Introducción

El género Echeveria pertenece a la familia Crassulaceae, corresponde a un grupo de plantas endémicas del continente americano de hojas suculentas y de bajos requerimientos agronómicos. De este género, México cuenta con 83 % de la diversidad de especies (^{Reyes-Santiago et al., 2011}a; Reyes-Santiago et al., 2011b; ^{Schoch et al., 2020}).

En este género sobresale Echeveria gibbiflora (tememetla, oreja de burro, lengua de vaca, estrella de coral) una de las especies nativas mexicanas con gran potencial en la floricultura por su capacidad para desarrollarse en ambientes adversos, la belleza de sus hojas, el tamaño de sus inflorescencias (1 m de longitud), cantidad de racimos (hasta 12 por inflorescencia), el atractivo de sus flores rosa brillante y la aparición continua de nuevos brotes (^{Reyes-Santiago et al., 2015}), son características que la hacen una excelente opción para su comercialización, tanto en maceta, como para flor de corte (^{Leszczyñska-Borys, 2003}).

Por otra parte, uno de los factores que influyen en la calidad de las plantas del género Echeveria es el ataque de diversas enfermedades fungosas como antracnosis inducida por Colletotrichum destructivum (^{Yao et al., 2020}), cenicilla por Erysiphe sp. (^{Shi et al., 2019}), podredumbre del tallo por Fusarium oxysporum (Yao et al., 2021), marchitez vascular por F. oxysporum f. sp. echeveriae (^{Ortu et al., 2015}), mancha foliar fúngica (Cladosporium tenuissimum) (^{Jo et al., 2018}), moho blanco (Sclerotinia sclerotiorum) (Terrones et al., 2024) y antracnosis inducida por Colletotrichum truncatum (^{Apáez et al., 2025}). Es frecuente que para el manejo de enfermedades en zonas urbanas se apliquen pesticidas químicos de manera inadecuada, lo que implica la liberación de residuos tóxicos al ambiente, lo cual representa un riesgo para la salud humana y medio ambiente (^{Meftaul et al., 2020}), ya sea de manera directa mediante la bioacumulación, o bien, indirecta por medio de la cadena alimenticia (^{Parra-Arroyo et al., 2022}), por lo que surge la necesidad de generar estrategias sustentables para el manejo de enfermedades en plantas de ornato para zonas urbanas que permitan disminuir la resistencia de los patógenos a pesticidas químicos y contribuyan a la reducción de contaminación de suelos y mantos acuíferos (^{Reyes et al., 2015}). Los biofungicidas a base de aceites vegetales, extractos vegetales y microorganismos antagonistas sugieren posibles aplicaciones en el control biológico in vitro de C. truncatum aislado de E. gibbiflora. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la sensibilidad de C. truncatum que induce antracnosis en hojas de E. gibbiflora a 11 biofungicidas, como alternativa para el manejo integrado de la enfermedad.

Materiales y Métodos

Origen del aislamiento. Se utilizó un aislamiento obtenido de plantas de E. gibbiflora cultivadas en el Centro de Investigación en Horticultura y Plantas Nativas de UPAEP University, ubicado en Atlixco, Puebla, México, done se observó síntomas de antracnosis en hojas, con una incidencia y severidad de 45 y 40 %, respectivamente. El hongo que indujo la enfermedad se aisló (aislamiento CtEg2) y caracterizó patogénica, cultural, morfológica, morfométrica, molecular y filogenéticamente en un estudio previo e identificado como Colletotrichum truncatum (GenBank. ITS: PP406307; TUB2: PP616679; GAPDH: PP616680; ACT: PP616681) (^{Apáez et al., 2025}).

Preparación de medios de cultivo modificado y siembra de C. truncatum . Con el método de medio de cultivo envenenado (^{Barroso et al., 2021}; ^{Guerrero et al., 2007}), se evaluó la sensibilidad del aislamiento de C. truncatum con 11 biofungicidas (Cuadro 1). Todos los biofungicidas se probaron con seis concentraciones, 0 (testigo), 1, 10, 100, 500 y 1000 mg L ^-1. Se utilizó medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) modificado con los biofungicidas vertido en cajas Petri (100 × 15 mm). Posteriormente se sembró un disco de 5 mm de PDA con crecimiento activo de C. truncatum de siete días de edad y las cajas se incubaron en oscuridad a 25 ± 1 °C (^{Iturbide et al., 2017}).

Determinación del porcentaje de inhibición. El diámetro de la colonia se midió cada 24 h durante 12 días (tiempo que tardó en que se llenaran las cajas Petri testigo con micelio del hongo) en dos direcciones perpendiculares utilizando un vernier digital (Truper^®, México) y con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de inhibición del

crecimiento (PIC) con la fórmula de Abbott (1925): PIC= (𝐷𝑐−𝐷𝑡) 𝑥 100 donde: PIC:

𝐷𝑐

Porcentaje de inhibición del crecimiento; Dc: Diámetro del control; Dt: Diámetro del tratamiento (^{García et al., 2021}).

Diseño experimental. Fue un experimento factorial, con arreglo en un diseño completamente aleatorizado, 11 × 6 [11 biofungicidas con seis concentraciones (0, 1, 10,

100, 500 y 1000 mg L ^-1) cada uno] con 66 tratamientos, cuatro repeticiones y 264 unidades experimentales, cada una consistió en una caja Petri de 100 × 15 mm, se realizaron dos repeticiones del experimento.

Análisis de datos. Los datos obtenidos se sometieron a pruebas de normalidad, utilizando la prueba de Shapiro-Wilk, así mismo, para la prueba de homogeneidad de varianza, se utilizó el test de Levene, el nivel de significancia utilizado fue de alfa=0.05. Se realizó un análisis de concentración-respuesta para evaluar la efectividad biológica de 11 biofungicidas diferentes en términos de inhibición porcentual. Los datos se ajustaron a un modelo log-logístico para determinar la concentración efectiva para 50 % de inhibición (CE50) para cada biofungicida. Se llevó a cabo un análisis de varianza y la prueba de Tukey para realizar comparaciones múltiples entre el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de los 11 biofungicidas, con un nivel de significancia de 5 %. Todas las pruebas estadísticas se llevaron a cabo en el programa R versión 4.3.2.

Resultados

La concentración efectiva para el 50 % de inhibición (CE50) fue diferente en cada biofungicida, para el aceite de M. alternifolia fue de 109.23 mg L ^-1, mientras que para el extracto de R. sachalinensis fue de 168.76 mg L ^-1. En el caso de B. amyloliquefaciens QST 713, la estimación de CE50 fue de 61.07 mg L ^-1, en el aceite de L. digitata la CE50 fue de 19.95 mg L ^-1, respecto a los aceites esenciales de T. vulgaris y M. spicata se observó una CE50 de 112.47 mg L ^-1. Para el caso de los extractos de L. tridentata y R. communis se identificó una CE50 de 78.51 mg L ^-1, se observó una CE50 de 71.55 mg L ^-1 en los extractos de S. aromaticum, P. nigrum, R. communis y R. graveolens; el extracto de L. tridentata obtuvo un valor de 99.47 mg L ^-1, la CE50 de los extractos de L. graveolens,

C. verum y R. communis, presentó un valor de 27.57 mg L ^-1, en el extracto de M. tenuiflora

y Q. robur, se encontró una CE50 de 60.15 mg L ^-1, finalmente se determinó la CE50 de las sales de potasio ricas en ácidos grasos con un valor de 295.70 mg L ^-1 (Cuadro 1, Figura 1).

Los valores de estimación de concentración efectiva al 50 % (error estándar y valor de t y p) indicaron que la estimación es altamente significativa (p < 0.001) en todos los biofungicidas, excepto en los aceites esenciales de T. vulgaris y M. spicata, ya que según los valores la estimación es significativa (p < 0.05) (Cuadro 1).

Figura 1 Concentración respuesta y CE50 de 11 biofungicidas contra C. truncatum aislado de E. gibbiflora. A) aceite de M. alternifolia; B) extracto de R. sachalinensis; C) B. amyloliquefaciens QST 713; D) aceite de L. digitata; E) aceites esenciales de T. vulgaris y M. spicata; F) extractos de L. tridentata y R. communis; G) cinamaldehído, extractos de S. aromaticum, P. nigrum, R. communis y R. graveolens; H) extracto de L. tridentata; I) extractos de L. graveolens, C. verum y R. communis; J) extracto de M. tenuiflora y Q. robur; K) sales de potasio ricas en ácidos grasos. 

Al realizar el análisis de varianza, mostró diferencias significativas entre los porcentajes de inhibición de crecimiento micelial de los biofungicidas (p-valor < 2e- 16***). La prueba de Tukey se utilizó para realizar comparaciones múltiples entre los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial de los 11 biofungicidas, con un nivel de significancia de 5 %. La variabilidad residual es relativamente baja (MSerror = 3.94), lo que sugiere que el modelo se ajusta bien a los datos observados. El coeficiente de variación fue de 3.65 %, lo cual indica que la variabilidad de los datos es relativamente baja en comparación con la media observada (53.46 %), la prueba de comparación de medias de Tukey mostró grupos estadísticamente distintos.

El tratamiento a base de aceite de M. alternifolia, fue significativamente diferente al resto de los tratamientos presentando el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial con un valor de 93.6 %, mientras que el biofungicida compuesto por sales de potasio ricas en ácidos grasos fue significativamente diferente al resto de los tratamientos, ya que presentó el menor porcentaje de inhibición de crecimiento micelial con un valor de 7.63 %. Los biofungicidas compuestos por extracto de R. sachalinensis, B. amyloliquefaciens QST 713, aceite de L. digitata, aceites esenciales de T. vulgaris y M. spicata y el extracto de L. tridentata presentaron porcentajes de inhibición superiores a 50 %, con valores de 78.85, 69.5, 65.4, 64.55 y 63.4 %, respectivamente (Figura 2).

Figura 2 Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de C. truncatum aislado de E. gibbiflora, evaluado con 11 biofungicidas in vitro. Los valores medios seguidos por las mismas letras, son estadísticamente similares (Tukey α = 0.05) según la prueba de diferencia significativa honesta de Tukey. T1= aceite de M. alternifolia; T2= extracto de R. sachalinensis; T3= B. amyloliquefaciens QST 713; T4= aceite de L. digitata; T5= aceites esenciales de T. vulgaris y M. spicata; T6= extracto de L. tridentata; T7= cinamaldehído, extractos de S. aromaticum, P. nigrum, R. communis y R. graveolens; T8= extractos de L. tridentata y R. communis; T9= extractos de L. graveolens, C. verum y R. communis; T10= extracto de M. tenuiflora y Q. robur; y T11= sales de potasio ricas en ácidos grasos. 

Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de C. truncatum, por cada una de las seis concentraciones (0, 1, 10, 100, 500 y 1000 mg L ^-1) de los 11 biofungicidas evaluados, en la concentración 0 mg L ^-1 el porcentaje de inhibición fue 0

% en todos los biofungicidas, cuando se evaluó 1 mg L ^-1 el porcentaje de inhibición varió de 0.5 a 90.0 %, cuando se probó la concentración de 10 mg L ^-1 el porcentaje de inhibición se mantuvo en un rango de 4.8 a 92.0 %, mientras que cuando se probó 100 mg L ^-1 se identificó un rango de 6.0 a 93.8 % de inhibición, en la concentración de 500 mg L ^-1 los valores de porcentaje de inhibición encontrados fueron de 8.3 a 94.8 %, finalmente, cuando se utilizó una concentración de 1000 mg L ^-1 se detectó que el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial osciló de 11.5 a 97.5, en el 100 % de las concentraciones utilizadas, el tratamiento a base de sales de potasio presentó los valores más bajos de porcentaje de inhibición, mientras que el tratamiento a base de aceite de M. alternifolia presentó los valores más altos (Cuadro 2), además, se pudo observar que en todos los biofungicidas evaluados, el porcentaje de inhibición fue incrementando, conforme incrementaba la concentración, por ejemplo, para el caso del aceite de M. alternifolia cuando se evaluaron concentraciones de 1, 10, 100, 500 y 1000 mg L ^-1, se identificaron valores de porcentaje de inhibición de crecimiento de micelio de C. truncatum de 90.0, 92.0, 93.8, 94.8 y 97.5 respectivamente. Los biofungicidas compuestos por extracto vegetal de L. tridentata, aceite vegetal de T. vulgaris y M. spicata, aceite vegetal de L. digitata, antagonista B. amyloliquefaciens QST 713, extracto vegetal de R. sachalinensis y aceite vegetal de M. alternifolia, presentaron porcentajes de inhibición de crecimiento micelial superiores a 50 % (Cuadro 2).

Discusión

El cálculo de la CE50 de cada producto, permitió identificar que siete biofungicidas (64 %) tuvieron efectividad a concentraciones menores de 100 mg L ^-1 y 4 de ellos (36 %) a concentraciones entre 101 y 300 mg L ^-1, donde los biofungicidas más eficientes en el control de C. truncatum, fueron el aceite de M. alternifolia, extracto de R. sachalinensis y B. amyloliquefaciens QST 713, con una efectividad en el control a concentraciones relativamente bajas de 109.23, 168.76 y 61.07 mg L ^-1, respectivamente.

De acuerdo con ^{Quyen y Quoc (2024}) los aceites esenciales del extracto de M. alternifolia contiene 45 compuestos, de los cuales terpinen-4-ol corresponde al principal compuesto (44.55 %) asociado con actividad antioxidante y antimicrobiana. Asimismo, se ha documentado que el mecanismo de acción de este aceite esencial en Penicillium expansum, es sobre la membrana plasmática del hongo, es desconocido si se debe a la alteración de la estructura de la membrana o al cambio en la permeabilidad de esta, sin embargo, se reportó que la exposición del hongo por 4 horas a la fase de vapor del aceite esencial de M. alternifolia provocó pérdida de ADN, proteína y glucosa, así como daño lipídico (^{da Rocha et al., 2019}).

En relación con el control de algunas especies de Colletotrichum, ^{do Nascimento et al. (2019}) encontraron que con una concentración de 25 μL de aceite esencial de M. alternifolia se inhibe la germinación de esporas de Colletotrichum gloeosporioides aislado de plantas de pimiento (Capsicum annuum) en 100 %. Por su parte, ^{da Costa et al. (2023}) reportaron que la CE100 sobre el crecimiento micelial de C. musae en cultivo in vitro se logró con una concentración de 2.15 μg mL ^-1 de aceite esencial de M. alternifolia, mientras que tratamientos de frutos de plátanos con emulsiones acuosas del aceite esencial reducen en más de 80 % la severidad de antracnosis inducida por C. musae sin tener efectos fitotóxicos. Estos datos concuerdan con los resultados presentados en esta investigación, por el contrario, en un estudio realizado por ^{Kiranmayee et al. (2020}) al evaluar el efecto de ocho aceites esenciales en el crecimiento in vitro de C. gloeosporioides aislado de tallos y raíces de granada (Punica granatum), mostró que el aceite esencial de M. alternifolia tuvo un menor efecto en concentraciones de 0.5, 1.0 y

2.0 %, comparado con aceite de tomillo (T. vulgaris) y de clavo (S. aromaticum), los cuales fueron los biofungicidas más efectivos en la inhibición del crecimiento micelial, lo cual sugiere que para evaluar el efecto fungicida de M. alternifolia se deben tomar en cuenta varios factores como la especie del patógeno, el hospedante del cual fue aislado, la concentración del biofungicida y el ambiente.

Por otra parte, se ha demostrado que M. alternifolia tiene efecto sobre el crecimiento de otras especies de hongos fitopatógenos, tal como se indica en una investigación realizada por ^{Rani y Tripathi (2022}) donde con una dosis de 0.02 % de aceite esencial de

M. alternifolia se reportó 100 % de la inhibición en la germinación de esporas de Botrytis cinerea aislado de frutos de chile (C. annuum), de igual manera, los autores indican que la aplicación de este aceite como fumigante y en tratamientos de inmersión de los frutos incrementa la vida de anaquel del chile. También se evaluó la sensibilidad del hongo Alternaria alternata al aceite esencial de M. alternifolia donde se utilizaron 11 concentraciones que oscilaron de 0.0125 a 1.0 %, se identificó que la concentración en la que se alcanzó la inhibición completa fue de 0.2 %; mientras que, al hacer la evaluación in vivo mediante tratamientos de la semilla de frijol caupí (Vigna unguiculata) con el aceite esencial no se redujo el porcentaje de incidencia del patógeno (^{de Figuerêdo et al., 2019}), lo cual es un indicativo de que, adicional a las pruebas de sensibilidad in vitro de

C. truncatum al aceite esencial de M. alternifolia, es necesario realizar pruebas in vivo en plantas de E. gibbiflora para determinar la dosis óptima en campo.

Adicional al efecto antifúngico, existen reportes que indican que M. alternifolia tiene efecto en la inhibición de crecimiento de bacterias patógenas de humanos y algunos hongos productores de micotoxinas. ^{Quyen y Quoc (2024}) calcularon la CE50 de los aceites esenciales de M. alternifolia para la inhibición del crecimiento de Bacillus cereus (ATCC 11778), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Salmonella enterica (ATCC 13076) y Escherichia coli (ATCC 25922) y reportaron que la inhibición de 50 % del crecimiento bacteriano fue a una concentración de 360 mg mL ^-1. Otro estudio similar, realizado por ^{Zhang et al. (2018}) demuestra que el aceite esencial de M. alternifolia tiene efecto antimicrobiano, no solo en el crecimiento de bacterias como E. coli, S. aureus y Pseudomonas aeruginosa, sino también en el de hongos como Penicillium italicum y P. digitatum con una CE50 de 48.35 μg mL ^-1. Lo anterior representa una ventaja en el uso del aceite esencial de M. alternifolia debido a que E. gibbiflora es una planta comúnmente utilizada en jardines, donde hay contacto con niños y mascotas, por lo que, si llegara a ocurrir contaminación del agua o residuos orgánicos utilizados para el cultivo de esta planta, el aceite podría contribuir a minimizar los riesgos de contaminación, sin embargo, es necesario hacer más estudios al respecto.

El extracto de R. sachalinensis fue el segundo biofungicida con mayor inhibición del crecimiento de C. truncatum. De acuerdo con ^{Margaritopoulou et al. (2020}), en un estudio realizado sobre el control cenicilla inducido por Podosphaera xanthii en calabacín, el extracto de R. sachalinensis funciona como elicitor o inductor de los mecanismos de defensa de las plantas, debido a que desencadena varias reacciones como la formación de calosa, la acumulación de peróxido de hidrógeno y el aumento de producción de ácido salicílico, p-cumárico y cafeico, con lo cual se redujo significativamente la germinación de conidios y severidad de la enfermedad. ^{Santos-Esteban et al. (2021}) reportaron que el extracto de R. sachalinensis inhibió el crecimiento de Fusarium oxysporum aislado de frijol (Phaseolus vulgaris) en 100 %, mientras que ^{Baysal-Gurel y Bika (2021}) reportan que aplicaciones foliares de este mismo extracto a una concentración de 0.5 mL L ^-1, redujeron la severidad cenicilla (Podosphaera physocarpi) en el árbol ornamental sagitario (Physocarpus opulifolius) cultivado en casa sombra.

Por otra parte, B. amyloliquefaciens QST 713 tuvo un efecto significativamente mayor que el resto de los tratamientos después del aceite esencial de M. alternifolia y el extracto de R. sachalinensis. Se ha reportado que B. amyloliquefaciens QST 713 tiene efecto en la regulación de genes relacionados con la activación de factores de transcripción de la familia WRKY y NAC, asociados con mecanismos de defensa ante estreses y receptores LRR-RLK que intervienen en el reconocimiento del patógeno y transducción de señales, mediante estudios transcriptómicos en frutos de duraznos tratados con B. amyloliquefaciens QST 713, para el control de Monilinia fructicola, donde también se indica que el biofungicida inhibió el crecimiento del hongo en cultivo in vitro y redujo la severidad de los síntomas de la enfermedad (Tsalgatidou et al., 2014). Por su parte, Pérez- Moreno et al. (2015) encontraron que B. amyloliquefaciens QST 713 inhibió el crecimiento en cultivo in vitro de Sclerotinia minor aislado de plantas sintomáticas de lechuga (Lactuca sativa) con un crecimiento promedio radial micelial de 1.9 cm. Otro estudio realizado por ^{Solano-Báez et al. (2021}) indica que B. amyloliquefaciens QST 713 en una concentración de 6×10⁷ UFC mL ^-1 redujo en 81.7 % la incidencia de ahogamiento de plántulas de calabacita producida por un complejo integrado por Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani y F. oxysporum.

Finalmente, los biopesticidas utilizados para el control de enfermedades fúngicas tienen diversas ventajas, debido a que cuentan con mecanismos de acción múltiple por la cantidad de fitoquímicos que contienen, por lo que no generan resistencia, son ecológicos, sencillos de producir, efectivos y económicos, no generan residuos y tienen baja toxicidad en organismos que no son su objetivo, donde se incluye al humano, por lo que los riesgos a la salud de las personas son reducidos (^{Deresa y Diriba, 2023}; ^{Suteu et al., 2020}). Cabe mencionar que, para el manejo de enfermedades de plantas en jardines, parques y lugares públicos, donde E. gibbiflora es apreciada, es de suma importancia hacer uso de fungicidas que no generen residualidad, sean amigables con el ambiente y de bajo riesgo para los humanos y la fauna, debido al constante contacto de los usuarios con este tipo de entornos.

Por lo anterior, la presente investigación representa una aportación para el manejo integrado de enfermedades en E. gibbiflora en zonas urbanas, sin embargo, ^{Lecomte et al. (2016}) indican que una vez que se identifica el biofungicida con eficiencia en el control de fitopatógenos en especies ornamentales es necesario estandarizar las dosis, formulación y método de aplicación, por lo que es una pauta para continuar con la investigación.

Conclusiones

C. truncatum que induce antracnosis en hojas de E. gibbiflora es más sensible a los biofungicidas compuestos por aceite de M. alternifolia (109.23 mg L ^-1), extracto de R. sachalinensis (168.76 mg L ^-1) y B. amyloliquefaciens QST 713 (61.07 mg L ^-1) en condiciones in vitro. El aceite de L. digitata (19.95 mg L ^-1), aceites esenciales de T. vulgaris y M. spicata (112.47 mg L ^-1) y el extracto de L. tridentata y R. communis (78.51 mg L ^-1) tienen efecto inhibitorio en el crecimiento del hongo superior a 50 % (los cuales varían de 63.4 a 93.6 %) y representan una alternativa para el manejo integrado de la enfermedad. La regresión logística tiene un buen ajuste y permite modelar porcentajes con predicciones biológicas significativas, asimismo, permite calcular la CE50 de biofungicidas.