La mayoría de los agroquímicos antifúngicos están perdiendo su efectividad debido al desarrollo de resistencia de los hongos patógenos (^{Dooley et al., 2016}). Una forma potencial y de amplia aceptación para descubrir nuevos agentes de control de enfermedades vegetales es buscar compuestos derivados de plantas, que se ha demostrado que mejoran las actividades antifúngicas y reducen la toxicidad (^{Mishra et al., 2010}).

Un aspecto importante de la actual investigación de fungicidas es el uso del adecuado y novedoso sitio-objetivo, en los que los compuestos ejercen su efecto fungicida, afectando un proceso que debería ser esencial para el crecimiento de los hongos, y de preferencia uno que sea requerido para mantener la viabilidad celular. Entre los sitios-objetivo, la pared celular fúngica ha surgido como uno de los más importantes, ya que los hongos están encerrados en una pared que contiene hidratos de carbono. En consecuencia, los agentes que inhiben la síntesis de la pared celular fúngica serán más selectivos (^{Liu y Balasubramanian, 2001}). La pared celular fúngica de ascomicetos, basidiomicetos y deuteromicetos, y algunos oomicetos, están compuestos de β-glucanos (^{Douglas, 2001}), que son homopolimeros de β-1,3-unidos a glucosas, con cantidades variables de cadenas de β-1,6 y β-1,4 unidos a glucosa y quitina que son responsables de mantener la rigidez celular (^{Gastebois et al., 2010}). La reorganización estructural dinámica de la pared celular fúngica debe alcanzar una lisis parcial para hacerse de plasticidad durante los cambios morfológicos como el crecimiento celular (ramificación), división celular y germinación en hongos filamentosos o la separación celular en la levadura, donde las endo-β-1,3-glucanasas juegan un papel esencial durante tales eventos morfogenéticos (^{Baladrón et al., 2002}; ^{Martin-Cuadrado, et al, 2003}; ^{Hartl et al., 2011}). Por lo tanto, una estrategia para descubrir agentes de control de enfermedades vegetales sería buscar en los compuestos de las plantas sustancias inhibidoras de endo-β-1,3-glucanasas como un sitio-objetivo específico de aquellos hongos cuyas paredes celulares contienen β-glucanos, específicamente en el enlace β-1,3-glucano. Hay limitados metodologías para evaluar de forma masiva a derivados de plantas y otras fuentes poco comunes para ciertos tipos de actividad biológica, tal como la actividad de enzimas fúngicas (^{Muller, 2002}). Por el contrario, se han obtenido grandes avances en las industrias farmacéuticas y miles de compuestos con actividad biológica en potencia pueden ser evaluados de forma rápida en busca de cierto tipo de actividad biológica (^{Kurtz y Rex, 2001}).

Nuestro laboratorio ha evaluado extractos crudos de plantas del desierto de Sonora en busca de compuestos antifúngicos derivados de material vegetal, evaluando cientos de extractos crudos usando un ensayo antifúngico tradicional (^{Rivera-Castañeda et al., 2001}; ^{Vargas-Arispuro et al., 2005}). Considerando que algunos extractos crudos han presentado propiedades antifúngicas contra un panel de hongos fitopatogénicos, nos concentramos en la búsqueda de aquellos extractos de plantas que inhibiría de forma selectiva la síntesis de la pared celular fúngica, mediante la inhibición de la endoβ-1,3-glucanasa, en aquellos hongos que lo contienen, tales como Aspergillus, Penicillum, Tilletia, Botryotinia, Alternaria, Phytophthora, entre otros (^{Vargas-Arispuro et al., 2009}). En el presente trabajo implementamos un ensayo simple pero orientado a un sitio-objetivo para la evaluación de 40 extractos crudos de plantas medicinales para la detección de inhibidores de la endo-1,3-β-glucanasa fúngica. Este ensayo facilitaría la evaluación biológica de extractos crudos de plantas durante eldescubrimiento de moléculas guías para desarrollar una nueva clase de agente de control de enfermedades ocasionadas por hongos.

Cuarenta plantas medicinales/aromáticas, enlistadas en el Cuadro 1, fueron recolectadas de poblaciones nativas del desierto de Sonora y secadas al sol por varias semanas. Un espécimen voucher fue depositado en el Herbario de la Universidad de Sonora (México).

Cuadro 1. Evaluación de extractos de plantas obtenidos en metanol (MeOH) or diclorometano (DCM) para detectar inhibidores de endo-β-1,3-glucanasa usando el ensayo de difusión de gel. 

Para obtener los extractos de las plantas, se extrajeron secuencialmente 500 gramos de hojas y pequeños tallos de cada planta seca con diclorometano (1 L) y metanol (1 L), la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente por 7 días en la oscuridad. Los filtrados de cada solvente fueron evaporados por completo bajo presión reducida para obtener un residuo viscoso, llamado el extracto crudo de la planta. Los extractos crudos fueron resuspendidos en dimetilsulfóxido para llevar a cabo el ensayo de difusión en gel.

Para preparar el gel de agarosa, se disolvieron 1.6 g de agarosa en 100 mL de buffer de incubación (0.1 M ácido cítrico, 0.2 M fosfato de sodio, pH 5.0) en un horno de microondas. Se dejó enfriar la mezcla a 50 °C y fue agregado de forma gradual laminarin de Laminaria digitata (0.5 g en 100 mL de 0.1 M ácido cítrico /0.2 M buffer de fosfato de sodio, pH 5.0) y la solución se agitó vigorosamente. Se vertieron 20 mL de la mezcla tibia de agarosalaminarin en cajas Petri de vidrio (14 cm x 2 cm) y se dejaron enfriar a temperatura ambiente hasta que la agarosa se solidificara. Posteriormente, se usó un sacabocados para cortar pozos de 2 mm de diámetro en el gel, separados equitativamente, como radios en las cajas Petri. Los pedazos de gel fueron removidos con aspiradora.

Para el ensayo de difusión en gel, el estándar de endo1,3-β-glucanase de Trichoderma sp. (5 unidades) se disolvió en 1 mL de 0.1 M ácido cítrico /0.2 M buffer de fosfato de sodio (pH 5.0) para preparar una solución stock del estándar. Los extractos crudos de plantas (17.5 mL) y glucanasa pura (2.5 mL) fueron pipetedos individualmente en pozos del gel. Un pozo con glucanasa pura (2.5mL) y buffer de incubación (17.5 mL) fueron agregados a cada caja Petri como control positivo y un pozo con 20 mL de buffer de incubación fue agregado como control negativo. Las cajas Petri fueron incubadas a 28 °C por 16 h. Después de la incubación, los geles fueron teñidos con 20 mL de calcoflúor recientemente preparado [0.1 g en 100 mL de 500 mM Tris-HCl (pH 8.9)] por 10 min. Los geles fueron lavados tres veces con agua destilada por dos horas.

Usando un transiluminador de UV se visualizaron las zonas hidrolizadas de laminarin como círculos oscuros no fluorescentes en un fondo fluorescente (laminarin no digerida teñida por calcoflúor). Los diámetros de las zonas hidrolizadas fueron medidos (mm) en el gel de agarosa. El ensayo fue llevado a cabo al menos cinco veces usando ocho réplicas para cada extracto.

Durante la estandarización del ensayo de difusión de gel, el laminarin incorporada en gel de agarosa fue fácilmente hidrolizada por la acción de la enzima endo-1,3-β-glucanasa, produciendo círculos transparentes alrededor de los pozos, que fueron medibles. La Figura 1 muestra una relación linear entre los diámetros de las zonas hidrolizadas en el gel con las unidades de enzimas añadidas al pozo. El coeficiente de determinación de la línea de regresión fue de 0.9879. Otros cinco experimentos obtuvieron los mismos resultados. Este resultado indica que el ensayo puede ser usado para análisis cualitativos o cuantitativos cuando sea necesario.

Figure 1. Línea de regresión que correlaciona el diámetro de las zonas hidrolizadas en el gel de agarosa con unidades de glucanasa pura. Cada punto representa las medias de 8 muestras de réplica. En otros cinco experimentos se obtuvieron ecuaciones de regresión similares. 

Después de establecer las condiciones, evaluamos 80 extractos crudos de plantas (40 de diclorometano y 40 de metanol) para poder detectar inhibidores de endo-β-(1-3)-glucanasa. La Figura 2 muestra imágenes del ensayo de difusión en gel, donde los círculos oscuros alrededor de los pozos representan extractos de plantas que no contenían inhibidores de actividad de endoglucanasa (E₃-E₁₁). Por el contrario, los pozos en los que no aparecían círculos oscuros fueron considerados extractos de plantas que contenían compuestos que inhiben la actividad enzimática (E₁, E₂ and E₁₂).

Figura 2. Imágenes del ensayo de gel de difusión para detectar inhibidores de β-(1-3)-glucanasa en extractos crudos de plantas. Cada pozo etiquetado con E contenía 17.5 μL de extracto crudo de planta y 2.5 μL de glucanase. El pozo S contenía 2.5 μL (0.125 unidad) de glucanasa pura de la especie Trichoderma y 17.5 μL de buffer de incubación. El pozo B contenía 20 μL de buffer de incubación como control. 

Los resultados del ensayo de difusión de gel radial para detectar inhibidores de la actividad fúngica de endo-β-(1-3)-glucanasa en extractos crudos de plantas, se muestran en el Cuadro 1. De los 80 extractos de plantas evaluados, sólo 3 obtenidas con metanol (MeOH) y 4 obtenidas en diclorometano (DCM), mostraron inhibición de endo-1,3-βglucanasa (Cuadro 1). Estos resultados sugieren que7.5%delosextractosdeMeOHy10%delos extractos de DCM contienen compuestos que inhiben la enzima fúngica. Si bien otros ensayos para detectar inhibidores de glucanasa pueden ser más sensibles y precisos, también pueden ser tardados y requerir de equipo especializado (^{Nelson, 1944}; ^{Somogyi, 1952}) o muchos pasosen el proceso de evaluación (^{Pan et al., 1991}).

La evaluación de productos naturales sigue siendo una de las vías más útiles para encontrar moléculas nuevas y únicas que sirvan como pistas para el desarrollo de nuevos agentes para la protección de los cultivos (^{Thompson et al., 2000}). Desarrollar metodologías de evaluación más rápidas para los productos naturales, podría acelerar mucho el proceso de descubrimiento de estas moléculas. Debido a la falta de metodologías de evaluación masiva, muchas veces se descartan cientos de compuestos naturales con potencial antifúngico. El ensayo de difusión de gel es una herramienta valiosa para evaluar extractos crudos de planta de forma masiva, rápida y económica, en comparación con el procedimiento acoplado de Somogyi y Nelson.

Varios experimentos indican una alta reproductibilidad del ensayo, por lo que podemos concluir que el ensayo de gel de difusión fue usado de manera exitosa para detectar inhibidores de endo- β-(1-3)-glucanasa fúngica presente en extractos crudos de plantas.