Introducción

El chile (Capsicum annuum) es una hortaliza de gran importancia para México ya que es el segundo país con mayor producción a nivel mundial. En el 2023 se registró una producción anual de 3 681 061 t, aportando el 21.4 % de la producción nacional de hortalizas. Los principales estados productores fueron Chihuahua y Sinaloa (^{SIAP, 2025a}), este último cuenta con una superficie de siembra de 16 888.70 ha y una producción de 813,081.23 t, siendo el municipio de Escuinapa el de mayor superficie (4 962.00 ha) y producción (215,568.27 t) (^{SIAP, 2025b}). Sin embargo, este es afectado por diversas plagas y enfermedades, una de las más importantes es el nematodo agallador Meloidogyne spp., que ataca a una gran variedad de hortalizas como melón (Cucumis melo), tomate (Solanum lycopersicum) (^{Cristóbal-Alejo et al., 2021}), higuera (Ficus carica), betabel (Beta vulgaris), albahaca (Ocimum basilicum), calabaza (Cucurbita sp.) (^{Romero et al., 2019}), pepino (Cucumis sativus), sandia (Citrillus vulgaris), berenjena (Solanum melongena), tabaco (Nicotiana tabacum), cacahuate (Arachis hypogaea), entre otras más (^{Carrillo-Fasio et al., 2000}).

Los cultivos afectados por Meloidogyne spp., manifiestan la formación de agallas en las raíces, lo que impide la absorción y transporte de agua y nutrientes a las hojas, produciendo amarillamiento, marchitez, menor tamaño de la planta y frutos, y posteriormente la muerte (^{Velásquez-Valle et al., 2013}; ^{Dagatti et al., 2014}). También puede ocasionar hasta un 52

% de severidad en plantas de chile y en producción (^{Fernández-Santillán et al., 2016}; ^{Tola et al. 2023}). Entre las principales especies reportadas de Meloidogyne se encuentran; M. incognita, M. arenaria, M. javanica (^{Romero et al., 2019}; ^{Long et al., 2023}), M. enterolobii (Romero et al., 2019; ^{Carrillo-Fasio et al., 2020}; Long et al., 2023) y M. hapla (Martínez- Gallardo et al., 2019; Romero et al., 2019).

Para su control se utilizan compuestos químicos como oxamyl (Figueroa et al., 2016; ^{Avelar-Mejía et al., 2018}) y carbofuran (^{Medina et al., 2017}), los cuales son considerados altamente tóxicos para mamíferos, aves y abejas; además de presentar alta lixiviación y persistencia en el agua (^{Lewis et al., 2016}). No obstante, existen alternativas para el control de nematodos, como la siembra de variedades resistentes (^{Carrillo-Fasio et al., 2020}) o la aplicación de hongos parásitos de nematodos. Por ejemplo, Pochonia chlamydosporia parasita huevos de nematodos (^{Arévalo et al., 2012}), mediante la formación apresorios con los que penetra al interior (^{Lopez-Llorca et al., 2008}) y produce enzimas (proteasas y quitinasas) que degradan la pared de los huevos, facilitando la penetración del hongo (^{Esteves et al., 2009}). Otras especies de hongos como las micorrizas, Trichoderma sp., (^{Cristóbal-Alejo et al., 2023}), Lecanicillium psalliotae y Paecilomyces sp., también han sido reportados como parásitos de estos microorganismos (Arévalo et al., 2009). Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue aislar e identificar al nematodo causante de los daños y a un hongo nematófago y evaluar su parasitismo sobre huevos de Meloidogyne sp. en plantas de chile de Escuinapa, Sinaloa, como una alternativa ecológica y sustentable al control de nematodos.

Desarrollo experimental

Colecta y procesamiento de muestras. La colecta de las muestras se realizó en Cristo rey, Escuinapa, Sinaloa (Latitud 22.5817° o 22° 34′ 54″ norte y Longitud -105.72492° o 105° 43′ 30″ oeste, a 6 msnm). Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Microbiología del Departamento de Parasitología Agrícola, ubicada en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila (Latitud 25° 21′ 13″ Norte y Longitud 101° 1′ 56″ Oeste,

con una altura de 1,742 msnm).

Aislamiento e identificación morfológica del nematodo. Se recolectaron nueve muestras de raíces con agallas en tres parcelas comerciales de chile serrano hibrido Platino en etapa de producción. Las muestras fueron colocadas en hieleras, etiquetadas y trasladadas al Laboratorio de Microbiología para su procesamiento. Las raíces se lavaron con agua corriente para retirar los restos de suelo y se extrajeron hembras de la raíz a las que se les realizaron cortes perineales. Se observaron 10 hembras para su identificación mediante la metodología descrita por ^{Hartman y Sasser (1985}) y las características se compararon con las descritas por algunos autores (^{Taylor y Sasser 1978}; ^{Garrido et al., 2014}; ^{Zeng et al., 2014}). Por otra parte, se realizó el análisis morfométrico de 10 juveniles del segundo estadio (J2), los cuales se observaron en microscopio compuesto (Nikon Eclipse E200LED MV R) y se compararon sus características morfológicas por las referidas por ^{Hunt y Handoo (2009}) y Zeng et al. (2014).

Aislamiento, identificación morfológica y molecular del hongo parásito de Meloidogyne sp. De raíces de plantas de chile con presencia de agallas causadas por Meloidogyne sp., se colectaron cuatro masas de huevos y tres hembras globosas que presentaban una coloración oscura y una de ellas con presencia de micelio y esporas de hongo. Las muestras se lavaron con una solución de NaClO al 1.5 % por 1 min y se enjuagaron tres ocasiones con agua destilada estéril para retirar los residuos de NaClO. Las muestras fueron sembradas en cajas Petri con medio de cultivo Agar-Agua (Agar bacteriológico 16 g, agua destilada 1 L y pH 7) e incubadas en oscuridad por 72 h a 28 °C. Pasado este tiempo se purificaron los hongos presentes en dichas muestras mediante la técnica de punta de hifa y se transfirieron a nuevas cajas Petri con medio Agar Jugo V8 (agua destilada 450 mL, jugo v8 50 mL, agar bacteriológico 8 g, carbonato de calcio 0.62 g, pH 7), para posteriormente ser identificados morfológicamente a nivel especie mediante la observación de preparaciones microscópicas en portaobjetos con azul de lactofenol vistas al microscopio compuesto, las cuales fueron comparadas con las descritas por ^{Gams y Zare (2003}).

La confirmación de la especie se realizó molecularmente, para lo cual, la cepa fue enviada al Laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental (LANBAMA) en San Luis Potosí, México. La muestra fue secuenciada con el método del didesoxinucleótido marcado en el secuenciador 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) en un Genic Analyzer automático serie 3500. Se utilizaron cebadores de espaciador interno transcrito ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) de una subunidad ribosomal del gen 5.8S RNA e ITS2 (GCTGCGTTCTTCATCGATGC) (^{Levío-Raimán et al., 2021}). Para amplificar los genes se utilizaron un Termociclador Veriti para PCR punto final (Applied Biosystems).

Evaluación del parasitismo in vitro del hongo sobre huevos de Meloidogyne sp. Se extrajeron masas de huevos de Meloidogyne, las cuales se desinfectaron en una solución de Cloranfenicol 0.1 %; se lavaron por 2 min en una solución de NaClO 0.5 % y en agua destilada estéril por 3 min para retirar el exceso de NaClO (^{Cortez-Hernández et al., 2019}), para luego ser pasados con un tamiz estéril de 500 mallas bajo campa de flujo laminar. Luego fueron transferidos a un tubo Falcon de 50 mL con agua destilada estéril, obteniendo una concentración de 680 huevos por mL. Posteriormente, un total de 50 ±5 huevos se transfirieron a tubos eppendorf de 2 mL. Enseguida se aplicaron los tratamientos a base de esporas de Pochonia, el cual fue multiplicado en medio de cultivo líquido Caldo Dextrosa y Papa (caldo de papa 1000 mL, dextrosa 15 g, extracto de malta 3 g, extracto de levadura 3 g) por siete días en agitación constante a 28 ±2 °C y un fotoperiodo de 12:12 h luz y oscuridad. Se realizaron siete tratamientos (T1= 2.3× 10⁶, T2= 4.7× 10⁶, T3= 9.5× 10⁶, T4=

2.3× 10⁷, T5= 4.7× 10⁷, T6= 9.5× 10⁷ esporas mL^-1 y T7= Testigo sin esporas). Cada tubo se aforó a 1 mL con agua destila estéril. El diseño fue completamente al azar y cada tratamiento contó con ocho repeticiones. Los tratamientos se incubaron a 28 °C, con un fotoperiodo de 12:12 luz y oscuridad en una incubadora (Yamato, IC403CW), y a las 48 h se realizó la evaluación del parasitismo. El porcentaje de parasitismo se calculó con la formula descrita por ^{Peraza-Padilla et al. (2014}) %HP= NHP/ TH × 100.

Dónde: %HP= Porcentaje de Huevos Parasitados, NHP= Numero de Huevos Parasitados y TH= Total de Huevos.

Con los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza con prueba de comparación de medias de Tukey (p≤0,05) en el programa estadístico InfoStat versión 2019.1.2.0. Además, se realizó un análisis probit con el programa SAS para determinar la dosis letal 50 (DL50) y dosis letal 95 (DL95) del parasitismo obtenido con intervalos de confianza del 95 %, ya que estas son medidas útiles para describir la efectividad del tratamiento.

Identificación morfológica de la especie de nematodo parásito de raíces de plantas de chile. De acuerdo con los cortes perianales de las hembras globosas (Figura 1 C) vistos al microscopio compuesto, la especie es M. incognita. Las características que presentó fueron estrías delineadas que formaban arcos cuadrangulares altos, presencia de fásmidos distantes, así como vulva y ano ampliamente separados. También se pudo observar la ausencia de la línea lateral (Figura 1 A-B), concordando dichas características por las descritas por ^{Taylor y Sasser (1978}) y ^{Garrido et al. (2014}), ^{Zeng et al. (2014}). Los estadios juveniles J2 fueron filiformes, con una longitud promedio de 420 µm, estilete corto de 18 a 20 µm con nódulos medianos visibles, cola de 36 a 40 µm de longitud, la cual se estrecha hasta llegar a un extremo subagudo y sin estrías y al final hialina (Figura E- F), los J4 presentaron forma de salchicha (Figura 1 D) (^{Hunt y Handoo, 2009}; Zeng et al., 2014).

Existen diversos estudios que reportan a M. incognita como parásito de plantas de chile. Por ejemplo, ^{Cristóbal-Alejo et al. (2023}) lo reportan ocasionando un índice de agallamiento del 83 % en plantas de chile habanero, lo que se vio reflejado en un menor desarrollo de plantas. Por su parte ^{Carrillo-Fasio et al. (2000}) reportaron a esta misma especie infectando a diversos cultivos en los que se encuentra el chile, en gran parte de Sinaloa (El Rosario, La Cruz de Elota, Culiacán, Navolato y Guasave). Con respecto a estudios realizados en el municipio de Escuinapa, Sinaloa, ^{Carrillo-Fasio et al. (2021)} reportaron a este nematodo parasitando plantas de chile, de manera similar que en este estudio.

Identificación morfológica y molecular del hongo parásito de Meloidogyne incognita. De una hembra globosa parasitada con presencia de micelio y esporas (Figura 2A) se logró el aislamiento de un hongo el cual fue identificado como Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia. El hongo presentó conidióforos ramificados verticilados (Figura 2B), con producción de esporas unicelulares cilíndricas en racimos (Figura 2C), dictioclamidosporas multicelulares (clamidosporas de forma irregular con 4 o 9 celdas) (Figura 2E), las cuales se originan de ramificaciones laterales (Figura 2D). Micelio de coloración blanquecino algodonoso en medio PDA (Figura 2F), concordando dichas características con las reportadas por ^{Gams y Zare, (2003}) y ^{Ciancio et al. (2016}) para esta especie. Las esporas en racimo son característica distintiva de P. chlamydosporia var. chlamydosporia, diferenciándola de la especie P. chlamydosporia var. catenulata que presenta esporas en cadenas (^{Arévalo et al., 2009}). La confirmación de la especie con base en la secuenciación de la región del espaciador interno transcrito ITS1 del gen 5.8S RNA e ITS2, mostró una similitud del 99.3 % con la secuencia de la clave de acceso MW654486.1., del GenBank, la cual corresponde a la especie P. chlamydosporia.

Figura 1 Características morfológicas de Meloidogyne incognita; A y B) Corte perianal de hembras globosas; C) Hembras globosas; D) Juvenil J4; E) Estado juvenil J2; F) Estado juvenil J2 eclosionando del huevo. 

Figura 2 Características morfológicas de Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia; A) Hembra globosa de donde fue aislado Pochonia, con presencia de dictioclamidosporas; B) Conidióforos ramificados verticilados; C) Producción de esporas en racimo; D) Formación de dictioclamidospora; E) Grupo de dictioclamidosporas; F) Micelio de coloración blanquecino. 

Evaluación del parasitismo in vitro de Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia sobre huevos de Meloidogyne incognita. En el Cuadro 1 se aprecia el parasitismo de P. chlamydosporia var. chlamydosporia sobre huevos de M. incognita in vitro. A bajas y altas concentraciones de esporas de este hongo hubo parasitosis; sin embargo, estadísticamente (P≤0.05) los tratamientos a una concentración de 4.7× 10⁷ (T5) y 9.5× 10⁷ (T6) esporas mL^-1 del hongo tuvieron más del 98 % de parasitismo o crecimiento externo del micelio de Pochonia (Figura 3). Se aprecia a los huevos con micelio interno y externo (Figura 3A-B), además, de la presencia de dictioclamidosporas (Figura 3 C); mientras que el testigo no presentó signos del hongo (Figura 3 D).

Figura 3 Parasitismo de Pochonia chlamydosporia sobre huevos de Meloidogyne incognita; A) Huevos parasitados con gran cantidad de micelio; B) Micelio saliendo del huevecillo y presencia de esporas en la superficie del huevecillo; C) Huevecillo parasitado con micelio. y presencia de dictioclamidosporas; D) Huevos del tratamiento testigo. 

El análisis probit basado en los porcentajes de parasitismo reveló que los valores de DL50 y DL95 fueron de 2.2E+05 y 2.8E+07 respectivamente (Cuadro 2). Estos resultados indican que la concentración de esporas del hongo tiene un efecto significativo en el parasitismo de huevos de M. incognita.

Los datos obtenidos en este estudio son similares a los reportados por algunos autores, por ejemplo, ^{Vilchis-Martínez et al. (2013}) reportan parasitismo del 86.1 y 88.2 % de dos cepas de P. chlamydosporia (Cepa Pc341x y Cepa Pc10w) a una concentración de 5.5×10⁴ esporas mL^-1 sobre huevos de M. incognita. De manera similar, ^{Flores-Camacho et al. (2008}) reportan porcentajes de parasitismo variados de especies de P. chlamydosporia sobre huevos de Nacobbus aberrans los cuales oscilan del 59 hasta el 89 %. Por su parte, ^{Pérez-Espíndola et al. (2019}) reportan un 69 % de colonización de este hongo sobre masas de huevos de N. aberrans y M. incognita en el suelo y a su vez una disminución del 50 % del agallamiento de las raíces de plantas de tomate, lo que comprueba su capacidad nematicidada. La capacidad de parasitismo de esta especie se le atribuye a su capacidad de producir algunos compuestos como proteasas y quitinasas. Por ejemplo, ^{Escudero et al. (2016}) le confiere la capacidad parasitaria a la creación de apresorios y enzimas extracelulares como serín carboxipeptidasa SCP1 y serín proteasa VCP1. De manera similar, Pérez-Espíndola et al. (2019) a la producción de la enzima VCP1, la cual es secretada por el hongo en el proceso de parasitación del huevo. ^{Mi et al. (2010}) además, reportan la producción de una quitinasa que hidroliza los enlaces β-1,4 en la quitina, lo que facilita la penetración al interior de huevecillo. Respecto al alto porcentaje de parasitismo de este aislado de P. chlamydosporia var. chlamydosporia sobre huevos de M. incognita, podrían deberse a que presenta una alta producción de proteasas y quitinasas, lo que facilita la penetración del hongo en los huevos.

Conclusiones

Se logró el aislamiento y la identificación de P. chlamydosporia var. chlamydosporia infectiva de una hembra globosa de Meloidogyne. Se identificó morfológicamente a M. incognita como el nematodo agallador de raíces de plantas de chile. Este hongo demostró altos porcentajes de parasitismo in vitro sobre huevos del nematodo, los cuales oscilaron desde el 80 % a una concentración de 2.3× 10⁶ esporas mL^-1 hasta un 98.9 % a concentración de 9.5× 10⁷ esporas mL^-1, en un periodo de tiempo de 48 horas. Por lo tanto, este aislamiento podría constituir una bioalternativa para el manejo de nematodos. Sin embargo, es necesario validar su efectividad mediante estudios in vivo que confirmen su capacidad de control en condiciones reales.