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Definición y alcance de un biobanco
Un biobanco es una colección organizada de material biológico y de información asociada, almacenada para fines de investigación.1,2 La rápida expansión de la investigación clínica con fines de validación y desarrollo de nuevos tratamientos y métodos diagnósticos que demandan cuantiosas muestras clínicas ha estimulado la existencia los biobancos en las instituciones médicas.3-5 Las muestras almacenadas corresponden a pacientes que informada y voluntariamente eligen donarlas al biobanco, con el propósito de apoyar investigaciones científicas debidamente aprobadas por Comités de Investigación y Ética de las instituciones participantes, que más tarde pueden llevar a importantes descubrimientos. La información almacenada en la base de datos de cada donador se conserva y maneja de manera codificada para garantizar su confidencialidad. El código lleva a cada muestra, con los datos clínicos, epidemiológicos, demográficos, de gabinete y de laboratorio de cada paciente.2,6
Los biobancos son un valioso soporte institucional integral para el mejor aprovechamiento de bioespecímenes, pues comprenden su transportación, preservación en condiciones adecuadas, revisión patológica preliminar, procesamiento para obtener biomoléculas informativas, apoyo con análisis de laboratorio y procedimientos estandarizados para recibir, manejar y distribuir los especímenes, así como la información relevante y trámites regulatorios (Figura 1).7
El biobanco departamental
El biobanco piloto o departamental, asentado en la Unidad de Biotecnología Médica del Departamento de Bioquímica y Medicina Molecular de la institución, se creó originalmente con los bioespecímenes derivados de proyectos de los grupos de investigación del departamento. Nuestra experiencia con el almacenaje masivo de muestras puso en evidencia la necesidad de contar con infraestructura, procesos y recursos humanos capacitados en el área de biobanco.8
Con el objeto de institucionalizar el biobanco y abrirlo para cubrir todas las especialidades médicas, se tomaron los siguientes cursos de acción: 1.Fortalecer la infraestructura, 2.Atraer recursos económicos y generar colaboraciones a nivel nacional e internacional a través del fomento de sinergias entre grupos de investigación básica y clínica, 3.Buscar alianzas con la industria para impulsar descubrimientos en biotecnología y genómica y, 4.Propiciar la inclusión en consorcios nacionales e internacionales desarrollando estudios masivos de la medicina genómica en las enfermedades crónicodegenerativas que más afligen a la sociedad.8
En este artículo se hace una revisión del trabajo que permitió transitar exitosamente de la etapa de biobanco departamental hacia la institucional. La experiencia y beneficios derivados nos animan ahora a consolidar un Laboratorio Nacional, que ya está en marcha y que será descrito en un futuro documento.
Diseño, estructura, equipamiento y soporte informático
Para garantizar la pureza e integridad de las muestras biológicas, la infraestructura del Biobanco Institucional incluye las siguientes áreas independientes: área de recepción de muestras (la cual cuenta con equipos lectores de códigos de barras (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) que aseguran la identificación, almacenamiento y localización eficientes de las muestras biológicas); área de aislamiento de biomoléculas (DNA, RNA y proteínas, principalmente); área de preservación de muestras (congeladores, ultracongeladores y tanque de nitrógeno líquido); área para la preparación de reacciones, como las de la reacción en cadena de la polimerasa (pre-PCR) y área independiente para el análisis de blancos génicos amplificados (post-PCR).
Según su importancia y especificaciones, los equipos están conectados, ya sea a una fuente ininterrumpida de corriente eléctrica o a una planta de emergencia eléctrica. De manera importante, en caso de falla de algún equipo del Biobanco, se cuenta con el respaldo de congeladores y ultracongeladores pertenecientes al resto de los laboratorios del departamento.
Se logró un incremento sustancial en el rendimiento y en la pureza de las preparaciones de ADN y ARN al emplear un homogenizador de tejidos con sonda de acero (Tissue Ruptor, Qiagen, Hilden, Germany) y un equipo extractor de ácidos nucleicos semiautomatizado basado en perlas magnéticas (King Fisher, Thermo Fisher Scientific).
Como parte de la infraestructura analítica básica, el Biobanco institucional cuenta con los siguientes equipos: termociclador para PCR de punto final (Veriti, Applied Biosystems, Duren, Alemania), termociclador para PCR en tiempo real (Stepone, Thermo Fisher Scientific), cuantificador de biomoléculas (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific), purificador para agua miliQ (Smart2Pure Water Purification System, Thermo Fisher Scientific), cámaras de electroforesis (Bio-Rad, Hercules, California), fotodocumentador (Gel Doc Ez Imager, Bio-Rad), equipo común de laboratorio (como vortex, termobloques, microcentrífugas y micropipetas) y computadoras con acceso a internet.
Entrenamiento del personal
El personal del biobanco cuenta con carreras afines al área biomédica. Los investigadores que apoyan los proyectos cuentan con posgrado, algunos de ellos con preparación académica en el extranjero y membresía en el SNI. El personal técnico cuenta con el certificado de la American Society for Clinical Laboratory Science para toma y transportación de muestras.
Todo el personal ha tomado obligatoriamente cursos de buenas prácticas clínicas y de bioseguridad. Asimismo, se ha capacitado al personal en materia de protección de datos.
Entre los planes a corto plazo está el capacitar al personal en la Norma ISO9001:2015 y la Norma Francesa (NF S 96-900 "Quality of Biological Resource Centers (BRC) Management System of BRC and quality of Biological resources from human or micro-organisms origin"), la cual es específica de biobancos.
Aspectos bioéticos y legales
Para poder acceder al Biobanco, es requisito indispensable que los proyectos de investigación cuenten con la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la institución.
Se brinda especial atención al manejo de los datos genéticos de los pacientes, considerados sensibles porque son datos personales que pertenecen a la esfera más íntima de su titular y cuya utilización indebida puede dar origen a discriminación o conllevar un riesgo grave para el mismo.9
En particular, se consideran sensibles aquellos datos que puedan revelar aspectos como origen racial o étnico, estado de salud presente y futuro, información genética, creencias religiosas, filosóficas y morales, afiliación sindical, opiniones políticas y preferencia sexual.10 Por ello se requiere, antes de realizar una toma o recepción de muestra, de la presentación de una carta de consentimiento informado. Éste es el "estándar de oro" para garantizar que los sujetos que participan como voluntarios en investigación lo hagan de forma libre y conociendo la información completa y las repercusiones de donar una muestra biológica.11-14
Este procedimiento lo realizamos siguiendo los lineamientos del Artículo 103 bis 3, de La Ley General de Salud de los Estados Unidos Mexicanos.6,10
Procesos de laboratorio
1. Toma y registro de muestras
Las muestras que se almacenan son principalmente de plasma, suero, orina, saliva, tejidos y sus principales biomoléculas, como ADN y ARN. Como anticoagulante se emplea EDTA, ya que la heparina puede inhibir la amplificación por PCR.15-18
Para la captura de datos, se está haciendo una migración a sistemas de gestión de información de laboratorio (LIMS, del inglés Laboratory Information Managment System, Genetadi, Biotech Vizcaya, España) que facilitan la trazabilidad de las muestras y de su información asociada.19 El software de gestión del Biobanco además permite asegurar el anonimato de los donantes de las muestras y el acceso sólo del personal autorizado a los datos personales. Al gestionar datos personales, clínicos y genómicos se tienen en cuenta las normas descritas por la Agencia de Protección de Datos.19-21
El expediente clínico nos brinda los datos médicos de cada paciente, y a través de cuestionarios se obtiene información adicional como, por ejemplo, si el paciente realiza actividad física y con qué frecuencia, si existen problemas de adicciones, aspectos de la conducta sexual, antecedentes médicos familiares y hábitos alimenticios, entre otros.
2. Traslado y recepción de muestras
Un equipo de transporte refrigerado garantiza la preservación de las muestras biológicas, las cuales son procesadas en áreas estériles con nivel de bioseguridad 2. Idealmente, los bioespecímenes líquidos se procesan antes de que transcurran dos horas a partir de la toma.
En biobancos establecidos, las muestras destinadas a extracción de ARN se congelan directamente en nitrógeno líquido al momento de ser tomadas.18 A falta de un suministro fiable de nitrógeno líquido para los tanques de congelación, los tejidos frescos destinados a la extracción de ARN se sumergen en una solución preservadora (RNAlater, Thermo Fisher Scientific) inmediatamente después de ser tomados. Una vez que el tejido se impregna con la solución, ésta es desechada y el tejido se congela a -80oC.
3. Procesamiento de muestras
Para las extracciones de ADN genómico a partir de sangre periférica se emplean dos técnicas: una manual con buffer de lisis TSNT22 y una semiautomatizada con perlas magnéticas (KingFisher 2 mL, Thermo Fisher Scientific). Para mejorar la calidad del ADN extraído, la técnica de TSNT fue modificada incluyendo una segunda extracción con Sevag (cloroformo: alcohol isoamílico: 24 a 1) y TE (Tris-HCl pH 8 10 mM y EDTA 1mM). En el caso de las muestras embebidas en parafina, se empleó el estuche comercial NucleoSpin FFPE DNA (Tissue Kit; Macherey y Nagel, Düren, Germany). Para la extracción de ADN de muestras de saliva se utilizó el kit comercial prepIT-L2P de DNA de GenoTek (Montreal, Canadá).
4. Identificación y almacenamiento de muestras
Etiquetar las muestras biológicas de manera apropiada asegura la correcta trazabilidad de la muestra. En este sentido, la identificación manual de las muestras es un proceso que, por ser laborioso y prestarse a errores, es poco confiable para garantizar la trazabilidad de una muestra.20 Por ello, se elegió el código 2D, el cual permite capturar el código de la muestra mediante un lector óptico. Adicionalmente, las criocajas cuentan con un código de barras 1D, lo cual implica una menor mano de obra e incrementa la confiabilidad en la trazabilidad de las muestras.
Una vez que las muestras están en los tubos, éstos se colocan dentro de los congeladores de -20°C o -80°C, dependiendo del tipo de muestra a almacenar. Las muestras de suero y plasma se almacenan en volúmenes de 250 μl y las muestras de ADN en volúmenes de 50 μl a una concentración de 50 ng/μl. Las muestras de ARN se almacenan en volúmenes de 50 μl a concentración variable, dependiendo de su uso posterior. El número de alícuotas es variable y depende de los volúmenes o cantidades de muestras tomadas. La cantidad de fluidos que se toma para cada paciente varía de acuerdo con los protocolos; en caso de tejidos frescos se almacenan en fracciones de aproximadamente 10 mg.
5. Control de calidad
Cada vez tiene más importancia contar con muestras biológicas de alta calidad en la investigación biomédica, ya que se ha reconocido que la mala calidad o el desconocimiento de la misma podría impedir la reproducibilidad y generar resultados de investigación incorrectos.20
Para tener control de calidad del suero y plasma se pone especial atención al tiempo transcurrido desde la obtención de la muestra hasta su recepción, procesamiento y almacenamiento (variables preanalíticas), que debe ser el mínimo posible (el análisis de la muestra idealmente se debe realizar en los 30 minutos posteriores tras su extracción y en dos horas como máximo). La temperatura de almacenamiento debe ser inferior a -70°C y deben evitarse ciclos de congelación-descongelación. Se almacenan suficientes alícuotas de cada muestra en un volumen mínimo posible (250 μl), y se hace un registro de las temperaturas de almacenamiento en una bitácora.
La calidad y cantidad de cada muestra de ADN genómico (ADNg) y del ARN se evalúan en el equipo NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). La integridad del ADN se corrobora mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.8% de una muestra mínima.
La calidad de cada muestra de ADNg y del ADN complementario (ADNc) que se prepara por retrotranscripción se verifica amplificando el gen globina β (referido como control interno), incluyendo testigos negativos (sin DNA), así como testigos positivos (DNAg humano control). Los amplicones se observan en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, en un transiluminador de luz ultravioleta (Fotodocumentador, Gel Doc Ez Imager, Bio-Rad). Los biobancos internacionales garantizan la trazabilidad de las muestras mínimamente mediante la identificación del sexo del individuo a través de una PCR específica de los cromosomas X o Y, empleando, de preferencia, un perfil genético de ADN.*
6. Certificaciones
Dado que México no cuenta aún con una ley regulatoria para biobancos, las actividades del Biobanco siguen los lineamientos provenientes de la NOM-012-SSA3-2012 (la cual establece los criterios para la ejecución de proyectos de investigación para la salud en seres humanos), de la Ley General de Salud, del COFEPRIS y de los Comités de Investigación, Ética y Bioseguridad de las instituciones de origen de los proyectos. Además, a nivel internacional se cuenta con la Guía para Biobancos Humanos y las Bases de Datos para Investigación Genética, publicadas por la Organización para la Cooperación Económica y el Desarrollo (OECD).11,23
En tanto que nuestros procedimientos se sometan a evaluaciones de organismos internacionales que ofrecen certificaciones específicas para biobancos, nuestro personal se encuentra tomando cursos de capacitación de la Norma ISO9001:2015. Asimismo, el biobanco cuenta con manuales de operación y reportes de inventario, y se está capacitando al personal para adecuarlos a la Norma ISO. El establecimiento de Procedimientos Operativos Estandarizados (SOP) es crucial para evitar la introducción de variables en las muestras biológicas de investigación durante el almacenamiento y mantener la alta calidad requerida para obtener resultados fiables.
Se está trabajando también para que el Biobanco logre acreditar sus procesos ante el College of American Pathologists (www.cap.org/), que recién anunció un programa de certificación para biobancos. A su vez, se nos ha aconsejado (por biobancos internacionales líderes) solicitar el ingreso a la International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER),24 trámite que ya se ha concretado.
Como parte del sistema de bioseguridad del biobanco, se elaboró un "Manual de bioseguridad". Este manual cumple con las normas mínimas implementadas por la Organización Mundial de la Salud y por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC; Atlanta, Georgia, EUA) para laboratorios a nivel mundial, así como con las normas nacionales pertinentes.
Experiencia, impacto y perspectivas del Biobanco Institucional
El Biobanco Institucional ha dado apoyo a proyectos de investigación científica, protocolos clínicos y tesis de maestros y doctores en ciencias y en medicina de la Facultad de Medicina y del Hospital Universitario, así como de médicos que estudian especialidades y subespecialidades clínicas (Cuadro I). El Hospital Universitario brinda atención médica a una amplia población del noreste del país (casi medio millón de consultas anuales) y, con el apoyo de la Facultad de Medicina, tiene como objetivo alcanzar los máximos estándares de excelencia a través de la integración de las actividades de asistencia, docencia e investigación básica y clínica.
Cuadro 1 Proyectos apoyados hasta junio de 2016 por el Biobanco
GH: hormona de crecimiento; SNP: polimorfismos de un solo nucleótido; SSNL: Secretaría de Salud de Nuevo León; CAM-1: Centro Antidiabético México-1; MCP: Médico Cirujano Partero.
Desde su fase departamental, el Proyecto Biobanco ha potenciado la integración de la investigación básica y clínica de nuestra institución, y ha abierto la posibilidad de colaborar en consorcio con otros biobancos nacionales e internacionales.
El Biobanco Institucional opera desde hace poco más de seis años. Como se muestra en el Cuadro I, el Biobanco ha apoyado a más de una docena y media de proyectos de investigación de los diferentes Departamentos y Servicios de la institución y su Hospital Universitario, además de que ha participado en dos colaboraciones internacionales. Del total de muestras almacenadas, 34% corresponde a ADN, 58% a plasma o suero, 7% se almacenó como tejido fresco (a -80oC) o embebidos en parafina, y 1% (n=30) fueron raspados oculares.
Gracias a la puesta en marcha de este proyecto, se han logrado concretar colaboraciones a nivel nacional con la Red de Cáncer Cervicouterino de Cuerpos Académicos de la Secretaría de Educación Pública y con el Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN), y a nivel internacional con el Instituto Broad del MIT y Harvard University, así como con las Universidades Johns Hopkins y de San Antonio Texas (Cuadro I).
En 2015 se participó exitosamente en dos convocatorias del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt) de México. Los apoyos económicos aprobados para el proyecto Laboratorio Nacional para el resguardo, aprovechamiento y suministro de bioespecímenes a investigaciones en ciencias médicas (Servicio de Biobanco) (No. 252984) y el proyecto Implementación de Infraestructura de Bioseguridad y de Sistemas de Aseguramiento de la Calidad para los Procesos del Laboratorio Nacional "Servicio de Biobanco" (No. 263943) serán decisivos para que el Biobanco Institucional evolucione a Biobanco Nacional, proceso que también será impulsado por la UANL, el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán y la Red Valenciana de Biobancos de España, principalmente.
Conclusiones
Logramos transitar de la etapa de Biobanco Departamental, con colecciones de bioespecímenes derivadas de los proyectos de investigación biomédica propios, hacia la etapa de Biobanco Institucional. En este esfuerzo, hemos apoyado diversos proyectos de investigación (una docena, con unos 3 000 bioespecímenes) de grupos clínicos de la institución y de colaboradores dentro y fuera de la región. Se iniciaron planes para transitar ahora de Biobanco Institucional a Laboratorio Nacional.
