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Introducción
Las enfermedades de las plantas son responsables de importantes pérdidas de cultivos en todo el mundo y representan una amenaza para la seguridad alimentaria mundial (Bevacqua et al., 2019). El empleo de extractos vegetales para el control de plagas y enfermedades en el marco de una agricultura sostenible constituye una alternativa promisoria, debido a su elevada efectividad, bajo costo y no ser contaminantes del ambiente (Rodríguez et al., 2000). Por ejemplo, los residuos orgánicos y subproductos de la agroindustria que resulten de fácil adquisición y proporcionen una elevada producción de conidias viables de hongos ( Rai et al., 2023). Así como el desarrollo de nuevas metodologías de producción masiva de biocontroladores que permitan reducir el costo de producción y viabilizar un mayor uso de este antagonista en los diversos cultivos (Arévalo et al., 2017).
Los hongos son microorganismos eucarióticos y heterótrofos, que requieren de compuestos orgánicos para su nutrición, ya que secretan enzimas las cuales ayudan a descomponer una gran variedad de sustratos, para absorber los nutrientes que hay en las hojas muertas y otros materiales orgánicos que se encuentran en el suelo (Ipiales et al., 2021). Un tipo de microorganismos benéficos en el suelo son los hongos Trichoderma spp, mismos que establecen una simbiosis de beneficio mutuo en raíces de plantas superiores para la absorción de agua y nutrientes (Liang et al., 2021).
Los sustratos comerciales permiten la optimización para la reproducción de microorganismos los cuales están compuestos por celulosa, hemicelulosa y lignina, estos sustratos incluyen paja de arroz y trigo, cáscaras de semillas de algodón, aserrín, papel de desecho, hojas y residuos de caña de azúcar (López- Mártinez et al., 2022). Se utilizan para reproducción de hongos (Akter y Sadia, 2020), además el género Trichoderma, suele aplicarse para mejorar la salud de los cultivos para manejar enfermedades de las plantas, como biofertilizante, biorremediador y agente de biocontrol ( Bhandari et al., 2021).
Ademas se han obtenido resultados alentadores tanto en sustratos como en reproducción conidial en medios ricos en carnes, glucosa y fuentes proteicas (Antomarchi et al., 2023). El objetivo de esta investigación consistió en evaluar la actividad biológica de reproducción conidial de Trichoderma asperelloides en diferentes medios de cultivos y sustratos orgánicos. La hipótesis planteada fue que al menos el 50% de los medios de cultivo presentará crecimiento micelial de T. asperelloides y efecto sobre los sustratos orgánicos comerciales.
Materiales y métodos
Lugar de estudio
El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en los laboratorios de Microbiología, Edafología y Análisis ambientales de la Universidad Tecnológica de la Tarahumara ubicada en Guachochi, Chihuahua, México (enero de 2023) en conjunto con el laboratorio de Microbiología Agrícola de la Facultad de Agricultura del Valle del Fuerte, de la Universidad Autónoma de Sinaloa de Juan José Ríos Sinaloa y el departamento de Fitopatología de la Universidad Autónoma de Occidente, Unidad regional los Mochis, Sinaloa (abril- junio 2023).
Obtención de aislados
Para la obtención de las cuatro cepas de T. asperelloides se seleccionaron aquellas con mayor grado de inhibición, las cuales ya han sido previamente identificadas como cepa 3 y 5, obtenidas del municipio de Morelos, Chihuahua con una variación climatológica de 12 a 49 °C (Porras et al., 2021) y la cepa 1 y 8, aisladas del municipio de Guachochi, Chihuahua con una temperatura entre -6 a 17.5 °C (Alvarado et al., 2019).
Obtención de sustratos
Para la reproducción masiva de T. asperelloides en sustratos sólidos de origen comercial se tomó en cuenta el arroz (Oryza sativa L.) (Arévalo et al., 2017), maíz (Zea mays L.), sorgo (Sorghum M.), trigo (Triticum L.), polvo de maicena (Feijóo-Vivas et al., 2021; López- Martínez et al., 2022) y avena con cáscara de durazno variedad amarillo nativo de la región.
Preparación de medios de cultivo
Todas las cepas se cultivaron sobre jugo de vegetales V8 al 5% (Camargo et al., 2021), papa dextrosa agar (PDA) agar dextrosa sabouraud (SDA) (Fletcher, 2019), 5 g de PDA con suplemento de polvo de trigo trituradas en un mortero (Ruschioni et al., 2020), 5 g de PDA con suplemento de polvo de aserrín de pino trituradas en un mortero (Zhang et al., 2021) 5 g de PDA con suplemento de polvo de eucalipto trituradas en un mortero con modificaciones (Ahmad et al., 2020), agar bacteriológico (Rodrigues et al., 2019), agar macConkey preparado en condiciones estériles estándar para evitar contaminaciones externas y de acuerdo las instrucciones del fabricante (Figura 1) (Kyei et al., 2020), todos los medios fueron sometidos a un rango de pH= 5.5 a 7, con alternancia de luz y oscuridad (14 y 10 h respectivamente), durante siete días en todos los medios de cultivo, a una temperatura ambiente de 7 °C ±2 para el bioensayo 1 durante el invierno (noviembre) de 2022 y a una temperatura ambiente de 17.5 °C ±2 el bioensayo en verano (mayo) de 2023.
Preparación de los sustratos
Con el propósito de eliminar las impurezas de los sustratos se tomó en cuenta la técnica de Gato (2010), para ello se vertió el arroz en agua del grifo durante 24 h, posteriormente se lavó profundamente hasta eliminar el almidón, enseguida se agregaron 250 g de ese arroz en bolsas de polietileno y se esterilizaron en autoclave (marca: Zhejiang Top Instruments, modelo: YX-18LD) a 121 °C por 60 min. Para maíz se molió a 1.3 g cm del grano y el sorgo se trituró hasta quedar pulverizado en una licuadora metálica ( marca: Waring, modelo: L.V.I.06714) se utilizaron frascos de cristal envueltos en papel aluminio con tapa plástica, donde se depositaron 250 g de ambos sustratos (Vázquez et al., 2009).
En trigo las semillas fueron desinfectadas superficialmente después de 5 min de remojó en solución de hipoclorito de sodio al 1%, seguido por la inmersión en agua estéril por 12 h, se colocaron en frascos de cristal con tapa plástica y se esterilizaron mediante autoclave por 15 psi a 121 °C (Velmourougane et al., 2019). En el sustrato de polvo de maicena se siguió la técnica con modificaciones de Zhang et al. (2021) en medio sólido se pesó 30 g polvo de maicena, mezclándolo con agua hirviendo con humedad relativa de 80%, se depositó en un contenedor de cristal de 250 ml y se esterilizó durante 30 minutos con 15 psi a 121 °C.
Para la preparación de avena con cascara de durazno variedad amarillo se licuaron 50 g de avena hasta quedar completamente polvo fino. Luego, se tomaron 200 g cáscaras frescas de duraznos nativas de la región, se cortaron en pequeños trozos de 5 cm los cuales, se mezclaron y se almacenaron en bolsas de polietileno para su posterior esterilización durante 8 minutos con 15 PSI a 121 °C.
Inoculación de Trichoderma asperelloides
Las cepas de T.asperelloides se desarrollaron en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) a los cuatro días de crecimiento (Arévalo et al., 2017), se realizó un raspado con un asa bacteriológica y con una jeringa se tomó una alícuota de 15 ml de la mezcla de agua destilada con el antagonista, se inyectó con el sustrato y se dejó reposar durante 45 días a 27 °C ±2, con 14 h luz y 10 h oscuridad y se removió el sustrato diariamente hasta obtener la esporulación del hongo (Cuenca et al., 2022), por otro lado a los sustratos contenidos en recipientes de cristal se agregaron 10 discos miceliales de 0.5 cm de diámetro por cepa. Los frascos se incubaron a la misma temperatura en completa obscuridad por 45 días (Vázquez et al., 2009).
Conteo de conidios a través de diluciones seriadas
Para el conteo de conidios se realizaron diluciones seriadas a partir de un gramo de sustrato colonizado con el hongo y se adicionaron a 9 ml de agua destilada estéril, por cada sustrato se realizaron seis repeticiones finalmente se tomó la lectura de seis alícuotas con una concentración 1 x 106 en la cámara de Neubauer o hematocitómetro (Arévalo et al., 2017).
Para el conteo de conidios en medios de cultivo se realizó un raspado de las cuatro cepas de T. asperelloides crecidas previamente en papa dextrosa agar (PDA) en los ocho medios de cultivo, con seis repeticiones con una concentración 1 x 106 , así mismo se utilizó la fórmula propuesta por Bastidas (2018): V2= C1XV1/C2. Donde= C1= concentración inicial (conocida en el conteo); V1= volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inóculo); C2= concentración final deseada (según el estudio a realizar) y V2= volumen final (desconocido).
Análisis estadístico
Para llevar a cabo el análisis del tratamiento con mayor producción conidial en sustratos y medios de cultivo se empleó un diseño completamente al azar con arreglo factorial, con respecto a las cuatro cepas de T. asperelloides. Para el análisis de varianza y la comparación de medias se realizó la prueba de media de Tukey-Kramer, con un valor alfa de 0.05%, con seis repeticiones. Estos análisis se llevaron a cabo mediante el paquete estadístico JMP, versión 9.0.1 (Statistical Analysis System, [SAS Institute Inc.], 2011).
Resultados y discusión
Concentración conidial de Trichoderma asperelloides en medios de cultivo
De acuerdo con los resultados estadísticos analizados se determinó la diferencia entre los tratamientos, se consideraron los ocho medios de cultivo para obtener una producción conidial promedio por cepa. La cepa 1 mostró una reproducción conidial de 533 conidios ml-1 en medio agar dextrosa sabouraud (SDA) con mayor producción de esporas, mientras que en el medio MacConkey se obtuvo una menor cantidad conidial, para la cepa 3 se logró visualizar un total de 695 conidios ml-1 y cepa 5 con 627 conidios ml-1 ya que contabilizó el medio de cultivo PDA con suplemento de polvo de trigo con mayor número de conidios y el agar bacteriológico con la menor cantidad y para la cepa 8 con 183 conidios ml-1 se logró visualizar que el PDA con suplemento de polvo de trigo con mayor número de conidios y el medio SDA como la mínima.
En cepa 1 se obtuvo el crecimiento radial diario de 2.4 cm en medio PDA con suplemento de polvo de trigo en el bioensayo 1 y 2.325 cm con una desviación estándar de 0.025 en promedio con el medio PDA en el bioensayo 2 y el medio agar MacConkey con el crecimiento mínimo de 0 cm en ambos bioensayos, en la cepa 3 se presentó 2. 58 cm en promedio más alto con el medio PDA suplemento de polvo de eucalipto en el bioensayo 1 y 2.36 cm en agar bacteriológico en el bioensayo 2 y el medio con menor crecimiento micelial fue agar MacConkey con 0 cm en ambos bioensayos, además en la cepa 5 se obtuvo 1.933 cm PDA y PDA con suplemento de polvo de aserrín en el bioensayo 1 y 2.4 cm en agar bacteriológico en el bioensayo 2 y el medio agar MacConkey con el crecimiento mínimo de 0 cm en ambos bioensayos y en la cepa 8 de 2.1 cm en promedio más alto con el medio PDA suplemento de polvo de trigo en el bioensayo 1 y 1.83 cm para el medio papa dextrosa agar (PDA) en el bioensayo 2 y el medio con menor crecimiento micelial fue agar MacConkey con 0 cm en ambos bioensayos.
Para comprobar el desarrollo in vitro de T. asperelloides en los medios de cultivo para el bioensayo 1, se observó un crecimiento significativo del hongo en medio de cultivo en PDA con suplemento de polvo de trigo (Figura 2 y 5) , PDA con polvo de eucalipto (Figura 3) y papa dextrosa agar y PDA con polvo de eucalipto (Figura 4) y para el bioensayo 2 papa dextrosa agar (Figura 2 y 5), agar bacteriológico (Figura 3 y 4), por lo que se registró un crecimiento visible en tres días, en cambio en el resto de los medios de cultivo el crecimiento fue más lento o incluso inexistente.
Figura 2 Crecimiento in vitro de T. asperelloides en medios de cultivo durante siete días de desarrollo de la cepa 1. Literales diferentes, entre renglones indican diferencias significativas (p≤ 0.05).
Figura 3 Crecimiento in vitro de T. asperelloides en medios de cultivo durante siete días de desarrollo de la cepa 3. Literales diferentes, entre renglones indican diferencias significativas (p≤ 0.05).
Figura 4 Crecimiento in vitro de T. asperelloides en medios de cultivo durante siete días de desarrollo de la cepa 5. Literales diferentes, entre renglones indican diferencias significativas (p≤ 0.05).
Figura 5 Crecimiento in vitro de T. asperelloides en medios de cultivo durante 7 días de desarrollo de la cepa 8. Literales diferentes, entre renglones indican diferencias significativas (p≤ 0.05).
Los resultados coinciden con los estudios realizados por Shina et al. (2018) quienes evaluaron cinco medios de cultivo, papa dextrosa agar (PDA), agar de papa y zanahoria (PCA), agar de zanahoria (CA), czapek-dox medio de agar (CDA) y jugo de vegetales (V8), al inocular T. viridae y T. harzianum, en este estudio se reporta que los mayores crecimientos radiales se encontraron en agar papa dextrosa mientras que el crecimiento más bajo se registró en el jugo de vegetales, dichos resultados cocncuerdan con los de esta investigación, en ambos bioensayos realizados, se observó un mayor crecimiento radial en papa dextrosa agar, además del nulo crecimiento en el medio MacConkey.
Por otro lado, investigaciones realizadas en Bangladésh reportaron el crecimiento de T. harzianum en papa dextrosa agar, agar papa dextrosa modificado, agar agua, agar zanahoria y agar harina de maíz donde se encontró el mayor crecimiento radial en papa destroxa agar (Jahan et al., 2013), estos resultados conincidieron con los de este estudio al demostrar que en el mayor número de cepas evaluadas el medio papa dextrosa agar prevaleció.
También Thomas y Gangadhara (2017) evaluaron ocho medios de cultivo (agar de jugo V8, agar sintético de Richard, agar sabouraud dextrosa, agar de harina de avena, agar de harina de maíz, agar zanahoria dextrosa, agar patata dextrosa, centeno agar) para el crecimiento de Phytophthora capsici durante cinco días en el cual desarrolló un mayor diámetro el agar sabouridad dextrosa con 69.5 mm de la colonia a diferencia de los resultados en T. asperelloides en que se mostró un crecimiento radial 0.7 y 1.9 cm en ambos bionesayos en todas las cepas evaluadas para el agar sabouridad dextrosa.
Al evaluar la producción conidial de las diferentes cepas de T. asperelloides en el municipio de Morelos, Chihuahua se consideran las variables climatológicas como un factor clave en el crecimiento del hongo al mostrar que la cepa 3 y 5 obtuvieron el mayor número promedio de conidios, ya que la temperatura promedio fue de 32 °C y la reproducción conidial en los diferentes medios varió de 1 x 106 a 1 x 109 en correlación con estudios previos realizados en San Paulo, Brasil al evaluar el efecto de factores específicos en la producción de conidios de T. asperelloides, T. erinaceum, T. erinaceum T-18 y T. harzianum, al medir variables clave como temperatura y la producción conidial en caldo de cultivo básico y el medio basal compuesto de 2 g de NaNO3, 1 g de K2HPO4, 0.5 g de KCl, 0.5 g de MgSO4 y 0.02 g FeSO4. T. asperelloides presentó el 100% de producción conidial en siete días de crecimiento con un pH de 3.5 y una temperatura optima de 30 °C en ambos medios con una producción conidial que varió de 1 x 108 a 2.6 0 x 108 (De Resende et al., 2020).
Análisis cuantitativo en los sustratos orgánicos comerciales sobre el crecimiento micelial de Trichoderma asperelloides
En general en todos los sustratos inicialmente se evidenció la formación de micelio de color blanco de T. asperelloides sobre el material vegetativo, posteriormente se tornó a verde pino, en el caso de avena con cáscara de durazno después de los 45 días el color se tornó a negruzco, así como en el sorgo se tardó 22 días en penetrar el hongo para realizar su invasión, además en maicena se formaron grumos entre 1 a 4.8 cm de diámetro después de los 39 días (Figura 6).
Figura 6 Reproducción masiva de Trichoderma asperelloides almacenados en bolsas de polietileno y contenedores de cristal de sustratos orgánicos comerciales.
En el resto de los sustratos, la presencia del hongo se mostró entre los 12 y 18 días. Los resultados indican que la reproducción conidial fue más efectiva en granos de arroz y semillas de trigo, ya que la invasión fue en su totalidad en menos tiempo en comparación con el resto, estos resultados se asimilan a los presentados por Mulatu et al. (2021) al evaluar especies de Trichoderma bajo fermentación en estado sólido, mediante 14 sustratos de orgánicos después de los 21 días de incubación, en la que se encontró que una mezcla de salvado de trigo y el arroz apoya el crecimiento máximo de T. asperellum (3.2 × 107 esporas g-1 sustrato seco) y T. longibrachiatum (3.5 × 107 esporas g-1 sustrato seco).
De acuerdo al análisis estadístico, todos los sustratos alcanzaron la concentración ideal de 1 x 106 conidios ml-1 con una pureza de 100% tanto en los inoculados en bolsas de polietileno como los contenidos en vidrio, así como también se determinaron variaciones de concentración entre los sustratos con respecto a las diferentes cepas. Se demostró que la cepa 3 presentó la mayor concentración en todos los sustratos; no obstante, no hubo diferencia significativa entre los tratamientos (Cuadro 1).
Cuadro 1 Concentración conidial de Trichoderma asperelloides y pureza de sustratos comerciales para el uso agrícola.
| Sustrato (tratamiento) | Número de cepa | Concentración (conidios g-1 de sustrato) | ||
|---|---|---|---|---|
| Arroz | 1 | 1x108 | a | |
| Maíz | 1 | 1x106 | a | |
| Sorgo | 1 | 1x106 | a | |
| Trigo | 1 | 1x109 | a | |
| Maicena | 1 | 1x108 | a | |
| Avena con cáscara de durazno | 1 | 1x106 | a | |
| Arroz | 3 | 1x109 | a | |
| Maíz | 3 | 1x107 | a | |
| Sorgo | 3 | 1x106 | a | |
| Trigo | 3 | 1x109 | a | |
| Maicena | 3 | 1x108 | a | |
| Avena con cascara de durazno | 3 | 1x106 | a | |
| Arroz | 5 | 1x107 | a | |
| Maíz | 5 | 1x107 | a | |
| Sorgo | 5 | 1x106 | a | |
| Trigo | 5 | 1x108 | a | |
| Maicena | 5 | 1x106 | a | |
| Avena con cascara de durazno | 5 | 1x106 | a | |
| Arroz | 8 | 1x107 | a | |
| Maíz | 8 | 1x107 | a | |
| Sorgo | 8 | 1x106 | a | |
| Trigo | 8 | 1x108 | a | |
| Maicena | 8 | 1x106 | a | |
| Avena con cascara de durazno | 8 | 1x106 | a | |
Literales diferentes, entre renglones indican diferencias significativas (p≤ 0.05).
A comparación de lo obtenido por Cáceres y Galliani (2020) quienes evaluaron sustratos orgánicos sobre T. viridae en aserrín, maíz de grano amarillo, harina de avena, alpiste, cáscara seca de frijol lima, grano de trigo, orujo de uva y vaina de huarango y sus resultados fueron favorables para cáscara de frijol con una mayor concentración de 2 x 109 conidios g-1 en cinco días de incubación y se obtubó el 100% de pureza en todos los sustratos.
Además, Perera et al. (2021) probaron diferentes tratamientos para el crecimiento de T. viridae al comparar paja de arroz, aserrín de madera, cáscara de arroz y hojas de plátano durante 36 días sus resultados fueron favorables al tener un efecto significativo en paja de arroz y aserrín en el desarrollo de Trichoderma en este caso coincidío con lo realizado en este estudio al encontrar los granos de arroz como mejor fuente de reproducción masiva y de inoculo de T. asperelloides.
Por otro lado, Silva et al. (2018) utilizaron la técnica planteada en este estudio para la inoculación de T. asperelloides y T. asperellum sobre gránulos de trigo con una concentración de 1 x 106 conidios ml-1 para determinar el mico parasitismo sobre Sclerotinia sclerotiorum y se tuvieron resultados de 100% de inhibición del hongo sobre el sustrato; no obstante, estudios realizados en Cuba han demostrado la reproducción masiva de T. harzianum en aserrín de pino blanco y se produjo el 29.87% de reproducción conidial sobre el bagazo de caña (Antomarchi et al., 2023).
Sin embargo, existió diferencia de esta investigación ya que el aserrín de pino solo fue sobresaliente en la cepa 5 con el mismo valor de PDA, mientras López-Martínez et al. (2022) confirma el olote de maíz como mejor sustrato para la reproducción de T. harzianum, T. harzianum, T. harzianum, Trichoderma sp. y T. longibrachiatum en comparación con el sustrato en granos de arroz el valor de 3.3 x 106 esporas en arroz y 1.74 x 106 en olote y se demostró que el olote es un sustrato ideal para la reproducción de los hongos sin tener que utilizar un alimento del ser humano.
Conclusiones
De los ocho medios de cultivo probados en cuatro cepas de T. asperelloides durante ambos bioensayos se destacaron papa dextrosa agar, agar bacteriológico y PDA con polvo de trigo con el valor más alto de crecimiento y el medio MacConkey no presentó crecimiento en los tratamientos y se demostró la cepa 3 con la más alta producción conidial al llenar una caja de 90 mm de los diferentes medios de cultivo en tres días de experimentación.
En todos los sustratos se presentó viabilidad para la reproducción conidial del hongo y se desmostró que las semillas de trigo y los granos de arroz son una fuente ideal para su crecimiento a temperaturas cálidas (17.5 °C ±2) y frías (7 °C ±2), por lo tanto se cumplió con el objetivo al confirmar la efectividad biológica de T. asperelloides en sustratos orgánicos comerciales, ya que se obtuvo el 100% de reproducción conidial y 87.5% de crecimiento micelial en medios de cultivo. Se recomienda probar los sustratos orgánicos en cultivos de la región ya sea en condiciones controladas como en campo abierto, agregándolos de forma sólida sobre el suelo, de igual manera se recomieda hacer uso del medio papa dextrosa agar para la reproducción conidial y así poder realizar las inoculaciones de forma liquida.
