La producción de cítricos en México ha aumentado, al ser este cultivo frutal el de mayor valor en el mercado internacional (http://www.fao.org) debido a su uso en la producción de jugos, mermeladas y otros. Sin embargo, las enfermedades de cítricos, en particular aquellas causadas por hongos, causan pérdidas económicas en todo el mundo y, en algunos casos, pueden reducir la producción total hasta en 50% (^{Ochoa et al., 2007}). En agosto de 2017 se observaron síntomas tales como clorosis, necrosis, desecamiento, caída prematura de hojas, marchitez, y luego muerte (~ 60 ha y^-1) de naranjos (Citrus sinensis L. Osberck) var. “Valencia” en huertos comerciales de naranjo en el Valle del Yaqui, Sonora (26° 45’-27° 33’N latitud y 109° 30’-110° 37’W longitud), una de las regiones agrícolas más importantes de México (Figura 1A). Así, se recolectaron hojas, ramas y raíces de diez naranjos sintomáticos y fueron colocados en cámaras húmedas a 4 °C para ser transportadas al laboratorio, donde se identificó el agente biológico causal de dichos síntomas. El análisis visual de las muestras colectadas indicó la presencia de oscurecimiento (tonos de color café) en el sistema vascular de las raíces de dichos árboles (Figura 1B). Por ello, se esterilizaron cincuenta segmentos de dichas raíces usando una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 2 min, lavadas dos veces usando agua destilada (121 °C y 15 psi por 15 min), y se cortaron en pedazos de 1 cm. Más adelante, los pedazos de raíces fueron colocados en Papa-Dextrosa-Agar (PDA) (complementado con 80 µg mL^-1 de ácido nalidíxico), e incubadas por 5 días a 28±2 °C (12 h de oscuridad y 12 h de luz) (^{Villa-Rodriguez et al., 2016}). Después del periodo de incubación, cada colonia fúngica fue aislada usando el medio y las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente, con lo cual se obtuvieron siete aislados fúngicos, a los que se les dieron claves FS1 a FS7. Estos aislados fueron depositados en la Colección de Microorganismos Edáficos y Endófitos Nativos- COLMENA (www.itson.edu.mx/colmena) (^{de los Santos-Villalobos et al., 2018}).

Se observaron características macro y microscópicas (se produjeron preparaciones semipermanentes en ácido láctico y examinadas con un microscopio óptico) típicas del género Fusarium para los siete aislados obtenidos de cultivos mono-espóricos (^{Leslie y Summerell, 2006}), i.e. 1) abundante micelio algodonoso y un color morado o amarillo debajo de la superficie en PDA, 2) macroconidios curveados con un mayor ancho a la mitad de su largo, y 3) microconidios septados ovalados, reniformes, ovalados alargados a obovoides con una base truncada (Figura 2). La identificación molecular -a nivel de género - de estos aislados se realizó secuenciando la región de Espaciadores Internos Transcritos (ITS). Primeramente, 1 x 10⁶ esporas de cada aislado fúngico fueron inoculadas de manera separada en tubos con 5 mL de Caldo de Papa y Dextrosa (CPD), e incubados por 3 días a 28 °C, (en oscuridad). Al final del periodo de incubación, la suspensión celular fue centrifugada por 5 min a 2,500 de Fuerza Centrífuga Relativa (FCR) para obtener micelios fúngicos. El ADN genómico fúngico fue extraído de 500 mg de micelio fresco, el cual fue resuspendido con una pipeta en 500 µL de una solución amortiguadora de extracción (200 mmol Tris HCl pH 8.5, 250 mmol NaCl, 25 mmol EDTA, y 0.5% SDS). La solución acuosa resultante fue mezclada de forma homogénea con 350 µL de fenol. Posteriormente, se agregaron y mezclaron 150 µL de cloroformo, y la suspensión fue centrifugada por 1 h en una centrífuga Eppendorf (13,000 RCF). La fase superior acuosa fue transferida a un tubo Eppendorf esterilizado y mezclado con alrededor de 0.54 volúmenes de isopropanol (250 µL), y centrifugada por 5 min en una centrífuga Eppendorf (13,000 RCF) para la precipitación de ADN (^{Valenzuela-Aragon et al., 2018}). El ADN obtenido fue secado a temperatura ambiente y resuspendido en 30 µL de agua libre de nucleasas (esterilizada). Luego, la mezcla de 50 µL de PCR contuvo 100 ng de ADN genómico fúngico, 0.2 µmol de cada par de oligonucleótidos [ITS1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) y ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (^{White et al., 1990})], y 4 U MyTaq polimerasa (Bioline). Las condiciones de PCR para la amplificación de la región de ITS consistió en un paso inicial de desnaturalización a 94 °C (3 min), 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C (30 s), seguido de un alineamiento a 55 °C (30 s), y extensión a 72 °C (1 min), así como un paso final de extensión a 72 °C (10 min) (^{de los Santos-Villalobos et al., 2013}). Los productos del PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa/TAE (2%), y purificados usando ISOLATE II PCR y Gel Kit (Bioline), y luego fueron secuenciados usando la plataforma Sanger (ABI 3730 XL, Applied Biosystem) de Genomic Services Laboratory (LANGEBIO, Irapuato, Guanajuato, Mexico). Las secuencias de ADN obtenidas fueron editadas y analizadas usando el software FinchTV 1.4.0 by Geospiza, Seattle, WA; y BLAST (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), respectivamente. Las secuencias de ITS obtenidas presentaron una alta cobertura (> 99%) y similitud (> 99%) con el complejo de especies de Fusarium solani (CEFS), el cual es un grupo que en la actualidad se estima que contiene al menos 60 especies filogenéticamente diferentes (^{Coleman, 2016}). Por ende, con base en la identificación molecular de ITS, los siete aislados estudiados pertenecen al género Fusarium, sin embargo más y más robustas relaciones filogenéticas deben ser desarrolladas para clasificar estos aislados a nivel de especie. Las secuencias obtenidas de Fusarium fueron depositadas en el Genbank de NCBI como: FS1 (MG262553), FS2 (MG262554), FS3 (MG262555), FS4 (MG262556), FS5 (MG262557), FS6 (MG262558), y FS7 (MG262559).

Figura 1 Síntomas de naranjos (Citrus sinensis L. Osberck) var. Valencia” en el Valle del Yaqui, Sonora. A) Síntomas inclu yen: clorosis, necrosis, desecamiento, caída prematura de hojas, marchitez y luego muerte vs. un árbol sano. B) Naranjo sintomático presentando tonos de color café en el sistema vascular de las raíces vs. raíz sana. 

Figura 2 Caracterización morfológica de agentes asociados aislados de raíces sintomáticas. Características macroscópicas, abundante micelio algodonoso de color blanco y un anverso de color púrpura o amarillo en PDA. Características microscópicas, macroconidios curveados, de mayor ancho a mitad de su longitud. 

Se llevaron a cabo ensayos de patogenicidad de forma separada para cada aislado estudiado de Fusarium bajo condiciones de invernadero (13 h de oscuridad a 14 °C, 2 h de luz a 18 °C, 7 h de luz a 25 °C, y 2 h de luz a 18 °C; y 80% de humedad relativa). Así, cinco naranjos de un año de edad de la var. “Valencia” con raíces dañadas (se realizaron pequeñas incisiones con un bisturí estéril) fueron inoculados con una suspensión conidial (1x10⁴ conidios mL^-1 y 50 mL planta^-1); se estableció un control negativo con agua destilada estéril rociada sobre la herida de la planta. Después de 30 días, se observó una coloración café en el sistema vascular de las raíces en 100% de los árboles inoculados (las plantas control fueron asintomáticas y no se recuperó ningún cultivo de Fusarium), causando la muerte de los mismos, de donde se recuperó cada aislado de Fusarium y se caracterizó como se describe anteriormente, confirmando 1) la alta virulencia de estos aislados , y 2) su papel como agente causal de los síntomas y la muerte de naranjos observados en huertos comerciales en el Valle del Yaqui.

Con base en observaciones morfológicas, la caracterización molecular parcial y el cumplimiento de los postulados de Koch, pudimos identificar que los aislados estudiados (pertenecientes al CEFS) fueron el agente causal del marchitamiento en naranjos var. “Valencia” en el Valle del Yaqui. Hallazgos similares han sido reportados en California (Estados Unidos), identificando a Fusarium solani y Phytopstora spp. como los agentes causales de la descomposición oscura en la corteza de las raíces y la corona inferior del tronco, así como clorosis en hojas y marchitamiento en naranjos y limoneros (^{Adesemoye et al., 2011}). Además, ^{Fogliata et al. (2013}) reportaron la presencia de pudrición por Fusarium en limoneros, e identificaron a Fusarium oxysporum como el agente causal. Recientemente, ^{Sandoval-Denis et al. (2018}) establecieron la diversidad de Fusarium relacionada a árboles de cítricos en Europa, al usar el análisis morfológico y molecular. Las especies más comúnmente aisladas fueron F. sarcochroum, F. oxysporum y Fusarium solani; también propusieron un nuevo linaje totalmente apoyado, divergente filogenéticamente y morfológicamente, que se llama complejo de especie F. citricola (CEFC).

Si bien el marchitamiento había sido observado previamente en México, existen sólo dos casos reportados en la Colección Nacional de Hongos de EE.UU. (https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/). Por ello, hasta donde es de nuestro conocimiento, este es el primer reporte de marchitez por Fusarium en naranjos del Valle del Yaqui, causando un oscurecimiento en el sistema vascular de raíces y la muerte de árboles (~ 60 ha y^-1). Como Fusarium es un fitopatógeno virulento, es posible que el uso intensivo del arado para desagregar suelo arcilloso compactado en los huertos comerciales de naranjos en el Valle del Yaqui haya dañado el sistema de raíces de los árboles, lo cual, en combinación con condiciones del suelo y climáticas (temperatura y humedad) fue una de las fuerzas impulsoras para el brote de marchitamiento por Fusarium.