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Introducción
Leptospira Noguchi 1917 es un género de espiroquetas gramnegativas que por sus características moleculares y virulencia se divide en dos clados: patogénico y no patogénico (saprófito) (Amran et al. 2023). Adicionalmente, tiene una clasificación basada en criterios serológicos mayores de 300 serovares agrupadas en más de 30 serogrupos antigénicamente similares (Amran et al. 2023). Las especies y serovares patógenas de Leptospira ocasionan la leptospirosis, zoonosis considerada un problema de salud pública y animal en regiones con bajo nivel socioeconómico y deficientes medidas de higiene de Latinoamérica (Browne et al. 2023) y México, donde se presenta en áreas tropicales y subtropicales, incluyendo la península de Yucatán (Sánchez-Montes et al. 2015, Torres-Castro et al. 2016, Yescas-Benítez et al. 2020).
Los reservorios naturales y portadores renales excretan y diseminan Leptospira patógenas con su orina, contaminando fuentes superficiales de agua y suelo húmedo, donde permanecen viables y entran en contacto con hospederos susceptibles, generando y manteniendo los ciclos de transmisión (Torres-Castro et al. 2016). Los roedores sinantrópicos son los reservorios más importantes (Li et al. 2022); no obstante, otros hospederos, entre ellos los perros, son una fuente de transmisión de Leptospira para los seres humanos (Brown y Prescott 2008, Romero y Sánchez 2009, López et al. 2019), por lo que participan en el ciclo zoonótico de transmisión (Rojas et al. 2010, Di Azevedo et al. 2023). De igual forma, los perros son centinelas de Leptospira para identificar serogrupos y serovares en entornos antropizados (López et al. 2019).
Por otra parte, los perros son reservorios de Leptospira interrogans serogrupo Canicola, por lo que la mayoría de las infecciones son asintomáticas o subclínicas (Ricardo et al. 2020). Otros serogrupos con altas tasas de contacto en estos animales son L. interrogans Australis, Icterohaemorrhagiae y Pomona, Leptospira kirschneri serogrupo Grippotyphosa, y Leptospira borgpetersenii serogrupo Sejroe (Ricardo et al. 2020, Di Azevedo et al. 2023). Esta diversidad de serogrupos y serovares dificulta implementar programas de vacunación para controlar y disminuir el riesgo zoonótico (Altheimer et al. 2020, Scahill et al. 2022, Cruz-Romero et al. 2024).
En México, se ha identificado la exposición a distintos serogrupos y serovares de Leptospira, principalmente en perros de la península de Yucatán (Andrade-Silveira et al. 2024), donde los hallazgos sobre las características demográficas y de forma de vida que representan factores asociados con el contacto con estas bacterias, son limitados (Hernández-Ramírez et al. 2020). Por lo tanto, el objetivo fue estimar la frecuencia de perros con anticuerpos contra serovares de Leptospira y explorar su asociación epidemiológica con rasgos demográficos y de forma de vida en una localidad del sureste de México.
Materiales y métodos
Consideraciones éticas
El presente estudio fue aprobado por el Comité de Bioética del Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi” de la Universidad Autónoma de Yucatán (UADY), acta: CEI-007-2018. El manejo y toma de muestras biológicas en los perros estudiados se realizó en presencia de los tutores por médicos veterinarios zootecnistas. Se empleó equipo de seguridad y bioseguridad para proteger la salud de los animales estudiados y el personal encargado del trabajo.
Sitio y diseño de estudio
El trabajo se realizó en la localidad de Maxcanú (20° 35’04’’ N-90° 00’ 02’’ O) ubicado en el municipio del mismo nombre en el estado de Yucatán, sureste de México. El municipio tiene una superficie de 1 320.82 km2 (Gobierno del Estado de Yucatán 2023) y una población de 23 991 habitantes (Gobierno de México 2024). La temperatura promedio anual en la región es de 27.4 °C, la precipitación pluvial anual es de 1 080 mm y la altitud es de 10 m sobre el nivel del mar. La localidad se encuentra rodeada por selva baja tropical (vegetación original) que ha sido parcialmente substituida por pastos para ganadería extensiva y agricultura de temporal (Gobierno del Estado de Yucatán 2023).
La localidad de estudio se escogió por la alta presencia de perros domiciliados (observación de campo, no se cuenta con censo), por el acceso al sistema de salud pública (incluidos registros de enfermedades febriles inespecíficas) y por criterios asociados con el riesgo de enfermedades infecciosas en habitantes del sureste de México, entre ellos contacto con mascotas, animales domésticos y de producción, y artrópodos vectores; actividades económicas relacionadas con la explotación del campo o agropecuarias, etc. (Torres-Castro et al. 2020).
El estudio fue transversal no probabilístico y se realizó de febrero a abril de 2019. Para el tamaño de muestra se utilizó el método por conveniencia debido a que se visitaron viviendas (selección no aleatoria) y se invitó a los tutores de los perros a participar voluntariamente en el estudio (muestreo por disponibilidad). Aquellos que aceptaron, firmaron el consentimiento informado para la toma de muestras sanguíneas en los perros.
Recolección de muestras sanguíneas y de datos demográficos y estilo de vida de los perros
Las visitas al sitio de estudio se realizaron durante una semana por cada mes (febrero a abril) de muestreo. Se realizó una sola visita a las viviendas cuyos dueños aceptaron participar en el presente estudio. Se incluyeron perros presentes y disponibles durante estas visitas y se excluyeron perros con antecedentes de vacunación contra Leptospira, según la información proporcionada por los tutores, y cachorros menores de dos meses de edad. En cada perro estudiado, se colectaron hasta 5 mL de sangre completa por punción de la vena caudal, cefálica o yugular. Antes de la toma, el sitio de punción se desinfectó con peróxido de hidrógeno y yodo para evitar contaminación exógena. En condiciones de campo las muestras se conservaron en neveras portátiles con refrigerantes para evitar hemólisis. En estas mismas condiciones se trasladaron a las instalaciones del laboratorio para su conservación a 4 °C y procesamiento.
Durante la toma de muestras sanguíneas se recolectaron datos demográficos: sexo (macho o hembra), edad (cachorro o juvenil, adulto o geriátrico, según Torres-Castro et al. 2022) y talla (pequeña, mediana o grande, según Torres-Castro et al. 2022). Además, al tutor se le preguntó sobre características del estilo de vida: acceso del perro a áreas selváticas (con o sin contacto), el lugar donde pasa la noche (pernocta adentro o afuera de la casa) y el número de perros en el predio (uno o más de uno). Todos los datos se capturaron en una base digital de datos en el programa Excel (Microsoft®, Estados Unidos de América).
Prueba de microaglutinación (MAT)
El suero sanguíneo se obtuvo por centrifugación (1 000 g durante cinco minutos) y se colectó en tubos para microcentrífuga de 1.5 mL (Eppendorf®, EUA) que se conservaron en congelación (-20 °C) hasta su uso en la prueba de MAT que es la prueba oro para el diagnóstico de Leptospira (OIE 2018).
La MAT se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana. Se utilizó la metodología descrita por Ochoa-Valencia et al. (2022) conforme a lo establecido por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE por sus siglas en francés) para el diagnóstico de Leptospira en animales terrestres (OIE 2018) y las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud (WHO 2003).
Una vez listo el panel de referencia que incluyó siete serovares (Tabla 1), se contaron las leptospiras en una cámara Petroff-Hausser y la concentración se ajustó a 1 x 108 leptospiras/mL. El suero se diluyó 1:25 en buffer fosfato salino (PBS por sus siglas en inglés) estéril como dilución inicial para la detección en una placa para ELISA de 96 pozos, después se incubó a 30 °C a baño maría con el antígeno vivo (50 μL de suero diluido y 50 μL ~108 de cultivo) para una dilución final del suero de detección de 1:50. Después de dos horas, se observó la reacción y se consideró positiva una aglutinación del 50% o más. Los sueros positivos se titularon utilizando diluciones seriadas de 1:50 a 1:1 600, repitiendo el procedimiento descrito. Los antígenos vivos se mantuvieron según lo descrito por la OMS (WHO 2003).
Tabla 1 Serogrupos y serovares utilizados en el diagnóstico de anticuerpos anti-Leptospira mediante la prueba de microaglutinación (MAT).
| Especie | Serogrupo | Serovares | Cepa de referencia |
|---|---|---|---|
| Leptospira borgpetersenii | Ballum | Ballum | Mus 127 |
| Leptospira interrogans | Pomona | Pomona | Pomona |
| Leptospira interrogans | Canicola | Canicola | Hond Utrecht IV |
| Leptospira interrogans | - | Hardjo | FMVZ-UV01 |
| Leptospira kirschneri | Grippotyphosa | Grippotyphosa | CAL4 |
| Leptospira santarosai | Tarassovi | Tarassovi | Moca 45 |
| Leptospira interrogans | Icterohaemorrhagiae | Icterohaemorrhagiae | UV |
Análisis estadístico
Los datos fueron agrupados de acuerdo con la frecuencia de contacto con Leptospira arrojada por la MAT. La exploración de asociación epidemiológica entre las características demográficas y de estilo de vida de los perros y la frecuencia de contacto (presencia de anticuerpos) se realizó mediante pruebas de Ji cuadrada (( 2). Se consideró un valor estadísticamente significativo de P < 0.05. Adicionalmente, para las variables que resultaron significativas se obtuvieron los odds ratio (OR) y los intervalos de confianza al 95% (IC 95%). Todos los análisis estadísticos se realizaron usando programación estadística en R (R Core Team 2024) en el ambiente Rstudio (Posit Team 2024).
Resultados y discusión
Se incluyeron 109 perros de los cuales 60 (55.05%) fueron machos y 49 (44.95%) hembras; 38 (34.86%) en edad juvenil, 44 (40.37%) en edad adulta y 22 (24.77%) geriátricos. De estos 32 (29.36%) fueron de talla pequeña, 55 (50.46%) de talla mediana y 22 (20.18%) de talla grande (Tabla 2). La mayor parte de los perros (78/109, 71.56%) no tuvieron acceso a las áreas selváticas; 97 (88.99%) pernoctaron afuera de la vivienda y 12 (11.01%) pernoctaron adentro de ella. De estos 90 (82.57%) convivieron con otro perro o perros en la misma vivienda y 19 (17.4%) fueron únicos en el predio (Tabla 2).
Tabla 2 Frecuencia de contacto con Leptospira por microaglutinación y factor asociado en perros de Maxcanú, Yucatán, México.
| Variables | Número de perros (%) n = 109 | MAT ≥ 1: 100 (%) n = 96 | MAT contra serovar específico ≥ 1: 100 (%) n= 27 | (2 | p | OR (IC 95 %) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Sexo | ||||||
| Macho | 60 (55.05) | 44 (45.83) | 10 (37.04) | 4.7 | 0.03* | 2.66 (1.08-6.52) |
| Hembra | 49 (44.95) | 52 (54.17) | 17 (62.96) | |||
| Edad | ||||||
| Juvenil | 38 (34.86) | 34 (35.41) | 9 (33.33) | 0.04 | 0.98 | |
| Adulto | 44 (40.37) | 39 (40.63) | 11 (40.74) | |||
| Geriátrico | 27 (24.77) | 23 (23.96) | 7 (25.93) | |||
| Talla | ||||||
| Pequeña | 32 (29.36) | 29 (30.21) | 9 (33.33) | 0.28 | 0.87 | |
| Mediana | 55 (50.46) | 48 (50) | 13 (48.15) | |||
| Grande | 22 (20.18) | 19 (19.79) | 5 (18.52) | |||
| Contacto con selva | ||||||
| Sin contacto | 78 (71.56) | 68 (70.83) | 21 (77.78) | 0.68 | 0.41 | |
| Con contacto | 31 (28.44) | 28 (29.17) | 6 (22.22) | |||
| Pernocta | ||||||
| Afuera de casa | 97 (88.99) | 85 (88.54) | 25 (92.59) | 0.48 | 0.49 | |
| Adentro de casa | 12 (11.01) | 11 (11.46) | 2 (7.41) | |||
| Número de perros en el predio | ||||||
| Uno | 19 (17.43) | 18 (18.75) | 6 (22.22) | 0.57 | 0.45 | |
| Más de uno | 90 (82.57) | 78 (81.25) | 21 (77.78) |
MAT = microaglutinación, (2 = prueba de Ji cuadrada, p = probabilidad, IC 95 % = intervalo de confianza al 95 %, *estadísticamente significativo.
Respecto a los serovares, se observó ocurrencia de anticuerpos contra todos las serovares empleadas en la MAT. Específicamente, las frecuencias de cada serovar se observan en la Tabla 3. El serovar con mayor proporción de reacciones fue L. interrogans Canicola Canicola (44.03% de los perros estudiados). Los perros que mostraron anticuerpos exclusivamente contra un serovar siguieron la misma tendencia general, observándose mayor proporción para Canicola (7.34%), seguida de Pomona (4.59%) y Grippotyphosa (3.67%).
Tabla 3 Frecuencia de reacciones de los sueros de perros evaluados por microaglutinación contra serovares de Leptospira (N = 109).
| Serovares | Perros con anticuerpos contra uno o más serovares (%) | Perros con anticuerpos contra un serovar específico (%) |
|---|---|---|
| L. borgpetersenii Ballum Ballum | 28 (25.69) | 3 (2.75) |
| L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa | 36 (33.03) | 4 (3.67) |
| L. interrogans Pomona Pomona | 35 (32.11) | 5 (4.59) |
| L. interrogans Icterohaemorrhagiae | 32 (29.36) | 3 (2.75) |
| L. interrogans Canicola Canicola | 48 (44.03) | 8 (7.34) |
| L. interrogans Hardjo | 21 (19.27) | 2 (1.83) |
| L. santarosai Tarassovi | 28 (25.69) | 2 (1.83) |
El contacto de serogrupos de Leptospira con perros de Yucatán ha sido documentado por MAT (Andrade-Silveira et al. 2014). Entre estos se encuentran Canicola, Australis (Ortega-Pacheco et al. 2017), Icterohaemorrhagiae (Ortega-Pacheco et al. 2008), Panama, Pyrogenes (Jiménez-Coello et al. 2008) y Grippotyphosa (Cárdenas-Marrufo et al. 2011). Adicionalmente, Torres-Castro et al. (2021) revelaron ADN de Leptospira. No obstante, a nivel regional son pocos los estudios sobre los factores asociados con el riesgo de contacto de estos animales con Leptospira (Ortega-Pacheco et al. 2017).
En perros de otros estados de México, también se han detectado anticuerpos contra serogrupos y serovares de Leptospira. Por ejemplo, en perros de Sinaloa, Hernández-Ramírez et al. (2017, 2020) hallaron anticuerpos, por medio de MAT, contra las serovares Canicola, Icterohaemorrhagiae, Bratislava, Grippotyphosa, Shermani, Pyrogenes, Pomona y Hebdomadis, y contra los serogrupos Ballum, Wolffi, Australis y Hardjo. Asimismo, Blum-Domínguez et al. (2013) en perros de Campeche, identificaron aglutinaciones contra serovares de L. interrogans, entre ellos Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Bataviae, Grippotyphosa y Hardjo.
En el presente estudio se encontró una frecuencia de 88.07% de sueros reactivos contra alguna de las serovares incluidas. Esta frecuencia es más elevada en comparación con las obtenidas en trabajos previos en perros de Yucatán realizados por Ortega-Pacheco et al. (2017) (45.2%, 42/93), Cárdenas-Marrufo et al. (2011) (36%, 22/61), Jiménez-Coello et al. (2008) (35%, 140/400), Ortega-Pacheco et al. (2008) (34%,122/350) y Vado-Solís et al. (2002) (19%, 36/192). Asimismo, estudios realizados con perros de otras partes de México reportan frecuencias más bajas. En Sinaloa, Hernández-Ramírez et al. (2017, 2020) encontraron un 9% (15/165) y 17% (18/106); mientras que, en Campeche, Blum-Domínguez et al. (2013) obtuvieron un 21.3% (69/323).
Recientemente, Cruz-Romero et al. (2024) reportaron una frecuencia del 100% (19/19) de anticuerpos contra distintas serovares (Ballum, Sejroe, Bratislava, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Grippotyphosa y Tarassovi) de Leptospira en perros ferales de la reserva ecológica del Pedregal de San Ángel, México. Este estudio es, hasta el momento, el único en identificar una seroprevalencia más elevada que la de este trabajo.
A nivel internacional, se han identificado diferentes frecuencias de anticuerpos contra serogrupos y serovares de Leptospira. En un metaanálisis realizado con registros históricos de 1989 a finales de 2019 sobre el contacto de perros con serogrupos de Leptospira, Ricardo et al. (2020) señalan que la frecuencia global de anticuerpos en estos animales es 18.5%. De manera similar, Pinto et al. (2017), en su revisión sobre investigaciones en perros de Latinoamérica, las frecuencias de seroreacción fueron desde 4.9% hasta 72% con una media de 20.1%. En ambos casos, la frecuencia de anticuerpos encontrada en los perros estudiados es mayor.
Sin considerar las aglutinaciones inespecíficas, la mayor frecuencia fue contra el serogrupo y serovar Canicola, lo cual es equivalente con lo reportado en perros de Sinaloa (Hernández-Ramírez et al. 2017) y de Lima, Perú, (Siuce et al. 2015). También, en perros de la región de Los Ríos, Chile, se identificaron anticuerpos contra este serovar (Lelu et al. 2015). El serovar Canicola ha sido asociado con casos de leptospirosis humana. Por ejemplo, en Texas, EUA, los perros que habitaban casas en las que se identificaron casos de leptospirosis severa en niños, estaban infectados con este serovar (Zamora et al. 1990). De igual manera, en Argentina, se describieron casos en pacientes sintomáticos febriles ocasionados por esta serovar (Landolt et al. 2022). Los sueros evaluados también presentaron aglutinaciones contra el serovar Pomona, lo cual, al igual que con el serovar Canicola, implica un riesgo para la salud pública y animal. En un estudio realizado en España, sueros recolectados de dueños de perros mostraron reacción contra este serovar, incluso en una frecuencia mayor que Canicola (López et al. 2019).
Las elevadas tasas de contacto con diferentes serovares de Leptospira como las encontradas en perros de Maxcanú están asociadas con la exposición directa con reservorios naturales (roedores) (White et al. 2017). La mayor parte de las aglutinaciones en los perros estudiados correspondieron a serovares de L. interrogans, identificada en roedores de Yucatán (Torres-Castro et al. 2014, 2018). Otro factor que influye en la presentación de altas tasas de seroconversión es la casi nula cobertura de vacunación contra Leptospira en perros de comunidades rurales de Yucatán (Torres-Castro et al. 2021). No obstante, la cobertura en perros de la ciudad de Mérida (capital de Yucatán) es de 52.4% (Ortega-Pacheco et al. 2020).
Se observó que las hembras de la población estudiada tuvieron mayor probabilidad de contacto con serovares de Leptospira que los machos. La información relacionada con este hallazgo es limitada. Este resultado difiere con lo reportado en estudios realizados alrededor del mundo donde los machos tuvieron mayor riesgo de contacto (Lee et al. 2014; Major et al. 2014; Azócar-Aedo y Monti 2016), pero es equivalente a lo descrito por Altheimer et al. (2020) en perros de Tailandia. Este hallazgo refleja la importancia del sexo para el contacto con Leptospira en algunas poblaciones de perros. Por lo tanto, se necesitan analizar otras características de conducta y fisiológicas de las hembras como son el ciclo estral (que genera contacto directo con varios machos, sobre todo, cuando hay acceso al exterior de las viviendas), cuidado de la camada y el olfateo urogenital que ha sido planteado como mecanismo de transmisión de Leptospira en perros (White et al. 2017).
Deben mencionarse las limitaciones metodológicas. Por ejemplo, el tamaño de muestra estudiado no es representativo ni se obtuvo por estadísticos, por lo que los resultados no incluyen a la población total de perros en el sitio de estudio. Igualmente, la MAT presenta reacciones cruzadas entre serovares y serogrupos endémicos de Leptospira, aunque es considerada la prueba oro para el diagnóstico de L. interrogans en perros de México y otras partes del mundo (Andrade-Silveira et al. 2024).
El presente estudio corrobora la alta exposición de perros del sureste de México a Leptospira, principalmente serovar Canicola. Se observó que las hembras de la población estudiada tienen asociación con distintas serovares de Leptospira. Son necesarios estudios enfocados en caracterizar su participación en los ciclos de transmisión de las diferentes serovares. Asimismo, debe realizarse vigilancia epidemiológica para identificar casos de leptospirosis humana ocasionadas por L. interrogan serovar Canicola, y para evitar brotes y epidemias en habitantes del sitio de estudio. Por último, se recomienda el uso de herramientas moleculares, como PCR, para identificar las especies de Leptospira en los perros expuestos.
