermedad bajo condiciones de campo para generar recomendaciones que puedan incorporarse a las prácticas de manejo integrado. Por tal motivo, el objetivo del presente estudio fue evaluar la efectividad de biofungicidas elaborados con Azadirachta indica (neem), Melaleuca alternifolia (árbol de té) y la combinación de Bacillus subtilis con Azadirachta indica y Syzygium aromaticum (clavo) en el control de la roya causada por H. vastatrix en dos variedades de cafeto.

En 2017, se establecieron experimentos en tres localidades del municipio de Huehuetla, Puebla: a) Lipuntahuaca (20° 04’ N y 97° 37’ O; 546 msnm), b) Chilocoyo (20° 04’ N y 97° 39’ O; 907 msnm) y c) Cinco de Mayo (20° 07’ N y 97° 37’ O; 608 msnm). En este municipio se tiene una precipitación anual de 2900 a 3600 mm, la precipitación del mes más seco es mayor de 40 mm y presenta un clima semicálido húmedo, con un rango de temperatura de 18 a 24 °C (^{INEGI, 2009}). En cada experimento se evaluó el efecto de tres biofungicidas en plantas de cafeto de las variedades Garnica y Typica (Cuadro 1).

Los experimentos se desarrollaron en condiciones de campo, en sitios rodeados con parcelas de cafeto sin aplicación de fungicidas, donde la enfermedad se presenta año tras año. Se utilizaron plantas procedentes de vivero, con cinco meses de edad desde la siembra en el semillero, sin tratamiento con fungicidas. La infección fue natural. Los experimentos en cada localidad se establecieron en un diseño de tratamientos de parcelas subdivididas con tres repeticiones (^{Villaseñor-Mir et al., 2012}). En la parcela grande se establecieron las localidades (3), en la mediana los tratamientos con y sin biofungicida (4), mientras que en las parcelas chicas estuvieron las variedades (Garnica y Typica) (2) (Villaseñor-Mir et al., 2012; ^{Santa-Rosa et al., 2016}). Cada unidad experimental estuvo constituida por tres plantas; en cada localidad se contó con nueve plantas por tratamiento en cada variedad, considerando las dos variedades se tuvieron 18 plantas en cada tratamiento. Se dio seguimiento al progreso de la enfermedad en 72 plantas por localidad, en todas las hojas de cada planta.

La infección por H. vastatrix se produjo de manera natural; la confirmación de los primeros signos y síntomas fue mediante la inspección de hojas con una lupa de 40 X y observaciones en el microscopio estereoscópico y compuesto (^{SENASICA, 2019}). Se dio seguimiento al progreso de la enfermedad mediante siete evaluaciones y la estimación de las siguientes variables (^{Campbell y Neher, 1994}): 1) Incidencia, calculada como el porcentaje de hojas enfermas respecto al total de hojas por planta; 2) Severidad en hoja, calculada como el porcentaje de área foliar dañada en cada hoja de la planta mediante una escala diagramática (^{SINAVEF, 2013}); 3) Severidad total, evaluada mediante el promedio de la severidad observada en cada una de las hojas en la planta, en cada fecha de evaluación.

La evaluación de la enfermedad se realizó a los dos días después de la primera aplicación (dpa), a los ocho dpa, 16 dpa, 29 dpa, 36 dpa, 43 dpa y a los 51 dpa. Con los valores de severidad total se estimó el área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) (^{Simko y Piepho, 2012}) expresada en la siguiente ecuación:

Donde:

Y _i = intensidad de la enfermedad

t= periodo de evaluación (tiempo)

n= número de evaluaciones

Los datos de incidencia y severidad se sometieron a la comprobación de los supuestos de normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk y de homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Levene (^{Zar, 1999}). Al no resultar datos normales, los porcentajes de incidencia y severidad fueron transformados al arcoseno de la raíz cuadrada del valor porcentual. Los datos transformados fueron sometidos a un análisis de varianza con el procedimiento ANOVA en el paquete estadístico SAS versión 9.4 (Statistical Analysis System, Cary, North Carolina) para identificar las diferencias entre localidades y tratamientos, así como las interacciones. Adicionalmente, se realizaron análisis de varianza por cada fecha de evaluación. Las medias se compararon mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (p≤0.05) (^{Steel y Torrie, 1985}). El análisis incluyó el ANOVA del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) con base en la severidad estimada a partir de los datos transformados, así como la estimación de la tasa de infección aparente con la transformación de los porcentajes del área foliar dañada mediante ln(x/(1-x)) y considerando el tiempo de seguimiento de la enfermedad (^{APS, 2019}).

Se observaron diferencias estadísticamente significativas (p≤0.01) entre localidades y biofungicidas (p≤0.05) tanto para la incidencia de la roya como para la severidad. Sin embargo, no se observaron diferencias entre variedades respecto a la incidencia de la roya, aunque el análisis de varianza indicó diferencias para la severidad (Cuadro 2). A los dos dpa las plantas testigo y las tratadas con la mezcla de B. subtilis + A. indica + S. aromaticum tuvieron valores de incidencia de 9.5% y 8.7%, respectivamente, seguidas de las plantas tratadas con A. indica (14.2%) y M. alternifolia (18.9%) (Figura 1A). Este patrón se observó también a los ocho dpa y estuvo más asociado a la expresión natural de la enfermedad en focos de agregación que al efecto de los biofungicidas (^{Quiñones-Valdéz et al., 2015}). A partir de los 16 dpa, los niveles de incidencia incrementaron en todos los tratamientos, pero no se detectaron diferencias significativas. Sin embargo, la tasa de infección aparente (r) permitió diferenciar el nivel de avance de la enfermedad entre los ocho dpa y 16 dpa en cada tratamiento, donde la mayor tasa de infección se observó en las plantas asperjadas con la mezcla de B. subtilis + A. indica + S. aromaticum (r=0.16), seguidas del testigo (r=0.14), las tratadas con A. indica (r=0.08) y las tratadas con M. alternifolia (r=0.04). Lo anterior indica que el biofungicida elaborado con M. alternifolia disminuyó el avance de la enfermedad en comparación con los demás tratamientos.

Figura 1. Progreso de la roya causada por Hemileia vastatrix en plantas jóvenes de cafeto tratadas con biofungicidas en condiciones de campo en Huehuetla, Puebla. A) Incidencia, B) Severidad total. La incidencia y severidad total se compararon estadísticamente con valores transformados (* = p≤0.05; ns=no significativo). En la figura se presentan valores no transformados. La flecha indica el momento de la aplicación de fungicida. TE=Testigo, AI= Azadirachta indica, MA=Melaleuca alternifolia y BA+AI+SA= Bacillus subtilis + A. indica + Syzygium aromaticum. Las barras representan el error estándar de la media en cada evaluación. 

A partir de los 29 dpa y hasta los 51 dpa, las plantas tratadas con M. alternifolia fueron las que presentaron la menor incidencia de roya (p≤0.05, en cada fecha de evaluación) en comparación con los otros tratamientos. Este comportamiento se observó en ambas variedades y pudo deberse al efecto acumulado de la primera y segunda aplicación de este biofungicida. A los 51 dpa la incidencia de las plantas tratadas con M. alternifolia fue de 34.4%, mientras que en las plantas testigo fue de 43.5%; mientras que las diferencias en la incidencia final entre las plantas testigo y las asperjadas con B. subtilis + A. indica + S. aromaticum (44.2%) y A. indica (41.5%) no fueron significativas (Figura 1A).

Estos resultados, indican que la aplicación del biofungicida formulado con M. alternifolia redujo la infección del hongo entre las hojas y a nivel de planta en las tres localidades. Resultados similares fueron reportados por ^{Borges et al. (2012}), quienes observaron una reducción de la incidencia de la roya del cafeto al aplicar aceites esenciales de M. alternifolia en comparación a las plantas testigo y a las plantas asperjadas con A. indica. Respecto a la severidad total, a partir de los 16 dpa y hasta los 51 dpa las plantas tratadas con M. alternifolia presentaron menor severidad, con valores menores a 2.5%. Mientras que las plantas tratadas con la mezcla de B. subtilis + A. indica + S. aromaticum, así como las tratadas con A. indica y el testigo alcanzaron severidades entre 3.2 y 3.8%. Las diferencias de los valores de severidad entre tratamientos no fueron significativas desde los 2 dpa y hasta los 43 dpa. Sin embargo, en la última evaluación (51 dpa), se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (p≤0.05), donde las plantas testigo alcanzaron los mayores valores de severidad (3.8%), seguidas de las plantas tratadas con B. subtilis + A. indica + S. aromaticum y las tratadas con A. indica con severidades de 3.3% y 3.6% respectivamente, los que a su vez fueron iguales estadísticamente (p≤0.05), mientras que las plantas tratadas con M. alternifolia tuvieron los menores porcentajes de área foliar dañada (2.5%) (Figura 1B).

Estos resultados coinciden con lo documentado por ^{Borges et al. (2012}), quienes reportaron una mayor eficiencia de M. alternifolia en la disminución del progreso de la enfermedad en comparación con A. indica, mientras que ^{Haddad et al. (2009}) reportaron una disminución de la intensidad de la enfermedad mediante la aplicación de aislamientos de Bacillus sp. ^{Medice et al. (2007}) reportaron una reducción del 35.0% al 62.0% de la severidad de la roya asiática de la soya (Phakopsora pachyrhizi) en diferentes variedades tratadas con aceites esenciales de tomillo (Thymus vulgaris), citronela (Cymbopogon nardus), eucalipto (Corymbia citriodora) y neem (Azadirachta indica). En nuestros experimentos, el biofungicida elaborado con M. alternifolia, redujo 20.9% la incidencia de H. vastatrix respecto a las plantas testigo. M. alternifolia, A. indica y B. subtilis + A. indica + S. aromaticum redujeron la severidad de la enfermedad 35.1%, 5.5% y 13.7% respectivamente, en comparación con la severidad de las plantas testigo. Borges et al. (2012) encontraron resultados similares, donde la incidencia y la severidad se redujo 12.1% y 55.4%, respectivamente, al utilizar aceites esenciales del árbol del té (M. alternifolia); no se presentaron diferencias estadísticamente significativas en la severidad de las plantas asperjadas con aceite esencial de neem (A. indica) y el testigo. En estos experimentos la aplicación de M. alternifolia limitó el progreso de la enfermedad e infección del hongo, pero no evitó incrementos en el tiempo.

El análisis de varianza del ABCPE con base en la severidad y de la tasa de infección aparente indicó diferencias significativas entre tratamientos (p≤0.05). Aunque el biofungicida elaborado con M. alternifolia disminuyó el progreso de la enfermedad, la prueba de medias no indicó diferencias significativas respecto al testigo, lo cual pudo deberse a la variación en los niveles de severidad registrados en las primeras evaluaciones, como resultado del proceso de infección inicial y de la reciente aplicación del biofungicida. La comparación de medias del ABCPE indicó que la aplicación de A. indica no limitó el progreso de la enfermedad e incluso fue superior al testigo (Cuadro 3). Sin embargo, la prueba de medias realizada con la tasa de infección aparente indicó diferencias significativas entre los tratamientos (p≤0.05), donde M. alternifolia tuvo la menor tasa de infección (r=0.028), mientras que el testigo tuvo el mayor valor (r=0.046); en términos porcentuales la reducción de la tasa de infección aparente con respecto al testigo fue 39.1% con M. alternifolia.

^{Haddad et al. (2009}) reportaron que la aplicación de Bacillus sp. fue efectiva para el control de H. vastatrix; también mencionaron que ciertos aislamientos no presentaron diferencias significativas debido a condiciones ambientales desfavorables para este agente de control biológico. Es probable que la respuesta del aislamiento en la formulación del biofungicida a base de Bacillus sp. se deba a su baja adaptabilidad a las condiciones ambientales de los sitios experimentales. Esto evidencía la necesidad de generar formulaciones con aislamientos obtenidos en cada zona cafeticultora, ya que el control de la enfermedad mediante formulaciones comerciales a base de microorganismos puede llevar a una baja eficiencia en el control por efecto de las condiciones ambientales de cada zona.

La incidencia y severidad presentaron diferencias significativas entre localidades (p<0.01); en la localidad de Chilocoyo se presentaron los mayores valores de incidencia y severidad final de la enfermedad, mientras que la localidad de Lipuntahuaca tuvo la menor incidencia y severidad (Figura 2). Las plantas de la variedad Garnica tuvieron una incidencia en el rango de 29.0% a 55.0% mientras que en las plantas de la variedad Typica los valores estuvieron en el rango de 24.7% a 48.2%; de acuerdo con el análisis de varianza, las variedades Typica y Garnica no presentaron diferencias significativas en los niveles de incidencia en cada una de las localidades (Figura 2A). Respecto a la severidad promedio, la variedad Typica alcanzó valores entre 1.7% y 3.5%, mientras que la variedad Garnica tuvo valores entre 2.9% y 4.8%. Estas variedades tuvieron diferencias significativas en la severidad únicamente en la localidad de Lipuntahuaca (p≤0.01), donde la variedad Garnica fue más susceptible a la enfermedad (Figura 2B). De acuerdo con lo reportado en los informes del Programa de Vigilancia de la Roya del Cafeto las variedades Garnica y Typica son las que han sido mayormente afectadas por la roya en comparación con otras variedades como Geisha, Costa Rica y Catimor (^{PVEF-CAFETO, 2018}).

Figura 2. Comportamiento de la roya del cafeto en plantas jóvenes de dos variedades evaluadas por localidad en condiciones de campo en Huehuetla, Puebla. A) Incidencia, B) Severidad. La incidencia y severidad se compararon estadísticamente con valores transformados. En las barras se presentan valores no transformados. TY=Typica, GA=Garnica. Barras con la misma letra en la misma localidad son estadísticamente iguales (Duncan, p≤0.05). Las barras representan el error estándar de la media en cada evaluación. 

La enfermedad no se erradicó con el uso de los biofungicidas, sin embargo, las aplicaciones de M. alternifolia disminuyeron la infección del hongo causante de la roya del cafeto a nivel de planta; además mostraron una tendencia a disminuir el progreso de la enfermedad después de dos aplicaciones, es decir, a los 29 días después de la primera aplicación; aunque no evitó que se incrementara fue el tratamiento con la menor tasa de infección aparente (r=0.028, p≤0.05). Al utilizar M. alternifolia, el porcentaje de reducción de la enfermedad con respecto al testigo, al final de la evaluación, fue 20.9% para la incidencia, 35.4% para la severidad, 14.2% en el ABCPE y 39.1% en la tasa de infección aparente. Las variedades Typica y Garnica no presentaron diferencias significativas en la incidencia y severidad de H. vastatrix, excepto en la localidad de Lipuntahuaca donde la variedad Garnica tuvo mayor daño foliar debido a la roya. El uso de extractos de M. alternifolia para el control de la roya en plantas jóvenes de cafeto podría combinarse con prácticas de manejo integrado, como una alternativa compatible con los principios de la producción sustentable de café orgánico. Sin embargo, estos resultados sugieren que la investigación debe continuar, considerando un mayor control de inóculo, dosis alternativas, plantas en edad productiva y periodo de mayor intensidad epidémica regional.