En México, la producción de chile es afectada por plagas y enfermedades. En los últimos años, la mosca blanca se ha convertido en la principal transmisora de enfermedades inducidas por el género Begomovirus y han ocasionado pérdidas de producción de al menos 95% (^{García et al., 2010}). Para el control de esta plaga se implementan diferentes insecticidas; sin embargo, su uso genera contaminación e inducen resistencia en las poblaciones insectiles e inclusive con mayor agresividad (^{George et al., 2015}). Por otro lado, en el cultivo de chile habanero (Capsicum chinense) con denominación de origen de la península de Yucatán, se tiene el interés de implementar tecnologías basadas en la resistencia vegetal con el fin de reducir pérdidas de producción causadas por virosis de esta interacción. Una estrategia para el manejo de virosis y mejorar la producción en este cultivo, es el uso de plantas injertadas donde se aprovechan las cualidades que confiere el portainjerto y las propias del injerto de interés comercial. Investigaciones previas en cultivos de sandía y jitomate, mostraron la eficacia del uso de portainjertos donde se confirió tolerancia a un complejo de virus como: Cucumber mosaic virus (CMV), Watermelon mosaic virus II (WMV-II), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) y Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (^{Wang et al., 2002}); y en este aspecto, la opción de usar portainjertos silvestres tolerantes se presenta como una solución en campo al problema de virosis. El objetivo de este trabajo fue estimar bajo condiciones de campo la tolerancia del injerto de Capsicum chinense-Capsicum annuum var. glabriusculum a begomovirus.

Área de estudio y material genético. El estudio se realizó con un productor cooperante en el estado de Yucatán, México, en una parcela ubicada entre 20° 58´ 40” N y 89° 26´ 30” W a una altitud de 8 m sobre nivel del mar. Se utilizaron dos variedades como injertos; habanero criollo y habanero jaguar (C. chinense), y como portainjertos amashito y muela (C. annuum var. glabriusculum) colectados en traspatio y selva aledaña.

Obtención de los injertos. Para favorecer la germinación de las semillas de los portainjertos, se sumergieron en ácido giberélico a 500 ppm por 24 h, posteriormente se sembraron en charolas de poliestireno de 200 cavidades en Sunshine #3^® + Agrolita^® en relación 2:1 como sustrato. Ocho días posteriores se sembraron las variedades comerciales de chile habanero utilizadas como injertos. Las plantas se injertaron mediante la técnica de púa terminal, cuando el tallo de los portainjertos y los injertos tuvieron 2 mm de diámetro. Las plantas injertadas se mantuvieron por 21 días en una cámara húmeda de adaptación a 80% de humedad relativa y 27 °C, posteriormente estuvieron por 14 días en un invernadero tipo túnel de 450 luxes para su adaptación y crecimiento.

Establecimiento del experimento. El cultivo se estableció bajo un sistema de riego por goteo y de producción regional, con una distancia de 1.2 m entre surcos y 0.40 m entre plantas. La textura del suelo según análisis previo fue franco-arcillosa. El programa de fertilización consistió: N-N0_3, 9.29, N-NH_4, 1.33, P-PO_4, 1.42, K, 4.85, Ca, 4.32, Mg, 1.68, S-SO4, 2.56, Na⁺, 0.19, Cl^-, 0.13 y HCO3^-, 0.01 meq L^-1, respectivamente; con modificaciones según los requerimientos del cultivo. Se implementó un diseño experimental de bloques completos al azar, se establecieron seis tratamientos con cuatro repeticiones: amashito + habanero criollo, amashito + habanero jaguar, muela + habanero criollo, muela + habanero jaguar y como testigos habanero criollo y habanero jaguar. Cada repetición constó de 30 plantas. El ciclo de producción fue de primavera-verano (12 de febrero a 25 de agosto de 2018) y sin la aplicación de plaguicidas.

Fluctuación poblacional de mosca blanca. Con el propósito de asociar la presencia de begomovirus con el vector, a partir del primer día del trasplante y hasta el final del ciclo del cultivo, se realizaron monitoreos de 10 plantas por repetición cada 10 días con la ayuda de un visor de monitoreo el cual consiste en un bote cilíndrico de 40 L, abierto por los extremos y con un orificio a un costado, uno de los extremos se tapa con polietileno transparente y el otro se coloca encima de la planta; por el orificio se sacude la planta con una varilla de madera y las moscas vuelan hacia el polietileno en donde se hace el conteo.

Incidencia y severidad de virosis. En cada tratamiento se cuantificó el número de plantas (cada 10 días) enfermas con deformaciones, mosaicos dorados, arrugamientos y acucharamientos. Las plantas con estas características se dividieron entre el número total de plantas por 100. También se estimó la severidad viral, mediante una escala de severidad pictórica de cinco clases elaborada por el grupo de trabajo (Figura 1). Los puntos medios de severidad de cada clase de la escala propuesta se obtuvieron con el programa 2-Log Ver. 1.0 (^{Mora et al., 2000}). Con los datos obtenidos se construyeron curvas del progreso de la enfermedad y se estimó la intensidad de la enfermedad con los siguientes parámetros epidemiológicos: Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), tasa de infección aparente (con el modelo Weibull mediante su parámetro 1/b) y severidad final (Y_final) (^{Morales, 2011}).

Rendimiento. En cada cosecha se registró el número de frutos por planta y el rendimiento potencial (t ha^-1). Se seleccionaron 30 frutos al azar por tratamiento y se midió el largo y diámetro ecuatorial, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NOM-189-SCFI-2017 de chile habanero de la Península de Yucatán.

Análisis estadísticos. Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza y la separación de medias se hicieron con el método de SNK (P≤0.05) con el paquete estadístico SAS ver. 9.11.

Identificación molecular de begomovirus. La extracción de ADN se realizó de acuerdo al protocolo de DNAzol ^® Reagent según el proveedor (Life technologies) con modificaciones. De cada tratamiento y por cada repetición, se colectó una muestra foliar de tejido joven a partir de brotes nuevos (10 g) de 24 plantas con síntomas característicos de virosis a los 120 días después del trasplante (ddt). La detección de begomovirus se realizó (en las 24 muestras colectadas) por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) bajo las siguientes condiciones: un ciclo a 94 °C durante 30 s, 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y finalmente un ciclo de 72 °C durante 30 s. En un tubo eppendorf se preparó una mezcla de reacción con los iniciadores AV494 (5´-GCCYATRTAYAGRAAGCCMAG-3´) y AC1094 (5´-GGRTTDGARGCATGHGTACATG-3´); los cuales amplifican un segmento de la proteína de 600 pb de la cápside del género Begomovirus (^{Villanueva et al., 2013}). Con el fin de observar los productos finales de PCR, se realizó la electroforesis en gel de agarosa al 1% en un equipo Applied Biosystems teñido con bromuro de etidio, y en un fotodocumentador UVP (Científica Sienna). A partir de las muestras positivas, se seleccionaron al azar seis muestras para la secuenciación en ambos sentidos a Macrogen, Corea. El análisis in silico de las secuencias nucleotídicas obtenidas se realizó mediante comparaciones con las secuencias de la base de datos del NCBI, (National Center for Biotechnology Information), median te el programa BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool).

Fluctuación poblacional de mosca blanca. El primer registro poblacional en el cultivo fue los a 40 ddt y a los 90 ddt se cuantificó el mayor promedio de insectos por planta en habanero jaguar con 32 insectos. Al final del experimento, habanero jaguar y habanero criollo (tratamientos sin injertar), presentaron mayor promedio del putativo vector con 22 y 17 individuos por planta, respectivamente; mientras que en los tratamientos donde se realizaron los injertos (muela + habanero jaguar, muela + habanero criollo, amashito + habanero jaguar y amashito + habanero criollo) mostraron menor población que oscilaron entre 5.5 a 14.5 insectos por planta (Figura 2). En un estudio con injertos de jitomate reportaron menor población de poblaciones de Bactericera cockerelli, Liriomyza spp. y áfidos (^{Cortes, 2010}). Este efecto se ha explicado como una antixenosis, es decir, el insecto se alimenta de plantas poco preferidas e incluso se reproduce en ellas, pero cuando hay plantas con mayor susceptibilidad, como los testigos sin injertar, éstas son preferidas por los insectos.

Figura 1 Escala pictórica de severidad en el patosistema Capsicum chinense-begomovirus. 

Incidencia y severidad de virosis. Al final del cultivo, las menores incidencia de la enfermedad se observaron en muela + habanero criollo con 65 % y muela + habanero jaguar con y 73 % (Figura 3), el resto de los tratamientos las incidencias de la enfermedad fueron del 95 al 100 %.

Figura 2. Fluctuación poblacional de mosca blanca en plantas injertadas y plantas testigo de habanero criollo y jaguar cultivados bajo condiciones de campo en Yucatán. Ciclo: Primavera-Verano. 

La severidad se registró a partir de los 40 ddt, los síntomas en follaje consistieron en deformaciones, mosaicos dorados, arrugamientos y acucharamientos. De acuerdo con la escala pictórica de severidad empleada, los tratamientos que mostraron los mayores porcentajes de severidad final de virosis fueron en habanero jaguar y habanero criollo con 62 y 58% (clase 2). En estos tratamientos la severidad incrementó en 44 y 48%, en su orden en relación con muela + habanero criollo que permitió el 24% de severidad final (clase 1) (Figura 4).

Figura 3. Incidencia de virosis en plantas injertadas de Capsicum chinense-Capsicum annuum cv. glabriusculum, bajo condiciones de campo en Yucatán. Ciclo: Primavera-Verano. 

En muela + habanero criollo, se presentó un valor inferior de 746.6% por día del ABCPE con respecto al habanero criollo y el habanero jaguar que mostraron la mayor intensidad de la enfermedad con 2115.1 y 2341.2% por día. La menor tasa de infección aparente se registró en los tratamientos injertados, en particular en muela + habanero criollo, por lo que la sanidad de las plantas fue mejor que del resto de los tratamientos. Al final del cultivo, los tratamientos injertados, tuvieron una tendencia menor en la Y_final, también en muela + habanero criollo permitió el menor promedio de la Y_final (Cuadro 1). Trabajos realizados con injertos de sandía, disminuyeron el ABCPE y mejoraron el rendimiento del cultivo (^{Winmer et al., 2015}). En otro estudio demostraron que el uso de plantas injertadas en pimiento mejoró el comportamiento agronómico y el manejo de diversas plagas y enfermedades (^{Sánchez et al., 2015}). El uso de injertos, provee plantas vigorosas, capaces de permitir el crecimiento del cultivo en presencia de fitoparásitos (^{Acevedo y Sánchez, 2017}). También, se ha reportado que plantas injertadas pueden activar mecanismos de defensa; en plantas de tabaco los injertos promovieron la acumulación de compuestos fenólicos y ácido salicílico, lo que estimuló la actividad de peroxidasa, y se disminuyó la replicación del el Potato Y virus (PVY^NTN) y solo se manifestaron síntomas leves (^{Spoustová et al., 2015}). Por otro lado, los mecanismos de resistencia en plantas injertadas de jitomate contra Pseudomonas solanacearum estuvieron asociadas con el portainjerto, en particular en la parte inferior del tallo donde se formaron tilosas (^{Grimault et al., 1994}). Se sabe que plantas injertadas comparten rasgos epigenéticos, lo que las hace mantener sus genomas originales, aun cuando no comparten ADN, pero la información epigenética se establece dentro de las plantas (^{Fuentes et al., 2014}), lo que podría explicar, la respuesta tolerante a begomovirus en este estudio con plantas injertadas.

Figura 4. Severidad de virosis en plantas injertadas de Capsicum chinense-Capsicum annuum cv. glabriusculum, bajo condiciones de campo en Yucatán. Ciclo: Primavera-Verano. 

Rendimiento. El ciclo del cultivo fue de 130 días después del trasplante y se realizaron seis cosechas. El análisis de varianza mostró diferencias significativas (P≤0.01). Los tratamientos injertados tuvieron mayor rendimiento, en particular amashito + habanero criollo, amashito + habanero jaguar y muela + habanero criollo con un rendimiento potencial estimada de 18.3, 18.4 y 18.4 t ha^-1 (Cuadro 2). Las plantas injertadas poseen tolerancia a varios ambientes estresantes, como sequía, salinidad, plagas y enfermedades; por lo que mejoran la absorción de agua y nutrientes, y con ello un crecimiento vigoroso, prolongación del periodo de crecimiento e incremento en el rendimiento (^{Acevedo y Sánchez, 2017}). En muela + habanero jaguar, se tuvo la menor rendimiento potencial estimada con 9.8 t ha^-1. Aunque los portainjertos a menudo se realizan para proporcionar mayor rendimiento, en ocasiones pueden reducirlo, por la compatibilidad con la planta a injertar. En solanáceas y cucurbitáceas, el injerto sobre patrones vigorosos logró incrementar la producción, aunque dependió de la combinación portainjerto-variedad y las condiciones de cultivo (^{Di Gioia et al., 2010}).

Frutos. Se observaron diferencias significativas (P≤0.01) en el tamaño de fruto (Cuadro 2).

De acuerdo con la NOM-189-SCFI-2017, establece parámetros aceptables de 3.8 a 5.5 cm de largo y de 2.5 a 3.0 cm de ancho para el chile habanero. Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que todos los tratamientos cumplen con los parámetros establecidos de la NOM, con un rango de 4.6 a 4.8 cm de largo y de 2.8 a 3.0 cm de diámetro (Cuadro 2).

Secuenciación, análisis e identificación de begomovirus. La secuenciación de las seis muestras positivas a begomovirus mostraron una homología del 83 al 91% de identidad nucleótida con dos aislados, el DZI03W20 y el GU355941.1 del GenBank mediante BLASTn que correspondieron a Pepper golden mosaic virus (PepGMV) y al Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). El 84% fueron bipartita y correspondieron a los tratamientos amashito + habanero criollo, amashito + habanero jaguar, muela + habanero criollo, muela + habanero jaguar y habanero jaguar y el 16% monopartita detectado en el tratamiento habanero criollo. Las secuencias permitieron identificar con seguridad la presencia de begomovirus, aunque se recomienda utilizar oligonucleótidos específicos para cada uno de los virus preliminarmente identificados. Solamente uno de los productos de PCR enviados a secuenciar resultó con un porcentaje de homología del 83%, este porcentaje puede estar asociado con la presencia de bases no definidas (N) en algunas de las posiciones de la secuencia resultante o a otra especie de begomovirus. Sin embargo, este porcentaje realmente es mayor si se considera la edición con base al cromatograma correspondiente; proceso no realizado en los datos reportados. En el caso de los begomovirus, se ha establecido que la secuencia de una especie con una homología ≥91% con todo el genoma o parte del componente DNA-A, significa que se trata de la especie en cuestión, mientras que si se tiene una homología <91%, entonces debe considerarse una especie nueva (^{Brown et al., 2015}).

Con base en los resultados, los injertos de muela + habanero criollo confirieron mayor tolerancia a virosis y tuvo menor población de mosca blanca. Los injertos amashito + habanero jaguar, amashito + habanero criollo y muela + habanero criollo mostraron mejor comportamiento agronómico y productividad del cultivo.