Cepas estudiadas

Se utilizaron cinco cepas nativas antagónicas, cuatro de Trichoderma asperellum (Ta6, Ta9, Ta10 y Ta11) y una de T. inhamatum (Ti14), aisladas de suelo cultivado con jamaica de los municipios de Tecoanapa y Ayutla, Guerrero, identificadas morfológica y taxonómicamente (^{Gams y Bisett, 1998}).

Las cepas de los hongos fitopatógenos P. parasitica y F. oxysporum fueron proporcionadas por el Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, aisladas y caracterizadas morfológica y molecularmente, con los números de depósito KM519189 y KM519188 en el NCBI (^{Ortega-Acosta et al., 2015}); estas cepas fueron cultivadas en el laboratorio de Biotecnología del Colegio Superior Agropecuario del estado de Guerrero, en papa- dextrosa-agar (PDA, Sigma®) y medio de cultivo con jugo de verduras V8®. La incubación se realizó a temperatura ambiente en cultivo estático con 12 h luz/oscuridad, durante 10 d; transcurrido este tiempo, se realizaron los ensayos de antagonismo.

Actividad antagónica in vitro de cepas de Trichoderma

Los cultivos duales para evaluar la actividad antagónica de los hongos nativos de Trichoderma contra los patógenos se realizaron in vitro, con 10 interacciones en total y sus testigos sin confrontación. Se usó un diseño experimental completamente al azar con cuatro repeticiones; la unidad experimental fue una caja Petri, donde se desarrollaron las confrontaciones.

En cada caja Petri con medio de cultivo PDA se depositó un disco de 5 mm de diámetro con micelio de los hongos patógenos (P. parasitica . F. oxysporum) y en crecimiento activo; cada disco se ubicó a 2 cm del extremo de la caja. Dos días después, en forma equidistante, se colocó un disco de micelio de 5 mm de diámetro de cada aislado de Trichoderma spp. con 10 d de crecimiento. La incubación se realizó a temperatura ambiente (≈ 23 ºC) con 12 h luz/ oscuridad y se observaron cada 24 h para registrar las variables siguientes: días al primer contacto entre hifas, zona de intersección, tipo de antagonismo, capacidad de esporulación de las especies de Trichoderma sobre las cepas de P. parasitica . F. oxysporum e interacción del organismo antagónico con el patógeno.

Cada tratamiento se clasificó con la escala 1 a 5 de antagonismo descrita por ^{Bell et al. (1982)}; donde 1) Trichoderma spp. sobrecrece completamente al patógeno y cubre totalmente la superficie del medio, 2) Trichoderma spp. sobrecrece dos terceras partes de la superficie del medio, 3) Trichoderma spp. y el patógeno colonizan cada uno aproximadamente la mitad de la superficie y ningún organismo domina al otro, 4) el patógeno coloniza dos terceras partes de la superficie del medio y parece resistir la invasión por Trichoderma spp. y 5) el patógeno sobrecrece completamente a Trichoderma spp. y cubre totalmente la superficie del medio.

La zona de intersección, descrita como el crecimiento del antagónico sobre el patógeno, se registró después del primer contacto entre hifas. Al observar crecimiento micelial, se realizaron mediciones con una regla en cm. Se midió la zona de traslape o intersección de las colonias, desde el disco de agar de Trichoderma spp. hasta la puntafinal del micelio; las mediciones se registraron cada 24 h, hasta que el testigo cubrió la superficie de la caja Petri.

La competencia por nutrientes y espacio se valoró al comparar la velocidad del crecimiento; se midió el radio de crecimiento de patógenos (RCP) y antagonistas (RCA) con la ayuda de un calibrador Pie de Rey (^{Stefanova, 2007}). Al mismo tiempo, se evaluó el porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR) con la fórmula PICR= (R1-R2)/ R1 x 100, donde R1 es el radio del patógeno testigo y R2 es el radio del patógeno en enfrentamiento (^{Ezziyyani et al., 2004}). Los datos se sometieron a análisis de varianza y prueba de comparación de medias múltiple (Tukey, P ≤ 0.05) con el paquete estadístico SAS V9.3 (^{SAS Institute, 2011}).

Contacto entre hifas

En los tratamientos confrontados, las hifas de ambos microorganismos hicieron contacto en promedio a los 3 y 4 días después de la siembra; se observó nulo crecimiento al momento del contacto con el agente antagónico en los aislados de P. parasitica . F. oxysporum. Este efecto se reportó contra Alternaria porri, al confrontarse con T. harzianum en pruebas in vitro, donde el fitopatógeno detuvo su crecimiento al contacto con el antagonista, que también mostró fuerte actividad micoparasítica y alta capacidad competitiva por espacio y nutrientes (^{Abo- Elyousr et al., 2014}). Al respecto, ^{Vargas-Hoyos y Gilchrist- Ramelli (2015)} mencionaron que cepas de T. asperellum mostraron habilidad para adaptarse a condiciones de crecimiento in vitro y colonizar en poco tiempo a Fusarium sp., lo que causó la inhibición del crecimiento del patógeno.

Zona de intersección

En las Figuras 1 y 2 se muestra el crecimiento dual de las especies de Trichoderma spp. sobre F. oxysporum . P. parasítica, respectivamnte. En las zonas de intersección se registraron variaciones de distancia entre 0.0 y 4.8 cm. La confrontación de T. inhamatum cepa 14 contra P. parasitica, (Ti14P) mostró la mayor intersección con 4.82 cm, seguido por Ta10P (T. asperellum cepa 10 contra P. parasitica) con 4.77 cm. Con F. oxysporum, estas dos cepas antagónicas de Trichoderma también presentaron los mejores resultados con una intersección de 4.11 y 3.46 cm (Cuadros 1 y 2). Cuando Trichoderma tiene el primer contacto con el hongo patógeno activa sus mecanismos de acción para colonizar al hospedero, y en algunos casos, como en el presente estudio, las cinco cepas de Trichoderma sobrecrecieron y redujeron a P. parasitica, mostrando evidencia de su alta capacidad micoparasítica por el enrollamiento y formación de apresorios y producción de quitinasas y glucanasas (^{Ghazanfar et al., 2018}).

Figura 1 Cultivos duales de Trichoderma asperellum (Ta6, Ta9, Ta10 y Ta11) y T. inhamatum (Ti14) contra Fusarium oxysporum (F. o). 

Figura 2 Cultivos duales de Trichoderma asperellum (Ta6, Ta9, Ta10 y Ta11) y T. inhamatum (Ti14) contra Phythopthora parasitica (P. p). 

Cuadro 1 Contacto, sobrecrecimiento y esporulación de especies de Trichoderma sobre Fusarium oxysporum. 

^†DPC: días al primer contacto.

^††Clase de antagonismo: 2 (Trichoderma sobrecrece dos terceras partes de la superficie del medio; ^{Bell et al., 1982}).

^¶CSP: crecimiento sobre el patógeno. Medias con letras iguales en columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05).

Cuadro 2 Contacto, sobrecrecimiento y esporulación de especies de Trichoderma sobre Phytophthora parasitica. 

^†DPC: días al primer contacto.

^††Clase de antagonismo: 1 (Trichoderma sobrecrece completamente al patógeno y cubre totalmente la superficie del medio; ^{Bell et al., 1982}).

^¶CSP: crecimiento sobre el patógeno. Medias con letras iguales en columnas no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05).

En los cultivos duales donde se presentaron zonas de interacción entre antagonistas y los dos patógenos se observó que entre mayor fue la intersección se desarrolló mayor hiperparasitismo de los aislados antagónicos sobre P. parasitica. En un estudio con T. harzianum vs. P. capsici la zona de inhibición aumentó a medida que transcurrió el tiempo por la destrucción del micelio del patógeno y algunas interacciones mostraron una zona de inhibición progresiva por la velocidad de crecimiento del antagonista (^{Ezziyyani et al., 2004}). La reducción en la tasa de crecimiento del patógeno en cultivos duales es un indicador de la capacidad antagónica de Trichoderma y puede visualizarse un aumento en la zona de intersección durante el periodo de incubación y reducción del diámetro de las colonias del patógeno (^{Guigón-López et al., 2010}).

Las diferencias entre las zonas de intersección se deben a la producción de antibióticos volátiles y no volátiles, mismos que se sintetizan al momento del contacto entre antagonista y fitopatógeno (^{González et al., 2012}; ^{Osorio et al., 2016}) y juegan un papel importante en el micoparasitismo (^{Harman, 2006}).

Capacidad de esporulación de Trichoderma spp.

Las cinco cepas de Trichoderma spp. presentaron esporulación, en particular Ta9 frente a P. parasitica y Ta10 frente a F. oxysporum, las cuales esporularon al tercer día después de la siembra en los cultivos duales (Cuadros 1 y 2). En otros ensayos, en pruebas de laboratorio, el comportamiento de aislados de Trichoderma spp. Sobre P. capsici retardó el crecimiento al colonizar y esporular sobre el patógeno; es decir, la esporulación fue gradual, pero la colonización de Trichoderma spp. fue rápida por el proceso micoparasítico (^{Ezziyyani et al., 2005}). Esta característica también fue detectada en T. harzianum, T. koningiopsis . T. asperellum contra P. capsici, al reducir la producción de esporangios y el crecimiento micelar de las dos cepas fitopatógenas (^{Ramírez-Delgado et al., 2018}). La inhibición y reducción de la esporulación del patógeno y la capacidad de esporular de Trichoderma es una muestra de su capacidad antagónica para frenar y colonizar a hospederos.

Clasificación del antagonismo

Las cinco cepas de Trichoderma spp. cubrieron por completo la colonia de P. parasitica y se ubicaron en la Clase 1 de antagonismo. En la confrontación dual entre las cepas de Trichoderma spp. y F. oxysporum todas presentaron la clase de antagonismo 2, donde Trichoderma creció en dos terceras partes de la superficie del medio (Figuras 1 y 2). En estudios con Sclerotium rolfsii también se reportó antagonismo Clase 1 al confrontarse con T. harzianum (^{Corrêa et al., 2007}); sin embargo, otros aislados de T. harzianum mostraron Clase 5 de antagonismo contra el mismo patógeno; esto sugiere que los aislados de la misma especie de Trichoderma tienen comportamientos distintos frente a un mismo organismo fitopatógeno, lo que se atribuye a la selectividad de Trichoderma spp. para producir mayor o menor cantidad de enzimas que hidrolizan paredes celulares, característica que está estrechamente relacionada con la capacidad micoparasítica, producción de compuestos antibióticos y fungistáticos (^{Ramos et al., 2008}; ^{Hermosa et al., 2012}). Este comportamiento diferencial de Trichoderma spp. hacia un mismo patógeno también se asocia a la variabilidad entre aislamientos del fitopatógeno aun de la misma especie. Específicamente, T. asperellum produce compuestos como el trichodermin, trichodermol, paracelsin a-d, trichobrachim y toxina T-2, entre otros metabolitos volátiles con actividad antifúngica, a los cuales se atribuyen los resultados observados en esta interacción (^{Parmar et al., 2015}).

Inhibición de P. parasitica . F. oxysporum por aislados de Trichoderma spp.

El porcentaje de inhibición de los cultivos duales se muestra en el Cuadro 3. T. inhamatum (Ti14) mostró una actividad sobresaliente en las pruebas de antagonismo y obtuvo 95 y 85 % de inhibición de P. parasitica . F. oxusporum, respectivamente, seguido de Ta10 con 89 y 85 % de inhibición para ambos patógenos. En pruebas con T. virens . T. harzianum contra F. oxysporum . F. subglutinans la inhibición del crecimiento de los patógenos fue superior a 60 %, por lo que se consideraron como agentes potenciales de control biológico contra hongos patógenos causales de la enfermedad escoba de bruja en mango (Mangifera indica L.) (^{Michel-Aceves et al., 2008}). La producción de compuestos antifúngicos que afecta la pared celular del patógeno causa micoparasitismo, detienen su crecimiento y aumentan su inhibición (^{González et al., 2011}).

Cuadro 3 Antagonismo de Trichoderma spp. contra P. parasitica y F. oxysporum en cultivos duales.Medias con letras iguales en columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05 

Con base en los resultados obtenidos, las cepas de Trichoderma spp. son potenciales biocontroladores de los agentes causales de la enfermedad Pata Prieta en jamaica, específicamente Ti14 y Ta10, ya que cumplen con las características esenciales para considerarse como un agente de control biológico eficaz, tales como alto nivel de competencia por espacio y nutrientes, alto micoparasitismo, menor tiempo de contacto entre hifas, mayor zona de intersección, esporulación sobre los patógenos e inhibición de éstos, fuerte actividad antibiótica y producción de sustancias que inducen fungistasis; además, tienen la ventaja de que son cepas nativas de la región productora de jamaica en Guerrero, lo que coadyuva en su efecto, potencial antagónico y control de los principales hongos patógenos del cultivo, ya que uno de los principales problemas en la efectividad del control biológico de fitopatógenos es que los organismos empleados no están adaptados a las condiciones ambientales locales donde serán aplicados y la producción enzimática se ve afectada por la temperatura y condiciones del ambiente (^{Parmar et al., 2015}).