Materiales Y Métodos

Aislamiento de hongos. Durante el período de 2013 a 2015, se recolectaron cálices y hojas de jamaica así como hojas de malezas asociadas al cultivo con síntomas de lesiones necróticas en diferentes localidades del estado de Guerrero. En laboratorio se sembraron secciones de tejido foliar de la zona de avance de las lesiones (previamente desinfestadas con hipoclorito de sodio al 1%) en cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA). Las colonias obtenidas se purificaron mediante la técnica de cultivo monospórico.

Morfología y tasa de crecimiento de la colonia. A partir de cultivos monospóricos de 5 días de edad, se obtuvieron fragmentos del margen de las colonias de aproximadamente 0.5 cm de diámetro (^{Qi et al., 2011}), los cuales se sembraron en el centro de nuevas cajas Petri con PDA y se incubaron a 28 °C (tres repeticiones por aislado) (^{Onesirosan et al., 1974}). El diámetro de las colonias se midió cada 24 h durante cinco días considerando la longitud media de dos diámetros en ángulo recto (Qi et al., 2011). Con estos datos se calculó la tasa de crecimiento con la siguiente fórmula: Velocidad de crecimiento = (Df-Di)/(Tf-Ti), donde: Df = Diámetro final de crecimiento, Di= Diámetro inicial de crecimiento, Tf=Tiempo final y Ti= Tiempo inicial.

Morfología de conidios. Con una cámara AmScope^® MU 1000 fijada a un microscopio óptico Eclipse Ci (Nikon^®, Japón), se obtuvieron imágenes digitales de los conidios obtenidos de cada aislado monospórico de cinco días de edad. Se midieron 50 conidios (largo x ancho) y se registraron sus formas. Las mediciones se hicieron con una reglilla micrométrica con la cual se calibró el analizador de imágenes ImageTool^® v3.0. (^{Hernández et al., 2005}). Los datos de tasa de crecimiento, tamaño y morfología de conidios se tabularon y sometieron a un análisis de varianza y separación de medias (Duncan, α=0.01) en el programa SAS ver. 9.4.

Extracción de DNA, amplificación por PCR y secuenciación. Se realizó con el protocolo descrito por ^{Sambrook y Rusell (2001}) a partir del micelio de colonias monospóricas de 12 días de edad mantenidas a 28 °C en cajas Petri con PDA. Se amplificó un segmento del gen EF-1α con los iniciadores EF1-728F/EF1-986R (^{Carbone y Kohn, 1999}). La mezcla de reacción de PCR consistió en 2 µL de buffer de PCR 1X, 0.6 µL de MgCl₂ 2.0 μM, 0.2 µL de dNTP´s 0.2 mM, 0.6 µL de cada uno de los iniciadores (10 µM), 0.1 µL de Taq DNApolimerasa 0.5 U (Promega^®, EE.UU.) y 10 ng del DNA extraído del hongo. La mezcla final se ajustó con agua ultra-pura estéril a un volumen final de 10 μL, y se amplificó en un termociclador (Techne-TC-512^®, EE.UU.) con el programa descrito por ^{Shimomoto et al. (2011}). Los amplicones obtenidos se purificaron con Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega^®, EE.UU.) y se secuenciaron en ambas direcciones en Macrogen Inc^®.

Análisis filogenético. Las secuencias obtenidas de cada aislado se editaron y alinearon para obtener una secuencia consenso con el módulo SeqMan Pro del programa DNASTAR LaserGene^®. El árbol filogenético se realizó con el método Neighbour-joining (NJ) (^{Saitou y Nei, 1987}) usando las distancias genéticas calculadas con el modelo de dos parámetros (^{Kimura, 1980}) con el programa MEGA versión 7.0. Para la reconstrucción del árbol filogenético, se utilizó como organismo fuera de grupo la secuencia parcial disponible en el GenBank del gen EF-1α de Corynespora smithii (No. de acceso AB539437). Las secuencias obtenidas de los aislados de C. cassiicola en estudio se depositaron en el GenBank con los números de acceso MF000841-MF000888 y se compararon con otras secuencias disponibles para esta especie (AB539285, AB539271, AB539291, AB539301, AB539235, AB539260, KY082897, KY290565, KP735616, KP834309, KP834310, AB539270, AB539283 y AB539269).

Resultados

En total se obtuvieron 48 aislados de C. cassiicola, 39 de plantas de jamaica y nueve de malezas asociadas a este cultivo, distribuidas en cuatro municipios y 15 localidades del estado de Guerrero (Cuadro1).

Figure 1 Morphological diversity of Corynespora cassiicola isolates obtained from roselle plants (Hibiscus sabdariffa) and weeds associated with the crop.  

Figura 2 Diversidad morfológica de conidios de aislados de C. cassiicola obtenidos de jamaica y malezas asociadas al cultivo. Barra=30 µm. 

Figura 4 Distribución en porcentaje de contornos de conidios de aislados de C. cassiicola obtenidos de jamaica y malezas asociadas al cultivo. 

Figura 5 Distribución en porcentaje de formas de conidios de aislados de C. cassiicola obtenidos de jamaica y malezas asociadas al cultivo. 

Morfología y tasa de crecimiento de la colonia. Las colonias desarrolladas en PDA tuvieron crecimiento uniforme, abundante micelio aéreo y su morfología mostró variación entre los aislados (Figura 1). La coloración de la parte frontal de las colonias fue blanca, gris o verde y el centro de las mismas fue blanca, café, café claro, café oscuro, gris o gris oscuro. La textura observada desde la parte frontal fue de ligera a gruesa y la forma de crecimiento de las colonias fue de redonda a poligonal (Cuadro 2). Las tasas de crecimiento promedio y el tamaño de las colonias mostraron diferencias significativas entre los aislados (Cuadro 3). En el aislado CC33GRO se registró la mayor tasa de crecimiento con 0.67 centímetro/día (cm/d), así como el mayor diámetro promedio (5.07 cm) con respecto de los aislados CC07GRO y CC36GRO que tuvieron la menor tasa de crecimiento y diámetro promedio de colonia (Cuadro 3).

Morfología de conidios. Se observó un alto grado de diferencia morfológica de conidios entre los diferentes aislados analizados. Las formas de los conidios observados fueron: ovales, obclavadas y cilíndricas con contornos rectos o curvos (Cuadro 3, Figuras 2, 4 y 5). El tamaño promedio máximo y mínimo varió de 8.4-305.4 µm x 2.9-23.0 µm (largo x ancho, respectivamente); el número de pseudoseptos fue de 0 a 15. Se encontraron diferencias estadísticas significativas entre aislados (Cuadro 3). Predominaron las formas de conidios cilíndricas (73%) seguidas de las obclavadas (24.75%) y ovales (2.25%) (Figura 5). El aislado CC9GRO presentó el mayor tamaño promedio de conidio (111.68 µm), mientras que el promedio más ancho correspondió al aislado CC17 (8.38 µm). La menor longitud promedio se observó en los aislados CC21GRO y CC50GRO (28.31 µm y 28.39 µm, respectivamente) y los conidios menos anchos en promedio fueron los del aislado JIT (5.12 µm). El mayor número promedio de pseudoseptos se tuvo en el aislado CAP (cinco pseudoseptos) y el menor promedio en PAS (0.62 pseudoseptos) (Cuadro 3).

Análisis filogenético. Los 48 aislados de C. cassiicola del presente estudio se dividieron en dos grupos: grupo uno, integrado por 37 aislados obtenidos de jamaica y ocho aislados de malezas asociadas al cultivo; grupo dos, formado por dos aislados obtenidos de jamaica y uno obtenido de una maleza asociada al cultivo (Figura 3).

Discusión

Entre los diferentes aislados analizados de C. cassiicola, se registró un alto grado de diferencias en color, textura, forma y tamaño de las colonias, así como en forma, tamaño, contorno y número de pseudoseptos de los conidios (Cuadros 2 y 3, Figuras 2, 4 y 5); lo que coincide con reportes realizados por otros autores (^{Onesirosan et al., 1974}; ^{Nghia et al., 2008}; ^{Qi et al., 2011}). Asimismo, se observaron diferencias genéticas considerando el análisis de un segmento del gen EF-1a, misma que se reportó en Japón por ^{Shimomoto et al. (2011}) en aislados de C. cassiicola obtenidos de Cucumis sativus, Solanum lycopersicun, Capsicum annuum, entre otras especies vegetales. El análisis comparativo entre las secuencias de los aislados del presente estudio con otras disponibles en el GenBank mostró que los aislados del grupo uno se asociaron con aquellos obtenidos de especies de las familias Apocynaceae (14%), Ericaceae (29%) y Solanaceae (57%), provenientes de Japón, EE.UU. e India; mientras que los del grupo dos, se relacionaron con los obtenidos de especies de las familias Ericaceae (14%), Lamiaceae (14%), Asteraceae (29%) y Cucurbitaceae (43%) provenientes de China, Japón, EE.UU. y Países Bajos. Los resultados anteriores indican que los aislados mexicanos de C. cassiicola pertenecientes al grupo uno están más relacionados con aquellos obtenidos de plantas de la familia Solanaceae, mientras que los del grupo dos se encuentran más asociados con especies de la familia Cucurbitaceae. Por otra parte, dentro del grupo uno se observó una tendencia a formar un sub-grupo de aislados recolectados de malezas asociadas al cultivo de jamaica en México (^{Hernández et al., 2018}): JIT (Solanum lycopersicum (forma silvestre), M26 (Chromolaena odorata), PAS (Pasiflora viridiflora), MAT (Momordica charantia) y CAP (Eugenia oerstediana). Los aislados del grupo uno se recolectaron en los municipios de Ayutla, Tecoanapa, Xochistlahuaca y San Marcos, mientras que los del grupo dos, procedieron del municipio de Ayutla (Figura 3; Cuadro 1). Al respecto, se observó que este agrupamiento tuvo cierta relación con el lugar de origen, lo cual fue reportado por otros autores (^{Silva et al., 2003}; ^{Smith et al., 2009}). ^{Dixon et al. (2009}), analizaron diversos aislados de C. cassiicola provenientes de 68 especies vegetales colectadas en Samoa americana, Brasil, Malasia, Micronesia y EE.UU. y determinaron que aquellos geográficamente distintos pero obtenidos de la misma especie vegetal eran muy similares genéticamente, lo cual sugería cierto grado de especialización con el hospedante (^{Sumabat et al., 2018}). La especificidad de aislados de C. cassiicola con su hospedante también ha sido sugerida en el caso de papayo, tomate y pepino (^{Silva et al., 2018}).

Figura 3. Árbol filogenético de aislados de Corynespora cassiicola obtenidos de jamaica y malezas asociadas al cultivo, basado en datos de secuencias parciales del gen EF-1a. Corynespora smithii fue utilizado como organismo fuera de grupo. 

Sin embargo, hasta la fecha no es posible establecer de manera definitiva una asociación de los grupos filogenéticos de C. cassiicola con su origen geográfico u hospedantes (^{Deon et al., 2014}). Además de esto último, trabajos posteriores podrían enfocarse en explorar la variabilidad patogénica de C. cassiicola de los grupos formados considerando la amplificación de otras regiones como β-tubulina, calmodulina y actina o el análisis de marcadores iPBS, para determinar si existe relación entre el grado de patogenicidad con los grupos y subgrupos formados en el presente estudio así como con su hospedante.

Conclusiones

Los resultados del análisis morfológico y filogenético mostraron diferencias importantes entre los aislados de C. cassiicola recolectados de plantas de jamaica y malezas asociadas al cultivo, los cuales se relacionan con aislados de otros países y que fueron obtenidos de especies de plantas de las familias Solanaceae y Cucurbitaceae, principalmente.