Aislamiento de Ralstonia solanacearum

Las muestras de papa fueron colectadas de cultivos de las comunidades San José y Congona, provincia de Cutervo. Se recolectaron 100 tubérculos con síntomas, los cuales fueron depositados en bolsas de Ziploc y transportadas al laboratorio donde se siguió la recomendación de ^{Fornos et al . (2021)}, que consistió en lavar cinco veces con agua destilada, luego desinfectado con alcohol al 70%. Enseguida, con un bisturí se realizó un corte al tubérculo y de la zona afectada se obtuvo una alícuota del exudado bacteriano y se sembró en placas con agar cloruro de tetrazolio (TZC) para ser incubadas a 30 °C por 48 h. Las colonias de R. solanacearum fueron de forma irregular, color rojo, bordes blancos.

La identificación se realizó sobre la base de características morfofisiológicas ^{(Phondekar et al ., 2020)} mediante coloración Gram, test de hidróxido de potasio al 3%, catalasa, oxidasa, pruebas de citrato, triple azúcar de hierro (TSI), Lisina hierro (LIA); motilidad, Indol y Ornitina (MIO) (Figura 1).

Figura 1 Aislamiento e identificación de R. solanacearum. A y B) selección y recolección de tubérculos; C) extracción del flujo del anillo vascular; D) bacilos gram negativos del flujo vascular; E) unidades formadoras de colonia en TZC y F) reacción bioquímica. 

Aislamiento de Streptomyces spp.

Se colectaron 95 muestras de tierra de cultivo de papa a una profundidad de 2 a 8 cm y depositadas (5 a 10 g) en bolsas ziploc. Luego se procesaron según recomendaciones de ^{Parada et al . (2017)} haciendo diluciones seriadas hasta obtener 1x10^-3 g ml^-1 y pasteurización a 70 °C por 15 min. A partir de cada dilución se sembraron 100 µl en placas de Petri con agar avena y fueron incubadas a 30 °C por siete días. Para la identificación se consideraron características macroscópicas de las colonias tales como: tipo, tamaño, difusión de pigmento, coloración del micelio aéreo y vegetativo. Además, se realizó la tinción de Gram, técnica de microcultivo y fermentación de azúcares (Figura 2).

Figura 2 Aislamiento e identificación de Streptomyces spp. A) muestras de suelo; B) diluciones; C) unidades formadoras de colonias en agar avena; D) aspecto macroscópico; E) observación microscópica y F) fermentación de azúcares. 

Evaluación del antagonismo

Se empleó la metodología de estrías perpendiculares descrita por ^{Hossain y Rahmanll (2014)} que consistió en sembrar por agotamiento y estría la cepa de Streptomyces spp. en la parte central de una placa de Petri conteniendo agar Mueller Hinton e incubado a 30 °C por siete días. Luego se sembraron las cepas de R. solanacearum en forma perpendicular y se incubaron a 30 °C por 48 h. Se realizó la lectura midiendo el halo de inhibición, considerando antagonismo positivo cuando la estría de R. solanacearum inició su crecimiento por lo menos a 5 mm de distancia de la estría del Streptomyces spp.

Diseño experimental y análisis estadístico

El efecto antagónico, se evaluó aplicando el análisis de varianza (Anova) ajustándose al diseño factorial 50 x 28 x 3 para demostrar las diferencias entre los cincuenta aislamientos de Streptomyces, veintiocho de R. solanacearum y tres repeticiones, generando 4 200 unidades experimentales. El análisis estadístico de las diferencias entre los promedios de inhibición se complementó con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey al 0.05% de probabilidad. Para ello se usó el software estadístico Statística.

Aislamiento in vitro de R. solanacearum

Las tres variedades de papa: chaucha, molinera y única fueron obtenidas de las comunidades San José y la Congona, Provincia de Cutervo. El 45% de aislamientos fueron bacilos Gram negativos, de los cuales 28% resultaron ser R. solanacearum, siendo el mayor número de asilamientos de la variedad molinera 47.4% (Cuadro 1).

Existe reportes de aislamientos de R. solanacearum a partir de seudotallos de platano, berenjena y tomate (^{Ling et al ., 2020}; ^{Kaari et al ., 2022}). Donde las solanáceas tienen predisposición por sustratos como glutamina, asparagina, aminoácidos y azúcares que impulsan el crecimiento bacteriano ^{(Baroukh et al ., 2022)}. Por otro lado, ^{Vargas et al . (2023)} afirma que la presencia de genes R ayudan a reconocer proteínas patógenas. Además, una elevada tasa de transpiración y estructura de la xilema favorece la difusión de la bacteria ^{(Mamani, 2015)}.

La microbiota del suelo, mientras esté en equilibrio, evitará que los patógenos alcancen niveles suficientes para causar enfermedades ^{(Zhang et al ., 2022)}. Sin embargo, el uso de plaguicidas, fertilizantes nitrogenados, deficiencia de fósforo y potasio, reduce a microorganismos beneficiosos ^{(Cao et al ., 2022)}. Por otra parte, Ralstonia se propaga con rapidez en suelos ferralíticos a pH entre 5 a 7 y a temperatura entre 25 y 35 °C. Además, utiliza factores de virulencia como el sistema de secreción tipo III (T3SS), motilidad, biopelículas y exopolisacáridos (EPS) para infectar las plantas y obstruir la xilema ^{(Vailleau y Genin, 2023)}. Así, manipula el metabolismo de la planta hospedadora, donde el ácido galacturónico y el ácido salicílico liberado por las paredes celulares de las plantas, lo emplean para su nutrición. Mientras que el ácido L-glutámico promueve la producción de factores de virulencia ^{(Shen et al ., 2020)}.

Aislamiento y evaluación in vitro de antagonismo de Streptomyces spp.

De 95 muestras de suelo, se aislaron 50 cepas de Streptomy ces spp., 34% fueron pigmentadas y 64% no presentaron esta característica, además el 22% mostraron antagonismo (Cuadro 2). En la Figura 3, se muestra el antagonismo positivo de la cepa 10 de Streptomyces spp. que logro inhibir a las cepas 16, 17, 19 y 26 de R. solanacearum.

Figura 3 Antagonismo positivo y negativo de la cepa 10 de Streptomyces spp., frente a R. solanacearum por estrías perpendiculares en agar Mueller Hinton: A) cultivo reverso y B) cultivo anverso. 

En la investigación se logró obtener hasta cinco aislamientos diferentes de Streptomyces spp., en una sola muestra y en otras no se obtuvo ninguna cepa. Sin embargo, ^{Espinosa et al . (2021)} indica que la presencia y diversidad de la bacteria dependen de nutrientes, pH del suelo, competidores microbianos, actividad biológica y química del suelo. Por otra parte, la producción de pigmento difusible fue variable, similar al reporte de ^{Antido y Climacosa (2022)}, donde 14 cepas fueron gris, amarillo y rosado, atribuido a pigmentos sintetizados como la melanina, actinorodina, prodigiosina, Carotenoides y compuestos poliquétidos, cuya producción depende de condiciones ambientales, metabolismo y genética bacteriana ^{(Abraham y Chauhan, 2018)}.

El 22% de Streptomyces spp., demostraron actividad antimicrobiana, destacándose las cepas 21, 10 y 16 por su mayor antagonismo. Hallazgos similares reportados por ^{Zaki et al . (2022)}; ^{Kaari et al . (2022)}, obtuvieron 9 y 4 cepas antagónicas, respectivamente. Pero difiere al tener menor radio de acción a los reportados por ^{Ling et al . (2020)}, que obtuvieron una zona de inhibición de 30.5 y 32.8 mm. Esta diferencia depende de la interacción de factores, que incluyen la diversidad genética, síntesis de peroxidasa que degrada los componentes de la pared celular y la producción de antibióticos.

La actividad antagónica se evaluó a través del análisis de varianza Anava encontrándose diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos de las 50 cepas de Streptomyces y 28 de R. solanacearum, así como sus interacciones, donde el valor p (0) demuestra que existe capacidad antagónica (Cuadro 3).

Según la prueba discriminatoria de Tukey realizada a los diferentes tratamientos, se demostró que los promedios de antagonismo de las cepas S24, S47, S20, S39, S30, S33, S43, S18, S10, S16 y S21 de Streptomyces spp., mostraron diferente actividad antagónica. Las cepas de Streptomyces sp. (S24 y S47) mostraron menor espectro de inhibición, en comparación con la cepa de Streptomyces sp. 21 (Cuadro 4).

El hecho de que las cepas de R. solanacearum mostraran sensibilidad a las especies de Streptomyces indican un potencial significativo para el biocontrol. Sin embargo, aportó nueva información de cepas con espectro antagónico con ciertas limitaciones, como la efectividad variable de los aislados. Por lo que es necesario hacer más investigación para comprender los mecanismos de interacción y aplicación en las prácticas agrícolas generando una agricultura ecológica, sostenible y productiva.