Obtención de explantes a partir de semillas

Se utilizaron semillas de Agave tequilana, A. salmiana y A. marmorata, proporcionadas por el Laboratorio de Biología Molecular Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la UAEMéx. Las semillas fueron desinfectadas siguiendo el protocolo descrito por (^{Aguilar-Rito, 2023}). Posteriormente, se establecieron en un medio MS (^{Murashige & Skoog, 1962}) suplementado con 30 g L^-1 de sacarosa, carbón activado (0.5 g L^-1) y gelificado con agar (3 g L^-1), ajustado a un pH de 5.7 ± 0.2. Después de 60 días de germinación, se seleccionó la zona meristemática de las plántulas, que se diseccionó en explantes de aproximadamente 2 cm de longitud, remanentes de raíz y hojas fueron eliminados.

Evaluación de tratamientos de ralentización

Los explantes (incluída la zona meristemática) fueron incubados en frascos de vidrio con 20 ml de medio MS suplementado con 30 g L^-1 de sacarosa y 3 g L^-1 de agar, en condiciones controladas de 25 ± 2 ºC, con luz indirecta (33 μmol m^-2 s^-1) incubadas en un fotoperiodo de 18/16 h, durante 120 días. Se evaluaron los siguientes tratamientos: a) Osmolitos, Manitol a 40 y 50 g L^-1 (Materiales y Abastos Especializados, S.A. de C.V.) y Polietilenglicol 6000 (PEG) a 10 y 15 g L^-1 (Aldrich Chemistry); b) Inhibidores de crecimiento, Paclobutrazol (PBZ) a 1, 3 y 5 mg L^-1 (Sichuan Runer Technology Co., Ltd.) y c) Reguladores del crecimiento vegetal (RCV), Ácido salicílico (AS) a 1, 5 y 10 mg L^-1, y Ácido abscísico (ABA) a 1, 3 y 5 mg L^-1 (Sigma Life Science).

Después de 120 días, se midieron las siguientes variables: longitud y cantidad de raíces y hojas, altura total y peso de las plantas. El porcentaje de supervivencia se calculó dividiendo el número de plantas que sobrevivieron entre el número total de plantas cultivadas in vitro.

Aclimatación en invernadero

Después de 4 meses de ralentización, y una vez medidas las variables, las plántulas obtenidas fueron transferidas a espumas fenólicas dentro de microtúneles en invernadero, con una temperatura controlada entre 28 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 al 80%. Se analizó el porcentaje de supervivencia de las plántulas en estas condiciones (se dividió del total de las plantas obtenidas después de germinadas las semillas, entre el total de las plantas que sobrevivieron después de 30 días en aclimatación).

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente aleatorio, con 14 tratamientos, cada tratamiento consistió en un frasco con cinco explantes en su interior, se realizaron cinco repeticiones de cada tratamiento. El análisis de varianza (ANOVA) se realizó utilizando el paquete estadístico Infostat, seguido de una prueba de comparaciones múltiples de Tukey con un nivel de significancia de 0.05.

Ralentización in vitro

Los resultados de la ralentización in vitro de las tres especies de Agave se obtuvieron después de 120 días de cultivo (Tabla 1). Los mejores resultados sobre la ralentización del crecimiento durante el proceso de conservación se observaron utilizando ácido abscísico (ABA). En la Figura 1 se observa el nivel de respuesta de las plantas cultivadas en medio suplementado con ABA y los testigos cultivados en medio MS, al cabo de 120 días después de iniciado el cultivo. Se observa una marcada diferencia en el desarrollo y viabilidad de las plantas tratadas con ABA en comparación con los testigos ya que su desarrollo fue notablemente menor.

a) Controls, b) ABA 1 mg L⁻¹, c) ABA 3 mg L⁻¹, d) ABA 5 mg L⁻¹. Scale bar represents 2 cm.

a) Testigos, b) ABA 1 mg L^-1, c) ABA 3 mg L^-1, d) ABA 5 mg L^-1. Barra mide 2 cm.

Figura 1 Nivel de desarrollo de plantas de agave cultivadas in vitro en medio suplementado con ABA y sin RCV a los 120 días. 

Efecto de los tratamientos en Agave tequilana

Los resultados para Agave tequilana mostraron una supervivencia del 100% en todos los tratamientos, excepto en los sometidos a PEG a concentraciones de 10 y 15 g L⁻¹, donde las tasas de supervivencia fueron ligeramente menores, alcanzando el 90% y 80%, respectivamente. Los tratamientos con ABA a 3 y 5 mg L⁻¹ , PEG a 15 g L⁻¹ y Manitol a 50 g L⁻¹ mostraron una reducción significativa en el peso total de las plantas, con valores desde 0.06 a 0.22 g en comparación con 1.82 g del testigo (Tabla 1).

En términos de altura de la planta, los tratamientos que tuvieron mayor reducción fueron con ABA a 1, 3 y 5 mg L⁻¹, PBZ a 2 y 5 mg L⁻¹ y PEG a 15 g L⁻¹, con valores significativamente menores en comparación con el testigo, indicando un efecto inhibitorio del crecimiento vertical. El tratamiento que tuvo menor número de hojas (1.2) fue con ABA a 5 mg L⁻¹, en comparación con los testigos (3.0).

Los resultados en los que se observó el menor número de raíces (1.2) fueron ABA con 5 mg L⁻¹, PEG con 15 g L⁻¹ y Manitol a 50 g L⁻¹, asi mismo el menor crecimiento de las hojas (2 cm) se encontró en el tratamiento de ABA con 5 mg L⁻¹, en cuanto al largo de las raíces se observó un crecimiento igual o menor a 1cm para aquellos tratamientos de ABA con 3 y 5 mg L⁻¹ y de PEG con 10 g L⁻¹.

Efecto de los tratamientos en Agave marmorata

En A. marmorata, todos los tratamientos lograron un 100% de supervivencia. En cuanto al peso total de planta, los tratamientos con biomasa menor a 0.1 g fueron con ABA a 3 y 5 mg L⁻¹, con PEG a 15 g L⁻¹ y Manitol a 50 g L⁻¹ (Tabla 2).

Para la altura de la planta, se observó que el tratamiento con ABA a 5 mg L⁻¹ fue el que tuvo menor crecimiento (1 cm), lo que podría estar relacionado con una mayor concentración y tipo de regulador de crecimiento. No se encontraron diferencias significativas en el número de hojas y raíces en todos los tratamientos, lo que sugiere que estos parámetros no se vieron significativamente afectados por ninguno de los tratamientos aplicados. Mientras que en aquellos tratamientos que lograron una longitud en hoja menor a 1 cm fueron con ABA a 3 y 5 mg L⁻¹, y Manitol con 50 g L^-1, logrando con el tratamiento de 5 mg L⁻¹ABA un crecimiento de 103 veces menor respecto al testigo. Así mismo, se observó que los tratamientos con un crecimiento de raíces menor a 0.5 cm fueron con ABA a 1, 3 y 5 mg L⁻¹, con PBZ a 1 mg L⁻¹ y con Manitol a 50 g L⁻¹. Sin embargo, se enfatiza que con 5 mg L⁻¹ de ABA reepresentó un crecimiento 320 veces menor con respecto al testigo.

Efecto de los tratamientos en Agave salmiana

Para A. salmiana, la supervivencia fue del 100% en todos los tratamientos, excepto en aquellos con PEG a 15 g L⁻¹ y Manitol a 50 g L⁻¹, donde la supervivencia en ambos fue del 90%. Los tratamientos que tuvieron un peso total de la planta menor o igual a 0.1 g fueron con ABA a 1, 3 y 5 mg L⁻¹, con PBZ a 5 mg L^-1, con AS a 1, 5 y 10 mg L⁻¹, con PEG a 10 y 15 g L⁻¹ y con Manitol a 40 y 50 g L⁻¹, mostrando una mayor reducción de biomasa (Tabla 3).

Se observó una diferencia significativa en la altura de las plantas; siendo aquellos en los que se alcanzó un crecimiento vertical promedio menor a 1.1 cm, el cual fue equivalente a 6.4 veces respecto al testigo, en los siguientes tratamientos: con ABA a 1, 3 y 5 mg L⁻¹, con PEG a 15 g L⁻¹ y con Manitol a 40 y 50 g L⁻¹, lo que podría ser una ventaja para la conservación prolongada en condiciones in vitro. Con respecto al número de hojas se observó una amplia reducción en los tratamientos que tenían ABA con 1 mg L⁻¹; ya que con 3 y 5 mg L⁻¹ resultó inhibitorio. De igual manera, con PEG a 10 g L⁻¹ y Manitol a 40 g L⁻¹ se observó una hoja en promedio. Mientras que para el menor número de raíces (0.2) fueron los tratamientos que contenían PEG a 15 g L⁻¹ y Manitol a 50 g L⁻¹, ya que con AS a 10 mg L⁻¹ resultó inhibitorio. Por otra parte, la menor longitud en hojas (0.1-0.4 cm) se observó en los tratamientos con ABA a 1 mg L⁻¹ y con PEG a 15 g L⁻¹, respectivamente; ya que con ABA a 3 y 5 mg L⁻¹ resultó inhibitorio en la formación de raíces; mientras que las raíces que presentaron un crecimiento menor a 0.5 cm, es decir 7.2 veces menos con respecto al testigo, fueron aquellas provenientes de los tratamientos con ABA 1, 3 y 5 mg L⁻¹, PEG a 10 y 15 g L⁻¹ y Manitol a 50 g L⁻¹, observándose un efecto inhibitorio con AS a 10 mg L⁻¹.

Aclimatación en invernadero

Durante el periodo de aclimatación en el invernadero, se observó una supervivencia del 100% para las tres especies de Agave. En la Figura 2 se muestran plantas de A. tequilana, A. marmorata y A. salmiana después de 30 días de aclimatación, evidenciando un desarrollo saludable.

Figura 2 Plántulas de Agave después de 30 días de aclimatación en invernadero. 

Comparación de las tres especies de Agave

En este estudio, los resultados mostraron que la viabilidad de los explantes de A. tequilana y A. salmiana fueron afectados por los osmorreguladores, lo que coincide con lo reportado por (^{Bello-Bello J. J.-P.-A.-V.-S., 2014}) quienes señalan que en la conservación in vitro de caña de azúcar en presencia de manitol, tuvo un impacto negativo en la supervivencia y el crecimiento de las plántulas. En particular, los tratamientos con 15, 30 y 45 g L⁻¹ de manitol alcanzaron tasas de supervivencia del 80%, 70% y 43%, respectivamente. De igual manera, (^{Bello-Bello J. J.-G.-A., 2015}) señalaron que con 10, 20 y 30 g L⁻¹ de manitol presentaron tasas de supervivencia del 90%, 70% y 53%, respectivamente en Vainilla planifolia. También reportaron que los porcentajes de supervivencia con PEG fueron menores en comparación con los de manitol, alcanzando 83%, 70% y 43% para las concentraciones de 10, 20 y 30 g L⁻¹, respectivamente. En el presente trabajo, para A. marmorata no se vio afectado por los osmorreguladores, lo que coincide con lo reportado. (^{Pérez-Molphe, 2012}) señalaron que los brotes de diez especies de Agave cultivados in vitro en presencia de manitol a una concentración de 50 g L^-1, no presentaron indicios de daño ni cambios en su morfología; únicamente se observó una reducción en su crecimiento.

Por otro lado, logramos observar que con paclobutrazol se disminuyeron ciertas variables de crecimiento como el peso y el largo total en las tres especies de Agave, lo cual coincide con lo reportado por (^{De-Sá, 2020}) quienes señalaron que en Manihot pseudo glaziovii, con 0.1 mg L⁻¹ de PBZ tuvo un impacto notable en su conservación in vitro. Para M. violacea, la mejor dosis para su conservación fue de 0.2 mg L⁻¹ de PBZ. Mientras que para M. flabelifolia, las concentraciones utilizadas de PBZ no resultaron efectivas para la conservación in vitro. (^{Ramírez-Mosqueda M. L.-A.-C.-D., 2024}) mostraron que después de 12 meses de conservación in vitro de la especie Guarianthe skinneri (Bateman) Dressler & W. E. Higgins, se obtuvo una reducción en la longitud de los brotes conservados con 2 mg L^-1 de PBZ. (^{Bello-Bello J. J.-P.-A.-V.-S., 2014}) observaron que las plantas de caña de azúcar se conservaron in vitro en condiciones de crecimiento lento inducido por PBZ a concentraciones de 1, 2 y 3 mg L^-1, retrasándose su desarrollo sin comprometer la supervivencia. (^{Spinoso-Castillo, Pérez-Sato, & Schettino-Salomón, 2022}) demostraron que en anturio y caña de azúcar, la concentración de 1 mg L⁻¹ de PBZ fue la más efectiva para la conservación in vitro sin comprometer la supervivencia, mientras que, en agave, la mejor concentración fue de 3 mg L⁻¹ de PBZ. (^{Bello-Bello J. J.-G.-A., 2015}) utilizaron concentraciones de 1, 2 y 3 mg L^-1 de PBZ para la conservación in vitro de V. planifolia, logrando mantener una supervivencia del 100% de los brotes. No obstante, el uso de este compuesto provocó anormalidades tanto en la región apical como en el sistema radical de las plántulas de V. planifolia. En nuestro experimento no se observaron anomalías en las plantas de agave cultivadas con PBZ.

Por otro lado, el ácido salicílico (AS) se presenta como uno de los tratamientos que, a bajas concentraciones, promueve el crecimiento de las plantas, incrementando el número y la longitud de hojas y raíces. Sin embargo, a dosis elevadas, se observa una disminución en el peso, la altura y la longitud de hojas y raíces, lo que concuerda con lo expuesto por (^{Roque-Otero, 2023}) quien sostiene que el AS tuvo un comportamiento diferente para cada especie de Agave, reportando un incremento significativo en la longitud de la raíz, a una concentración de 1 y 3.6 μM de AS, menciona que las plantas de agave responden positivamente a este regulador aplicado en bajas dosis y si se aplica en dosis elevadas puede producir inhibición del crecimiento.

Los resultados sugieren al ABA como el factor determinante para lograr la ralentización del crecimiento in vitro como estrategia de conservación. Estos hallazgos están respaldados por la literatura existente sobre el efecto del ABA en la conservación in vitro de diversas especies vegetales. (^{Páez-Cásares & González-Valladares, 2001}) investigaron el efecto de 1.5 mg L⁻¹ de ABA en la variedad Kennebec de papa, observando un desarrollo moderado tanto a nivel aéreo como radical, lo cual contrasta con los resultados obtenidos en las especies de Agave estudiadas. Asimismo, (^{Espinosa-Reyes, 2002}) determinaron que dosis de 5.0 y 10.0 mg L⁻¹ de ABA fueron efectivas para la conservación in vitro del boniato, reduciendo significativamente el número de raíces, yemas y longitud del tallo, aunque manteniendo altos porcentajes de supervivencia. Por su parte, (^{Barrueto, 2008}) confirmaron el efecto inhibitorio del ABA sobre la brotación de yemas axilares de yuca, con concentraciones de 20 y 30 μM inhibieron la brotación por 90 días; lo que coincide con nuestros resultados, ya que en las tres especies de Agave se observó una inhibición de los explantes después de 120 días de cultivo in vitro. Por otro lado, (^{Bello-Bello J. J.-P.-A.-V.-S., 2014}) encontraron que concentraciones elevadas de ABA redujeron los porcentajes de supervivencia en cultivos de caña de azúcar, afectando negativamente el crecimiento y la diferenciación celular. Sin embargo, en nuestro estudio, las plantas tratadas con ABA no tuvieron problemas de supervivencia, logrando un 100% tanto in vitro como en invernadero. (^{Bello-Bello J. J.-G.-A., 2015}) establecieron un método de conservación in vitro para V. planifolia utilizando 3 mg L⁻¹ de ABA, logrando una alta viabilidad con subcultivos cada 180 días, y destacaron el papel del ABA como inhibidor del crecimiento y regulador de fitohormonas. En el presente experimento, se observó que concentraciones de 1, 3 y 5 mg L⁻¹ de ABA fueron las más efectivas para ralentizar el crecimiento. Además, (^{Ramírez-Mosqueda M. A.-C.-T.-B., 2018}) demostraron que concentraciones de 0.5 mg L⁻¹ de ABA en cultivos de Laelia anceps redujeron la cantidad de brotes, pero mantuvieron una alta supervivencia. Estos estudios reflejan la diversidad de efectos fisiológicos del ABA, destacando su papel crucial en la regulación del crecimiento y en los programas de conservación y regeneración in vitro. El ABA inhibe la elongación y la división celular, y aunque afecta negativamente el crecimiento, no compromete la supervivencia de las plantas, lo que subraya su utilidad en los protocolos de conservación in vitro.