Material genético

Se utilizaron las variedades de tipo pinto: Salinas, Rarámuri, Pinto Saltillo y Pinto Villa, de tipo flor de junio: ‘Dalia’ y ‘León’ y de tipo flor de mayo: Eugenia y Dolores. Pinto Saltillo y Pinto Villa se emplearon como controles, ya que son de oscurecimiento lento y regular (se oscurece rápidamente), respectivamente. Todos los materiales fueron proporcionados por el Programa de Mejoramiento de Frijol del INIFAP, provenientes de los ciclos de riego y temporal, cuyas siembras se realizaron en febrero y julio de 2017, respectivamente, en Celaya, Guanajuato. Para determinar la acumulación de transcritos en órganos vegetativos y reproductivos, las semillas se germinaron en condiciones asépticas, para lo que se usó una solución de hipoclorito de sodio al 1 % en la que se sumergieron las semillas por 3 min, transcurrido ese tiempo se lavaron con agua destilada estéril y se colocaron en una cámara húmeda formada por una charola de plástico y papel absorbente humedecido con agua estéril. Después se trasplantaron a invernadero 10 semillas de cada variedad en macetas de 2 kg que contenían sustrato tipo turba (Sunshine Mix 3®). El riego se aplicó tres veces a la semana y se siguió el crecimiento y desarrollo de las plantas.

Inducción de oscurecimiento con luz UV

Con el objetivo de conocer el fenotipo de oscurecimiento de los materiales se realizó una cinética consistente en la aplicación de luz UV durante 144 horas a 15 semillas de cada variedad, siguiendo la técnica descrita por ^{Junk-Knievel et al. (2008)}. Las semillas se colocaron a 11 cm de una lámpara de luz UV de 30 W con una longitud de onda de 254 nm (Tecnolite G30T8). Se midió el parámetro de luminosidad L* cada 24 h con un colorímetro Konica Minolta CR-400. La medición se realizó por triplicado y entre cada una de ellas se tomaron al azar cinco semillas para realizar la lectura. La interpretación de los datos se basó en el sistema de medición de color, espacio CIELAB. El oscurecimiento producido se estimó mediante la retención de luminosidad de cada variedad, considerando su valor en el tiempo cero como el 100 %. El oscurecimiento de las semillas se documentó cada 24 h con una cámara Sony α35.

Análisis de expresión

Se estudió la expresión de tres genes difenol oxidasa lacasa, dos difenol oxidasa y tres polifenol oxidasa(Cuadro 1). Estos genes se identificaron en el genoma del frijol de acervo mesoamericano BAT 93 alojado en NCBI ID BioProject PRJNA221782 ^{(Vlasova et al., 2016)}. Los iniciadores específicos (Cuadro 1) se diseñaron con la aplicación Primer3Plus (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi).

La acumulación de transcritos se estudió en semillas completas y en sus fracciones disectadas de testa, endospermo y embrión (Figura 1B), así como en otros órganos vegetativos y reproductivos (hojas, botones florales en estado globoso, flores abiertas, vainas jóvenes de 1 a 2 centímetros de longitud y vainas inmaduras de al menos 3 cm de longitud).

Figura 1 A) Cinética del oscurecimiento de la testa del grano de variedades de frijol de los tipos pinto, flor de mayo y flor de junio. El tiempo cero muestra el color del grano de una cosecha reciente. B) Aspecto de las fracciones de semilla disectadas para determinar los niveles de expresión de genes que codifican para enzimas fenol oxidasas. 

El ARN total de cada variedad se extrajo a partir de 20 semillas completas y 20 semillas disectadas en sus fracciones de testa, embrión y endospermo siguiendo el método descrito por ^{Logemann et al. (1987)}. Los órganos vegetativos y reproductivos se disectaron de 5 plantas: un foliolo de la parte media de cada planta, todos los botones florales, tres vainas jóvenes (no mayores a 3 cm de longitud) y una vaina madura (en llenado de grano) por cada planta. La concentración de los RNAs se igualó visualmente por medio de geles de agarosa desnaturalizante al 1.5 % con 12.3 M de formaldehido y 10 X MOPS, los cuales se visualizaron con bromuro de etidio (0.5 mg mL^-1 EtBr) y luz UV en un fotodocumentador Gel Logic 112 de Kodak Science y el software Molecular Imaging v5 (Carestream, WoodBridge, CT, USA). Posteriormente, la concentración real y la pureza del ARN total se determinaron midiendo la absorción de luz UV usando un espectrofotómetro Nanodrop 800™ (Thermo Fisher Scientific). Con los ARNs así tratados se formó una solución equimolar de cada origen mezclando 2 µL de cada muestra en el mismo tubo.

A partir del RNA total se sintetizó ADN complementario de cadena sencilla (cDNA) por transcripción reversa con la enzima SuperScript™ II (Invitrogen). Como testigo para estandarizar los niveles de expresión basales se usó el gen constitutivo 26S, como se describe en ^{Montero-Tavera et al. (2017)}. La Reacción en Cadena de la Polimerasa a partir de la Transcripción Reversa (RT-PCR) se llevó a cabo usando 1 μL de la reacción de cDNA, 0.8 mM dNTPs, 1X regulador de PCR, 2 mM MgCl₂, 0.4 mM de cada iniciador y 1 U de Taq Polimerasa en un volumen de reacción de 25 μL. Las condiciones de amplificación para todos los iniciadores fueron las mismas que para la estandarización, con la excepción de que se usaron 15 ciclos de amplificación adicionales. Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1.5 %. El análisis densitométrico se realizó con el software TotalLab Quant TL120 1D v2009 y la cuantificación de la expresión diferencial con el programa ImageJ.

Inducción de oscurecimiento con luz UV

Los resultados de la cinética de oscurecimiento inducido por luz UV se muestran en la Figura 1A. Aunque ^{Junk-Knievel et al. (2008)} indican que el tratamiento por 72 horas es equivalente al oscurecimiento natural durante un año, en esta investigación el tratamiento se llevó a condiciones extremas de 144 horas, con el fin de encontrar una relación más clara entre el oscurecimiento y la acumulación de transcritos de fenol oxidasas. Se observa que desde las 24 horas Pinto Villa exhibe un oscurecimiento acelerado comparado con las otras variedades de frijol pinto, las que muestran un oscurecimiento lento. Entre las variedades de color rosa claro las diferencias no son tan evidentes, puesto que la luminosidad al tiempo cero es variable entre ellas. Sin embargo, tanto a las 48 como a las 144 horas, Flor de Mayo Dolores es la variedad que más se oscurece con respecto a las cero horas. Estos resultados se muestran con mayor claridad en las gráficas de la Figura 2. En los paneles A y B se observa la luminosidad retenida a través del tiempo para frijoles pintos y rosa claro; entre los pintos, Salinas es la variedad con mayor retención de luminosidad a las 72 horas de tratamiento, mientras que Pinto Villa se oscurece aceleradamente. A las 48 horas, Pinto Saltillo tiene una retención de luminosidad similar a Pinto Villa; sin embargo, a las 72 horas Pinto Saltillo ya presenta mayores valores de luminosidad retenida. Por otro lado, aunque a las 72 horas Salinas y Rarámuri tienen valores diferentes, a las 144 horas son similares. Entre las variedades de color rosa claro, Flor de Junio Dalia y Flor de Mayo Eugenia presentan los valores mayores a través de toda la cinética, mientras que Dolores presenta los menores valores de retención de luminosidad. En los paneles C y D de la Figura 2 se observan los resultados a las 72 y 144 horas. Se sigue la misma tendencia en ambos tratamientos, aunque con valores menores de luminosidad retenida en el tiempo final.

Figura 2 Retención de luminosidad en testa de semillas de variedades de frijol de color pinto y rosa claro. A) Variedades de tipo pinto. B) Variedades de tipo rosa claro. C) Luminosidad retenida a 72 horas bajo luz UV. D) Luminosidad retenida a 144 horas bajo luz UV. 

Se ha desarrollado un amplio número de investigaciones que demuestran que el color de las semillas es en gran medida producido por la acumulación de proantocianidinas y se propone que su oxidación es la causa del oscurecimiento de la testa ^{(Islam y Dhaubhadel, 2023)}. Sin embargo, los mecanismos genéticos y metabólicos que regulan este fenómeno aún son desconocidos. Se debe considerar que el color de las semillas de frijoles pintos es muy similar cuando son de cosecha reciente; es decir, que la distribución de las proantocianidinas es similar, independientemente si se trata de genotipos de oscurecimiento regular, oscurecimiento lento o no oscurecimiento. Esto indica que debe haber funciones de enzimas reguladas diferencialmente entre los tres fenotipos.

Expresión de fenol oxidasas

Los genes difenol oxidasas lacasas 1, 2 y 3 (DOL1, DOL2, DOL3) y difenol oxidasa 1 (DO1) presentan una clara acumulación de transcritos en las semillas de Pinto Saltillo comparadas con la expresión en otros órganos. En semillas de Pinto Villa solo se expresa considerablemente la DOL1; además, resalta que este gen acumula mayor cantidad de transcritos conforme el desarrollo de la semilla avanza desde botones florales jóvenes hasta semillas maduras (Figura 3A). Las polifenol oxidasas no se expresaron apreciablemente en este experimento.

Figura 3 RT-PCR de fenol oxidasas en las fracciones de endospermo embrión y testa de variedades de frijol de tipos pinto y rosa claro. PV: Pinto Villa, PS: Pinto Saltillo, PR: Pinto Rarámuri, PSa: Pinto Salinas, FJD: Flor de Junio Dalia, FMD: Flor de Mayo Dolores, FJL: Flor de Junio León, FME: Flor de Mayo Eugenia. 

Dado que la semilla es una estructura compleja, se estudió la acumulación de transcritos en sus principales componentes; es decir, tanto en la testa y el endospermo como en el embrión. Los resultados se observan en la Figura 3B. En el endospermo solo PPO2 y DOL1 se expresan de manera clara en todas las variedades, aunque la primera no se expresa en Pinto Villa, lo que podría sugerir que se asocia al oscurecimiento lento; sin embargo, no se expresa en testa, lo que anula esa posibilidad; DOL1 se expresa incluso en Pinto Villa, lo que sugiere que no se asocia con el oscurecimiento lento, ya que esta variedad es de oscurecimiento regular. En el embrión de todas las variedades se expresan los genes de todas las fenol oxidasas, excepto PPO1, por lo que no hay un patrón de asociación con el oscurecimiento.

En testa DOL1, DOL2 y DOL3 se expresan en las variedades de tipo pinto (Saltillo, Rarámuri y Salinas), pero no en Pinto Villa, lo que sugiere que su actividad se asocia con el oscurecimiento lento. La posible asociación de DO1 con el oscurecimiento lento no es tan clara ya que, aunque presenta mayor acumulación de transcritos en las variedades de frijol pinto de oscurecimiento lento, también se observa una expresión basal en Pinto Villa. La expresión de los tres genes difenol oxidasas lacasas sugiere que Flor de Junio Dalia y Flor de Junio León se pueden clasificar como de oscurecimiento lento, lo que en el caso de Dalia se corrobora por ser una de las variedades con mayor retención de luminosidad; además, esta variedad expresa todas las fenol oxidasas, excepto DO2. Flor de Mayo Eugenia es un caso interesante, ya que, aunque no presenta el perfil de expresión de las variedades de frijol pinto y de los del tipo flor de junio (no presenta expresión de DOL2), es una de las variedades con mayor luminosidad retenida; por el contrario, Flor de Mayo Dolores, cuyo perfil de expresión difiere solo en la DOL2 con respecto a los pintos y flores de junio, es una de las variedades con menor valor de luminosidad retenida, solo superada por Pinto Villa. Aparentemente, las variedades de tipo flor de mayo poseen mecanismos diferentes a los pintos y flores de junio, aunque se requieren mayores estudios para confirmarlo.

Los resultados anteriores se comprobaron mediante un estudio volumétrico, donde se calculó la suma de niveles de gris de todos los pixeles que forman una banda expresada en un gel (Cuadro 2). Adicionalmente, se observó que, aunque la acumulación de transcritos es baja, PPO1 presenta un perfil similar a DOL1, DOL2 y DOL3; es decir, ausente en Pinto Villa y presente en los pintos de oscurecimiento lento, por lo que este gen también podría tener un papel en el oscurecimiento lento del frijol.

En la literatura científica no se han reportado resultados que relacionen la acumulación de transcritos con la actividad de polifenol oxidasas y lacasas y su capacidad para inducir el oscurecimiento de la testa. Sin embargo, ^{Blaschek y Pesquet (2021)} mencionan que las PPO pueden catalizar dos reacciones distintas, una de ellas es la oxidación de orto-difenoles o catecoles para producir orto-quinonas, las cuales poseen el color café típico del oscurecimiento de la testa, en cambio las DOL, además de oxidar orto y para difenoles, para producir neolignanos, presentan funciones más amplias, ya que promueven la oxidación anabólica o catabólica de los flavonoides, actuando como polimerizador o despolimerizador de las antocianidinas; es decir, que podrían modificar la actividad oxidativa de las PPO. Además, los mismos autores señalan que la localización de las PPO es en el lumen de plástidos, principalmente vacuolas, mientras que las DOL se localizan en el apoplasto celular. Esto las podría convertir en la primera línea de expresión como respuesta al estrés, como el ocasionado por la luz UV. Dado que en esta investigación las DOL se presentaron en las variedades de frijol pinto de oscurecimiento lento y las variedades flor de junio, se sugiere que podrían presentar un mecanismo similar; sin embargo, los mecanismos de acción, localización celular y especificidad de los sustratos de las PPO y DOL aún deben ser dilucidados mediante nuevos experimentos.