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Introducción
La medicina tradicional mexicana atribuye propiedades terapéuticas a los extractos de cálices de jamaica (Hibiscus sabdariffa L. (Hs)) en afecciones como: presión arterial elevada, cálculos renales e inflamación (González-Stuart, 2011). Estas propiedades se asocian con los polifenoles de los cálices, entre los que predominan las antocianinas, ácidos fenólicos, flavonoles y proantocianidinas (Riaz y Chopra, 2018), cuya principal actividad biológica asociada a estos compuestos es su capacidad de neutralizar o captar radicales libres, y reducir su acción oxidativa sobre componentes celulares.
Los estudios sobre la efectividad de los extractos acuosos de jamaica en el tratamiento de las afecciones son numerosos, y se han realizado con diferentes alcances, entre los que se incluyen pruebas clínicas (Mckay et al., 2009) y con animales de laboratorio (El-Shiekh et al., 2020). En los estudios clínicos, no existe consenso respecto a la dosis terapéutica de tés o bebidas a base de jamaica. Sin embargo, la información disponible hasta ahora demuestra la baja toxicidad de los extractos empleados a dosis medias y bajas (Riaz y Chopra, 2018).
La composición fenólica de los cálices de genotipos de jamaica difiere según su pigmentación. Los cálices oscuros poseen mayor contenido de antocianinas que los cálices claros (Reyes-Luengas et al., 2015), y los cálices blancos contienen más flavonoles que los cálices rojos (Camelo-Méndez et al., 2016). La composición de volátiles, responsables del aroma de los cálices, también difiere entre genotipos, los de cálices claros son menos aromáticos que los de cálices oscuros (Musa et al., 2021).
La información científica publicada sobre diferencias en la composición química de cálices de jamaica con diferente pigmentación, y lo relacionado con dosis terapéuticas para la prevención o el control de enfermedades, puede utilizarse para formular bebidas nutracéuticas para consumidores interesados en obtener beneficios en la salud a partir del consumo de bebidas refrescantes de jamaica. El objetivo del presente estudio fue desarrollar una bebida a partir de mezclas de extractos de cálices de jamaica de genotipos con diferente pigmentación, con cualidades sensoriales aceptadas por los consumidores y alto contenido de antioxidantes.
Materiales y métodos
Material de estudio
Se utilizaron cálices deshidratados de jamaica de los genotipos Sudán (S) de cálices rojo oscuro, Alma Blanca (AB), de cálices blancos y Criolla Nayarit (CN), de cálices rojo claro. Los dos primeros se cultivaron en Santa María Cortijo, Jamiltepec, en la Costa del Estado de Oaxaca, el tercero en Nayarit, en el municipio de Xalisco.
Preparación de los extractos acuosos
Se pesaron 2.5 g de cálices base seca y se agregaron 100 ml agua destilada. La mezcla se puso en ebullición por 15 min, realizando dos ciclos de extracción. Los extractos de la primera y segunda extracción se combinaron, se aforaron a 200 ml con agua destilada y se filtraron con papel Whatman 4. A partir de estos extractos se elaboraron las diferentes formulaciones de bebida. La información sobre la caracterización física y química de los cálices de los genotipos de jamaica utilizados en las formulaciones de bebida fue publicada en un trabajo previo (Reyes-Luengas et al. 2015).
Elaboración de formulaciones
Se desarrollaron cuatro formulaciones que contenían al menos 21 mg de antocianinas totales/240 ml de bebida (Cuadro 1), cantidad de antocianinas requerida por día para lograr beneficios en aspectos como control de presión arterial moderada (McKay et al., 2009) o hipercolesterolemia (Gurrola-Díaz et al., 2010). El nivel de dulzor se ajustó a 7% con azúcar de caña. La preparación de cada formulación de bebida fue por duplicado.
Caracterización físico química de las bebidas formuladas
pH. Se midió con un potenciómetro Denver Instrument UB10, calibrado con buffers de pH 4 y 7. Acidez titulable (AT). Se utilizó el método para soluciones ligeramente coloreadas de la AOAC (1984). La acidez se expresó en miliequivalentes de ácido cítrico en % p/v. Color. Se empleó un colorímetro Hunter Lab Mini Scan XE Plus (modelo 45/0-L) en la escala CIEL*a*b*, con iluminante D/65, un ángulo de 10° y cápsula de cuarzo en la que se vertieron 30 ml de la bebida. A partir de los parámetros a* y b* se calcularon el Hue y el Croma. Se calculó el ΔE entre cada una de las diferentes bebidas mediante la expresión ΔE= √ (L1-L2)2 + (a1-a2)2+(b1- b2)2 (Wrolstad y Smith, 2010).
Caracterización fenólica de las bebidas formuladas
Antocianinas totales (CAT)
El CAT se realizó de acuerdo con lo descrito por Galicia-Flores et al. (2008). Se elaboró una curva estándar de cianidina-3-glucósido (Polyphenols, NW) con cinco puntos de curva (5-25 ppm, R2=0.9997) que se leyó en un espectrofotómetro Perkin-Elmer® lambda 25. El CAT se expresó en mg equivalentes de cianidina 3-glucósido (ECG)/240 ml de bebida.
Fenoles solubles totales (FST)
Los FST se analizaron con el método de Folin-Ciocalteu, según lo descrito por Galicia-Flores et al. (2008). Se utilizó ácido gálico como estándar, para expresar los resultados en mg equivalentes de ácido gálico (EAG) por 240 ml de bebida.
Proantocianidinas (PAs)
Las PAs se evaluaron con el método de Wallace y Giusti (2010). Se preparó una curva patrón de catequina (Sigma, MN). Los resultados se expresaron en mg equivalentes de catequina (EC) por 240 ml de bebida.
Capacidad antioxidante de las bebidas formuladas
Método DPPH
Un volumen de 2 900 (l de una solución de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) (Sigma-Aldrich®, México) 100 (M en metanol al 80% v/v se mezcló con 100 (l de bebida. Después de reposar 30 min en oscuridad y se midió la absorbancia a 515 nm. Como absorbancia de referencia (Absr) se consideró la obtenida al mezclar 100 (l de metanol al 80% con 2900 (l de DPPH. El porcentaje de DPPH reducido se calculó mediante la fórmula:
Dónde: Absr = Absorbancia de referencia de la solución de DPPH; AbsT= Absorbancia de la formulación a los 30 min (Prior et al. 2003).
Para determinar el IC50 se efectuaron diluciones de cada bebida formulada, con base en la concentración de fenoles solubles totales (FST) y se midió el porcentaje de DPPH reducido. Se graficó la concentración de fenoles totales vs porcentaje de DPPH reducido, después se ajustó a una regresión logarítmica para calcular el IC50. El IC50 es la concentración del extracto con la que se logra reducir el 50% del DPPH.
Método ORAC
Una alícuota de 20 μl de cada formulación se depositó en el pozo de una placa oscura de 96 pozos de fondo plano junto con 5 μl de buffer y 360 μl de fluoresceína 48 nM (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras se incubaron 30 s y se registró la fluorescencia inicial. La placa se leyó en un lector de microplatos (Synergy HT, Biotekinstruments) y se inició la reacción al agregar AAPH (2-2´-Azobis amidinopropano, generador de radicales libres) por medio del autodispensador del equipo (Ou et al. 2001).
Las muestras y el control (buffer en lugar de extracto) se analizaron por cuadruplicado. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron a 485 y 530 nm, respectivamente. Los datos de capacidad antioxidante (CA) se expresaron como equivalentes de Trolox (ET) por 100 ml de bebida ((mol de ET 100 ml-1).
Pruebas sensoriales
Se efectuaron pruebas discriminatorias para determinar diferencias entre las formulaciones de bebida. Para las pruebas de aceptabilidad global, se empleó una escala hedónica de nueve puntos, donde: 1 “me disgusta extremadamente”, 5 “ni me gusta ni me disgusta” y 9 “me gusta extremadamente”. Las variables evaluadas fueron: color, aroma, acidez, sabor a jamaica, sabor residual, dulzor y aceptación global. La evaluación se realizó con 65 panelistas.
Análisis estadísticos
Los datos de caracterización física y química de las bebidas y los atributos de la evaluación sensorial, se analizaron bajo un diseño completamente al azar. Con los datos de la caracterización física y química se realizó análisis de varianza de una vía y pruebas de comparación de medias (Tukey, p( 0.05) cuando fue procedente, mediante el programa SAS® versión 9.0 (SAS Institute, Inc., 2009). El análisis de componentes principales (PC) de los datos de la evaluación sensorial se realizó con el programa Unscrambler® versión 9.2 (Camo Process AS, Oslo, Norway). En este caso, la comparación de medias fue mediante la prueba de Duncan (p( 0.05).
Resultados y discusión
Caracterización fisicoquímica de las bebidas a partir de cálices de genotipos de jamaica
El pH difirió entre las bebidas, el mayor correspondió a B2 y el menor en B3 y B4, que contenían mayor proporción del extracto de la variedad CN (Cuadro 2). En todos los casos fue < 3, lo que favorece la forma química de catión flavilium de las antocianinas (Brouillard, 1982), su estabilidad y color rojo brillante característico. La AT varió entre 9.8 y 20.7%, con diferencia estadística entre las bebidas: la AT más elevada se presentó en las bebidas con extracto del genotipo AB (B1 y B4). El CAT de las bebidas fue alrededor de 24 mg ECG)/240 ml de bebida.
Cuadro 2 Caracterización física y química de las formulaciones de bebidas de jamaica preparadas a partir de cultivares con cálices de diferente pigmentación.
| Bebida | pH | AT | CAT | FST | PAs |
|---|---|---|---|---|---|
| B1 | 2.5 ±0.01 b | 18.4 ±0.29 b | 24.9 ±0.08 a | 111.42 ±0.91 a | 1.63 ±0.16 a |
| B2 | 2.55 ±0 a | 9.81 ±0.15 d | 23.1 ±0.15 c | 69.69 ±0.28 c | 1.44 ±0.14 a |
| B3 | 2.42 ±0.01c | 14.36 ±0.15c | 23 ±0.1 c | 73 ±0.97 c | 0.63 ±0.21 b |
| B4 | 2.42 ±0 c | 20.7 ±0 a | 24.1 ±0.13 b | 105.3 ±0.81 b | 1.19 ±0.14 ab |
| DMS | 0.02 | 0.72 | 0.49 | 4.64 | 0.68 |
DMS= diferencia mínima significativa; AT= acidez titulable (% p/v); CAT= contenido de antocianinas totales (mg equivalentes de ciandina 3-glucósido 240 ml-1 de bebida); FST= fenoles solubles totales (mg equivalentes de ácido gálico 240 ml-1 de bebida); Pas= proantocianidinas (mg equivalentes de catequina 240 ml-1 de bebida). Letras iguales en columnas son estadísticamente iguales (Tukey, (=0.05).
La diferencia en FST entre las bebidas se relaciona con la adición del extracto de la variedad AB, con un contenido elevado de estos compuestos (Reyes-Luengas et al. 2015). Sin embargo, todas las bebidas mantuvieron un contenido de FST por arriba de 65.55 mg, que es la dosis diaria requerida para lograr efectos benéficos (Mckay et al., 2009). Respecto a las PAs, los valores más elevados fueron en B1 y B2, atribuido a que su formulación incluyó mayor proporción del extracto de la variedad S, con mayor concentración de estos flavonoides que AB y CN (Reyes-Luengas et al., 2015).
Color de las bebidas de jamaica
La luminosidad (L) fue estadísticamente diferente entre las cuatro bebidas. Los bajos valores se relación con su color oscuro, que fue mayor en B1, y menor en B4. Todas las bebidas presentaron un tono rojo morado (valores positivos de a*). Los valores de b* en las bebidas fueron bajos (< 1), indicativo de leve tinte amarillo (Cuadro 3).
Cuadro 3 Parámetros de color y ΔE para las bebidas formuladas a partir de la mezcla de extractos de los genotipos de jamaica.
| Bebida | L* | a* | b* | Hue (°) | Croma | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| B1 | 2.17d | 2.6ab | 0.9825a | 20.7a | 2.78ab | ||
| B2 | 6.17c | 2.19b | 0.785a | 20.6a | 2.33b | ||
| B3 | 10.17b | 3.36a | 0.998a | 16.6a | 3.51a | ||
| B4 | 14.17a | 2.7ab | 0.93a | 19.2a | 2.86ab | ||
| DMS | 2.71 | 0.95 | 0.276 | 5.98 | 0.96 | ||
| Valores de ∆E entre las bebidas | |||||||
| ΔEB1-B2 | 4.0256 | ΔEB1-B3 | 8.0365 | ΔEB1-B4 | 12.001 | ||
| ΔEB2-B3 | 4.1737 | 8.0174 | ΔEB3-B4 | 4.0555 | |||
L*= luminosidad (%); DMS= diferencia mínima significativa. Letras iguales en columna son estadísticamente iguales (Tukey, α= 0.05).
Los valores de Hue corresponden a un tono rojo-morado. No se observó diferencia estadística para esta variable entre las bebidas analizadas. El índice de saturación de color o croma mostró valores bajos (2.33 - 2.86), lo que se asocia con alta presencia de tonos grises.
Las diferencias visuales de color entre las cuatro bebidas formuladas se expresaron por ∆E. Según Obon et al. (2009), una diferencia de ∆E entre 0 y 1.5 puede considerarse pequeña e imperceptible visualmente, de 1.5 a 5 la diferencia de color puede distinguirse, y resulta evidente para un ΔE superior a 5. Por tanto, el consumidor tendría dificultad para apreciar diferencias de color entre las bebidas B1 vs B2, B3 vs B2 y B3 vs B4, en tanto que apreciaría fácilmente las diferencias de color entre las bebidas B1 vs B3, B1 vs B4 y B2 vs B4.
Capacidad antioxidante
Método de DPPH
La capacidad antioxidante, en función de los valores de IC50, fue estadísticamente diferente entre las bebidas. El IC50 de B2 y B3 fue igual (p≤ 0.05), pero mayor al de B1 y B4. Un mayor IC50 implica menor poder antioxidante (Noreen et al., 2017) (Figura 1). La estandarización de la concentración de antocianinas en las bebidas provocó que los valores de IC50 fueran parecidos entre ellas.
Figura 1 Capacidad antioxidante expresada como IC50 de las bebidas de jamaica. Letras iguales en IC50 indican que no hay diferencias estadísticas significativas (Tukey, (=0.05).
Los menores valores de IC50, correspondieron a las bebidas B1 y B4, que contenían extracto del genotipo AB (Cuadro 1), que es abundante en ácidos fenólicos y otros flavonoides con capacidad antioxidante (Reyes-Luengas et al., 2015).
Método ORAC
Se presentó diferencia estadística de la capacidad antioxidante (CA) entre las cuatro bebidas (Figura 2). Las de mayor CA fueron B1 y B4, con igual CA entre sí, pero estadísticamente diferentes a B3. En B1 y B4 los valores de CA fueron 1080 y 1193 (moles ET por cada 100 ml de bebida, respectivamente.
Todas las bebidas presentaron valores superiores a 621.8 ±1.7 (mol TE por cada 100 ml, que es el valor reportado en el agua de jamaica preparada con el procedimiento tradicional que emplean las amas de casa en México (Sáyago-Ayerdi et al., 2007).
Evaluación sensorial
Únicamente los atributos de aroma y dulzor fueron diferentes entre las bebidas. La bebida con mejor aroma a jamaica fue B4, atribuido a que incorpora extractos de los tres cultivares de jamaica; en contraste, las bebidas B2 y B3 fueron las de menor puntuación (Cuadro 4), debido posiblemente a la ausencia del extracto del genotipo AB en su formulación (Cuadro 1). El aroma característico de las bebidas de jamaica se atribuye al balance cuantitativo de sus volátiles y no a la predominancia de alguno de ellos (Musa et al,.2021).
Cuadro 4 Comparación de medias de atributos sensoriales en bebidas de jamaica formuladas a partir de mezclas de extractos de cálices de genotipos con diferente pigmentación.
| Atributos | Formulaciones | DMS | |||
|---|---|---|---|---|---|
| B1 | B2 | B3 | B4 | ||
| Intensidad de color | 6.86 ±1.39† a | 6.68 ±1.46 a | 6.34 ±1.62 a | 6.72 ±1.49 a | 0.54 |
| Aroma | 5.62 ±1.92 ab | 4.92 ±2.15 b | 5.12 ±1.92 b | 5.95 ±1.76 a | 0.69 |
| Acidez | 5.48 ±2.09 a | 5.58 ±2.24 a | 5.78 ±1.82 a | 5.55 ±2.06 a | 0.84 |
| Dulzor | 4.97 ±2.19 b | 6.57 ±1.79 a | 6.08 ±1.78 a | 5.03 ±1.94 b | 0.75 |
| Sabor a jamaica | 6.09 ±1.87 a | 6.43 ±1.51 a | 6.31 ±1.58 a | 6.28 ±1.84 a | 0.66 |
| Sabor residual | 5.4 ±1.86 a | 5.85 ±1.8 a | 5.97 ±1.73 a | 5.71 ±1.94 a | 0.67 |
| Aceptabilidad global | 6.06 ±1.87 a | 6.66 ±1.63 a | 6.65 ±1.4 a | 6.34 ±1.76 a | 0.66 |
Valores promedio con la misma letra por fila son estadísticamente iguales (p< 0.05). DMS=diferencia mínima significativa.
Los panelistas percibieron las bebidas B2 y B3 como las de mayor dulzor; no obstante, que todas contenían 7% p/v de azúcar, debido a su menor acidez, al contener mayor cantidad de agua que el resto. Sobresale que, no obstante que la diferencia en AT fue de más de 10 puntos porcentuales entre las bebidas (Cuadro 2), los panelista no lo percibieron. Bechoff et al. (2014) evaluaron sensorialmente bebidas de jamaica con diferencias en acidez de hasta tres veces, sin que los panelistas las identificaran.
Los evaluadores tampoco identificaron diferencias de color entre las bebidas evaluadas, atribuido a que el ángulo de tono (Hue), que es el más asociado con la percepción visual del color (Wrolstad y Smith, 2010), fue igual entre las formulaciones de bebida. Al respecto, Bechoff et al. (2014) señalaron una falta de correlación entre el color rojo percibido por los panelistas y los parámetros de color L*a*b*.
Análisis de componentes principales de los atributos de evaluación sensorial
Las elipses representan correlaciones de cargas de 50 a 100% entre la primera y segunda (Figura 3). Todas las variables presentaron alta correlación, al ubicarse en el área de las dos elipses, a excepción de la variable intensidad de color (Int Color), ubicada fuera del área de la primera elipse, lo que significa que no se correlacionó con el resto de las variables. Ninguna de las variables analizadas mostró ubicación opuesta o de peso negativo.
El componente principal 1 (CP1) se explicó principalmente por el dulzor y acidez, atributos que se ubican a la derecha de la elipse, lo que significa que mientras más dulce y ácida sea la bebida, mejor aceptada será por los panelistas, resultado que coincide con lo encontrado por Bechoff et al. (2014). Para el componente principal 2 (CP2) las variables representativas fueron aroma e intensidad del color (Int Color). El CP1 explicó 52% de la variación total de los atributos determinados en las bebidas de jamaica, en tanto que el CP2 explicó únicamente 14% de dicha variabilidad (Figura 3 B).
Conclusiones
La mezcla de extractos acuosos de genotipos de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) con cálices de pigmentación contrastante mejora los atributos sensoriales de la bebida y la aceptación por el consumidor. La incorporación a la mezcla del extracto de la variedad sin pigmentación (Alma Blanca), favorece el sabor y aroma de la bebida, e incrementa su capacidad antioxidante.
