Introducción

La apicultura es una actividad subyacente al sector pecuario que proporciona materias primas para la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética nacional e internacional. Además, el sector apícola proporciona ingresos económicos para muchas familias¹. Sin embargo, uno de los grandes problemas de la apicultura son las malas prácticas de manejo y almacenamiento de los productos derivados de la colmena por parte de los apicultores, lo que favorece la presencia de plagas y provoca pérdidas económicas. Una de las plagas principales que afectan al sector apícola es la Aethina tumida, una especie conocida como "pequeño escarabajo de la colmena” que pudiera clasificarse como parásito de las abejas por la forma en la que se desarrolla a costa de las abejas dentro de la colmena. Esta especie es originaria de las regiones tropicales y subtropicales del África subsahariana², pero en los últimos 20 años, ha cobrado importancia internacional al haber extendido su presencia a diferentes partes del mundo provocando infestaciones de colonias de abejas, principalmente Apis mellifera scutellata y Apis mellifera capensis³.

Las principales afectaciones de la A. tumida en la apicultura incluye los daños estructurales a la colmena y la fermentación de la miel por los excrementos de adultos y larvas, lo que afecta directamente el registro de la colmena y el rendimiento y calidad de la miel obtenida^3,4. Cuando la infestación de A. tumida en las colmenas es extrema puede desencadenar una disminución de la población de abejas, debido a que los adultos se alimentan de crías de abejas, así como del polen y la miel, estos factores sumados a la presencia de otros parásitos o enfermedades pueden desencadenar el colapso de la colmena⁴. El control de esta especie se realiza por varios métodos entre los que se incluyen el fortalecimiento de las colonias de abejas y las buenas prácticas de manejo apícola, el uso de trampas, así como el uso de plaguicidas como el cumafós (CheckMite⁺™) y fluvinato que son empleados en el interior de la colmena o la permetrina que se aplica en los suelos alrededor de las colmenas. Los plaguicidas sintéticos son efectivos para el control de esta especie, sin embargo, su uso puede tener graves consecuencias que derivan en la contaminación de la miel y otros productos de la colmena, afectaciones al ambiente, alteraciones en la población de abejas, daños a la salud de los apicultores, así como la generación de plagas resistentes⁵.

La tendencia actual se ha centrado en el desarrollo de bioplaguicidas a partir de fuentes naturales, la aplicación de la biotecnología enzimática o el uso de depredadores o parasitoides naturales de la especie. Una de estas alternativas es el uso de quitinasas, enzimas altamente específicas que hidrolizan la quitina, un carbohidrato que forma parte del 75 % del exoesqueleto de los insectos, el cual les confiere resistencia y rigidez⁶, y que se podrían emplear de manera combinada con trampas en el interior de las colmenas que permitan el ingreso de las plagas y que eviten el contacto con las abejas. Además, algunos autores han mencionado que las quitinasas promueven un efecto antialimentario en larvas de insectos debido a que afectan la estructura de la membrana perotrófica de sus intestinos, promoviendo la disminución en el éxito de la pupación y aumentando la mortalidad en las etapas de larvas y pupas^7,8. Las bacterias del género Bacillus son unas de las mayores fuentes de compuestos naturales biológicamente activos⁹, que producen numerosos metabolitos secundarios y una gran cantidad de enzimas, además, dentro de este género se encuentran algunas especies denominadas seguras y favorecedoras para los cultivos y el medio ambiente como B. subtilis, B. licheniformis y B. pumilus, sin embargo, antes de su utilización en campo se deben evaluar ampliamente en términos de bioseguridad¹⁰. Varias especies de Bacillus muestran actividad quitinolítica, como Bacillus pumilus¹¹, B. licheniformis cepa LHH100¹², B. licheniformis^13,14. Debido a que las quitinasas hidrolizan la quitina, un polisacárido encontrado en alta proporción en insectos, hongos, levaduras y estructuras internas de algunos vertebrados, varios estudios se han enfocado en el uso de estas enzimas para el control biológico de patógenos que afectan a las plantas y de plagas de insectos que afectan al sector agrícola^14,15,16.

Al momento no existen estudios en los que se haya probado la efectividad de las quitinasas sobre A. tumida, pero debido al alto porcentaje de quitina que contine su exoesqueleto⁶ y el efecto alimentario que ha sido reportado en otros estudios se considera que la aplicación de quitinasas⁷⁾ pudiera ser una alternativa viable para su control. Sin embargo, las abejas también cuentan con un alto porcentaje de quitina en la composición de su exoesqueleto y podrían verse afectadas de manera indirecta durante su aplicación, por lo que, de ser efectivo el tratamiento, en los siguientes estudios se propondría evaluar diferentes métodos de aplicación en los que se podría combinar el uso de atrayentes químicos (feromonas) y trampas que permitan el ingreso de larvas o adultos de A. tumida pero no de abejas, para evitar afectaciones en la colmena. Por lo anterior, el presente trabajo es el primero de una seria de estudios que tiene la finalidad de generar las bases para el desarrollo de un tratamiento efectivo y natural para el control de A. tumida mediante la determinación del efecto coleoptericida de una quitinasa obtenida de B. licheniformis UV01 y expresada en Escherichia coli BL21 (DE3) en condiciones de laboratorio.

Material y métodos

Las cepas de Escherichia coli BL21 (DE3) productoras de la quitinasa recombinante fueron obtenidas del cepario del laboratorio de química y genómica de la Facultad de Bioanálisis campus Veracruz. Para la obtención del extracto crudo de la quitinasa recombinante se preinocularon las cepas Escherichia coli BL21 (DE3) en agar Luria Bertani (LB) adicionado con Kanamicina (10 mg/ml) para obtener un crecimiento exponencial de cultivo celular. Se realizó un cultivo de 50 ml de medio LB adicionándole isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para inducir la expresión de la proteína de interés (quitinasa) dejando la incubación durante 8 h a 37 °C y agitación de 220 rpm. Para obtener el extracto crudo enzimático se sonicó el cultivo durante 20 ciclos de 15 seg con 30 de descanso con la subsecuente centrifugación 17,200 xg durante 15 min y 4 °C¹⁷. El extracto crudo obtenido se almacenó a 4 °C en recipientes herméticamente tapados hasta su uso en los ensayos con A. tumida.

La viabilidad de la enzima recombinante como una alternativa natural para el control de A. tumida, se determinó mediante la evaluación de su actividad quitinolítica. Para esto, se adicionaron 500 ml de extracto crudo enzimático en un tubo eppendorf^® y se incubó a 32 °C por 5 min. Posteriormente, se adicionaron 500 ml de quitina coloidal al 1 % en buffer de fosfatos pH 6.0 100 mM y se incubó a 32 °C por 1 h. Después de la reacción se cuantificó la concentración de azúcares reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalisílico (DNS)¹⁸, como una medida indirecta de la concentración de N-acetil-D-glucosamina liberada en la reacción. La actividad enzimática se definió mM de N-acetil-D-glucosamina liberados min^-1 a 32 °C (pH 6). Como control negativo se evaluó la actividad quitinolítica de un extracto crudo de cepa no recombinante de Escherichia coli BL21 (DE3).

Las colonias de A. tumida silvestres se establecieron con adultos (machos y hembras) sanos recolectados de apiarios de la zona centro del estado de Veracruz que se acondicionaron en cámaras de cría con medio de mantenimiento (agua y alimento). Las cámaras de cría se diseñaron a partir de cajas Petri de 60 ×15 mm marca Científica Senna^®, a las que se les realizó una perforación central de 4 cm de diámetro para favorecer la ventilación. El medio de mantenimiento consistió en la administración cada tercer día de 1 g de alimento elaborado con miel, polen y cebada de cerveza (1:1:1). Una vez que ovipositaron los escarabajos se reubicaron en otra caja Petri y las larvas que eclosionaron se mantuvieron con las mismas condiciones de alimento y agua por un periodo de 3 semanas, posteriormente, se colocaron en cámaras de empupado. Para esta etapa, se diseñaron cámaras que consistieron en recipientes de plástico con una capacidad de 1 L a los cuales se les agregó – partes de arena y en la parte superior se adaptó una caja Petri con una perforación en la base que les permitió a las larvas descender e iniciar su etapa de empupado. Los nuevos individuos se ubicaron en cámaras independientes a las primeras generaciones y fueron mantenidos con las mismas condiciones de agua y alimentación. Todas las etapas de desarrollo de la A. tumida se mantuvieron en una estufa de cultivo (Benchtop incubator 12E, Quincy Lab Inc. Illinois, USA) a 28 ± 2 °C y una humedad relativa promedio de 82 ± 3 % que se midió con un termohigrómetro (HTC-2 Uplayteck, México). La HR se estabilizó agregando una torunda de algodón con 5 ml de agua al interior de las cámaras de cría, la cual se cambió cada 48 h. Para los ensayos de actividad coleoptericida se utilizaron escarabajos en estadio adulto con metamorfosis completa con una edad de 10 días (de tonalidad oscura y completamente esclerosado). Para las pruebas en el estadio larvario, se utilizaron larvas de 3 a 4 días posterior a su eclosión¹⁹.

Para preparar las diferentes unidades de actividad a evaluar en el ensayo coleoptericida se cuantificó su actividad de la enzima recombinante y a partir de ésta se evaluaron 8 concentraciones (0.42, 1.26, 2.10. 4.20, 8.40, 12.60, 16.80 y 21.00 U/ml). El extracto crudo de quitinasa recombinante se mezcló con el alimento y se administró a grupos de 10 escarabajos o larvas para cada una de las concentraciones evaluadas y se determinó el efecto agudo a las 24, 48 y 72 h. Para el grupo control se administró alimento de mantenimiento sin enzima para ambos estadios. Se consideró muerto todo aquel espécimen que no caminara o no respondiera a la manipulación con las pinzas de disección Luzeren^®. En todos los ensayos, los escarabajos y larvas tratados se mantuvieron a una temperatura de (28 ± 2 °C) con oscuridad relativa. La variable respuesta fue el porcentaje de mortalidad de los escarabajos y larvas (24, 48 y 72 h después de iniciado el ensayo). Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

Los datos de mortalidad fueron analizados estadísticamente mediante un análisis de varianza (ANDEVA) a un nivel de significancia de 0.05 y comparación de medias por medio de la prueba de Tukey usando el paquete estadístico SAS versión 9.3. Para el cálculo de las CL₅₀ y CL₉₀ se empleó el análisis Probit²⁰.

Resultados y discusión

El extracto crudo de quitinasa recombinante presentó 42 unidades de actividad enzimática por mililitro (U/ml), las cuales fueron tomadas como base de cálculo para ajustar las unidades de actividad que se evaluaron sobre A. tumida. El extracto crudo de la enzima no recombinante no presentó actividad quitinolítica, lo que comprueba la viabilidad de la enzima recombinante. Una vez que el alimento con enzima recombinante se administró a las larvas y adultos de A. tumida se evaluó la mortalidad cada 24 h hasta las 72 h. La máxima mortalidad de larvas de A. tumida se observó a las 48 h de administración del alimento, posterior a ese tiempo ya no hubo mortalidad de larvas. Debido a esto, el cálculo de las CL₅₀ y CL₉₀ se realizó con las observaciones obtenidas en este tiempo.

Determinación de la CL₅₀ y CL₉₀

Los datos de mortalidad de larvas se emplearon para realizar el análisis Probit y calcular las unidades de actividad quitinolítica requeridas para promover la mortalidad del 50 (CL₅₀) (Figura 1) y 90 % (CL₉₀) (Figura 2) de la población, que fueron de 27.03 y 168.93 U/ml, respectivamente. El efecto coleoptericida mostrado por el extracto crudo de la quitinasa de B. licheniformis UV01 confirma su potencial uso como método alterno de control de A. tumida.

Figura 1 CL₅₀ del extracto crudo de quitinasa recombinante sobre larvas de A. tumida 

Figura 2 CL₉₀ del extracto crudo de quitinasa recombinante sobre larvas de A. tumida 

Estos resultados son comparables con otros estudios^23,24,25) en los que han empleado quitinasas recombinantes que han resultado en alternativas prometedoras en el control de plagas.

Discusión

Las quitinasas recombinantes obtenidas a partir de B. licheniformis han sido evaluadas en varios estudios con resultados prometedores en el control de especies que afectan al sector agropecuario. El extracto crudo con quitinasa de B. licheniformis USMW10IK se ha evaluado en especies como termitas Globitermes sulphureus indicando que posee propiedades bioinsecticidas con una letalidad del 23.81 % a las 48 h de exposición²⁵. Asimismo, se ha propuesto que las enzimas producidas por el género Bacillus son una alternativa efectiva de biocontrol contra fitopatógenos o plagas de insectos a través de la degradación de la pared celular o cutículas de insectos²⁶. La actividad quitinolítica del género Bacillus ha sido reportada contra diversas plagas que afectan las plantas y frutos con una efectividad superior al 60 %^27,28. Esta característica sugiere que las quitinasas tienen la capacidad para ser empleadas como una herramienta sostenible en el manejo de plagas^28,29.

En el presente trabajo se evaluó el uso de una quitinasa recombinante de B. licheniformis para el control A. tumida, obteniendo resultados destacados sobre el estado larvario, pero sin efecto en el estadio adulto. La nula efectividad de los extractos de quitinasa recombinante en el estadio adulto se debe probablemente al método de aplicación ya que, al combinarla con el alimento, la enzima está expuesta a componentes que pudieran disminuir su actividad, sumado al mecanismo de alimentación de algunos escarabajos depredadores que pueden incluir enzimas proteolíticas, que afectaría la actividad de la quitinasa.

Contrario a los adultos, las quitinas promovieron la mortalidad de hasta el 45 % de larvas, esto puede deberse a que en este estadio A. tumida presenta diferencias notorias, ya que consume su alimento en forma líquida, secretando enzimas a su alimento antes de ingerirlo²¹, tiene una mayor tasa de alimentación debido a los requerimientos nutricionales y energéticos que necesita para realizar su metamorfosis final, y se ha mencionado que las quitinasas pueden promover alteraciones en las membranas peritrópicas de los intestinos de larvas que desencadenarían un efecto antialimentario y el aumento de la mortalidad⁷. Lo anterior se reflejó en los resultados de mortalidad de las larvas, la cual aumentó conforme aumentó las unidades de actividad de la enzima recombinante. Este resultado es notable, ya que se empleó un extracto crudo de la enzima que presentó 42 U/ml, lo que supondría que se puede mejorar su actividad quitinolítica mediante el uso de diferentes vectores de expresión o de células hospedadoras que aumenten la producción de la enzima, así como optimizando las condiciones de fermentación y los componentes del medio de cultivo²⁹.

Conclusiones e implicaciones

El potencial de los extractos crudos de quitinasa recombinante en el control de plagas del sector agropecuario es prometedor debido a su efecto insecticida. Además, su uso sustentable en el control de especies como A. tumida posiblemente disminuiría los daños provocados por los plaguicidas sintéticos como la contaminación del ambiente, las abejas y los productos derivados de la colmena; así como las afectaciones a la salud de los apicultores. No obstante, es fundamental continuar con los estudios para mejorar su actividad quitinolítica, evaluar métodos de aplicación que promuevan una mayor actividad coleoptericida, identificar la ventana de bioseguridad en la que no se afecte a la abeja y establecer estrategias para su aplicación en las colmenas mediante el uso combinado de trampas o dispositivos en los que solo puedan ingresar los escarabajos.