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INTRODUCCIÓN
En últimos años, el tejido pulpar ha ganado interés como fuente de células. En este tejido se encuentran fibroblastos, odontoblastos y células troncales.1-3 En múltiples estudios realizados en odontología se cultivan fibroblastos y células troncales derivadas de la pulpa dental (CTPD).4-10 Los cultivos celulares son utilizados para comprobar la citotoxicidad y biocompatibilidad de materiales dentales, como resinas o cementos endodónticos.4-10 El tejido pulpar es una excelente fuente de obtención de células, gracias al fácil acceso que se tiene a ellas.11-13 El tejido es aislado de dientes extraídos por fines ortodónticos como terceras molares y premolares, sin causar mayor perjuicio al paciente.
Constantemente se actualizan nuevos protocolos para poder obtener una mayor cantidad de células viables al aislarlas de la pulpa. Los actuales protocolos toman en consideración la baja temperatura, la condición húmeda y el control de la contaminación bacteriana.10 El tiempo postexodoncia también es un factor muy importante; sin embargo, existen pocos estudios que contrastan este factor con la viabilidad celular.14,15 Se ha reportado similar viabilidad en cultivos de CTPD a diferentes tiempos, 0, 0.5, 1, 2 y 5 horas postexodoncia.14 También se han comparado cultivos realizados inmediatamente, y a las 24, 48, 72, 96 y 120 horas postexodoncia.15 Obteniendo como resultado que a menor tiempo, mayor fue la cantidad de células obtenidas. 15 Los estudios mencionados fueron realizados en CTPD sin tomar en consideración otras células de la pulpa. Esto nos llevó a investigar la población celular total de la pulpa. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue comparar la viabilidad celular de la pulpa dental obtenida antes de las 24 horas y después de las 72 horas postexodoncia. Asimismo, determinar la relación de la viabilidad celular con la edad y el género de los pacientes. Se plantea como hipótesis que a menor tiempo postexodoncia, mayor será la viabilidad celular. También que las pulpas de los pacientes más jóvenes presentan mayor viabilidad celular con respecto a los pacientes adultos, y que el género del paciente no influye en la viabilidad celular. Los resultados de este estudio contribuirán en la optimización de los protocolos de aislamiento celular, cultivos celulares, pruebas de citotoxicidad, que se ejecutan en medicina regenerativa e ingeniería tisular.
MATERIAL Y MÉTODOS
Éste fue un estudio experimental, comparativo, transversal y prospectivo. Los dientes fueron extraídos por motivos ortodónticos y profilácticos en el Centro Odontológico de la Universidad de San Martín de Porres de Lima, Perú. El estudio se llevó a cabo con la aceptación y conformidad del Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Odontología de la Universidad de San Martín de Porres. Se obtuvo el consentimiento informado previo de los pacientes para su participación en el estudio. Se recolectaron 42 dientes entre terceros molares y premolares totalmente desarrollados, provenientes de pacientes sanos (16 mujeres y 26 hombres) entre 13 y 42 años de edad. El total de muestra se dividió en dos grupos de 21 dientes cada uno. En el grupo 1 se realizó la obtención pulpar antes de las 24 horas postextracción. En el grupo 2 la obtención pulpar se efectuó después de las 72 horas postextracción, sin superar las 96 horas.
Después de las extracciones dentales, los dientes se colocaron en frascos estériles con suero fisiológico más penicilina y estreptomicina (PE-EST) (Gibco, USA®) los cuales fueron cerrados herméticamente y rotulados y enfriados a 4 oC para ser transportados al Laboratorio de Investigación de Biología Oral y Molecular de la Facultad de Odontología de la Universidad de San Martín de Porres. La muestra se transportó según el Manual de Bioseguridad en Laboratorios de Ensayo, Biomédicos y Clínicos del Ministerio de Salud.16 Los dientes correspondientes al grupo 2 se almacenaron a 4 oC hasta el tiempo correspondiente de su obtención pulpar.
La obtención pulpar se realizó mediante el método de fractura del diente para exponer la pulpa.17 La técnica empleada por el investigador principal se realizó con base en un entrenamiento previo, evaluado y medido por un experto en el área. Dentro de la cabina de flujo laminar (BIOBAN™, Angelantoni Life Science, Italia), lo primero que se realizó fue el lavado y desinfección del diente. Para ello se sumergió el diente en Minimum Essential Medium (MEM) (Sigma-Aldrich, UK) más PE-EST durante 20 minutos. Completado el tiempo de lavado, se fracturó el diente para exponer la pulpa. El diente fracturado se colocó en una placa Petri con MEM y PE-EST y se procedió a separar el tejido pulpar cameral con la ayuda de un bisturí, pinzas, limas y curetas estériles (Figura 1A). El tejido aislado se trituró manualmente y se centrifugó a 1,100 rpm por 10 minutos, obteniéndose el botón celular o pellet (Figura 1B). Posteriormente se retiró el sobrenadante y se resuspendió en MEM y PE- EST. Para determinar la viabilidad celular se usó 10 μL de suspensión mezclado con 10 μL de azul de tripano (Gibco, USA). La mezcla se colocó en el hemocitómetro para realizar el recuento celular por cuadrante. Las células vivas fueron observadas de color blanco y las células muertas de color azul (Figura 2A y 2B).
Figura 2 A) Células de la pulpa dental obtenidas a las 24 horas postexodoncia. B) Células de la pulpa dental obtenidas a las 72 horas postexodoncia. Observadas a 40x en el microscopio.
El porcentaje de viabilidad se determinó mediante la siguiente fórmula: 18
El número de células viables se determinó mediante la siguiente fórmula:
Para determinar posible diferencia estadísticamente significativa entre las medias de ambos grupos se utilizó el programa SPSS versión 21 (IBM®). El intervalo de confianza fue 95% (p = 0.05) Inicialmente se usó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para poder elegir la prueba estadística adecuada. En los datos que no tuvieron una distribución normal se utilizó la prueba no paramétrica de U de Mann-Whitney y en los datos que tuvieron distribución normal se usó la prueba paramétrica de t de Student para muestras independientes.
RESULTADOS
Para los dos grupos estudiados se utilizó terceros molares y premolares correspondientes a pacientes cuyo rango de edad estuvo entre 13 y 42 años. Las características de edad y sexo entre ambos grupos fueron similares, no existiendo diferencias significativas (p = 0.191 y p = 0.751, respectivamente) (Tabla 1).
Tabla 1 Análisis descriptivo de la muestra.
| Antes de las 24 horas (N = 21) |
Después de las 72 horas (N = 21) |
p | |
| Edad (años) | 21.95 ± 5.23 | 25.43 ± 7.45 | 0.191* |
| Mujeres, n (%)0 | 7 (33.3) | 9 (42.9) | 0.751‡ |
| Hombres, n (%) | 14 (66.7) | 12 (57.1) |
N = tamaño de muestra; * Prueba U de Mann-Whitney, no diferencia estadísticamente significativa, p>0.05, ‡ Prueba χ2, no diferencia estadísticamente significativa, p>0.05.
En el grupo de pulpas dentales obtenidas antes de las 24 horas postextracción la cantidad de y la viabilidad celular fueron mayores respecto al grupo de pulpas obtenidas después las 72 horas postextracción. Ambas variables presentaron diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) (Figuras 3 y 4).
Figura 3 Comparación entre los promedios de número de células obtenidas antes de las 24 horas postexodoncia y a las 72 horas postexodoncia.
Figura 4 Comparación entre los promedios de porcentaje de viabilidad celular obtenida en ambos grupos.
En el grupo 1 se puede observar que existe relación entre el número de células y la viabilidad celular con la edad del paciente. Tanto el número de células como la viabilidad celular son mayores en el grupo de 13 a 27 años en comparación al grupo de 28 a 42 años. La diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0.031 y p = 0.024, respectivamente) (Tabla 2).
Tabla 2 Número de células y viabilidad celular las pulpas dentales obtenidas antes de las 24 horas post-exodoncia según la edad del paciente.
| 13 a 27 años (N = 18) | 28 a 42 años (N = 3) | |||||
| Parámetro de comparación | Media | DE | Media | DE | p | |
| Número de células | 4,502E + 06 | 2,645E + 06 | 1,467E + 06 | 8,406E + 05 | 0.031* | |
| Viabilidad celular | 67.18 | 7.37 | 56.39 | 7.24 | 0.024* | |
N = tamaño de muestra; E+n = formato científico donde E (exponente) multiplica el número anterior por 10 a la potencia n; * Prueba U de Mann-Whitney, no diferencia estadísticamente significativa, p < 0.05.
En el grupo 2 se puede apreciar que no existe relación entre el número de células y la viabilidad celular con la edad del paciente. No se halló una diferencia estadísticamente significativa (p = 0.586 y p = 0.848, respectivamente) (Tabla 3).
Tabla 3 Número de células y viabilidad celular de las pulpas dentales obtenidas después de las 72 horas post-exodoncia según la edad del paciente.
| 13 a 27 años (N = 15) | 28 a 42 años (N = 6) | |||||
| Parámetro de comparación | Media | DE | Media | DE | p | |
| Número de células | 1.438E + 06 | 1.072E + 06 | 1.880E + 06 | 1.812E + 06 | 0.586* | |
| Viabilidad celular | 35.21 | 8.32 | 35.98 | 7.88 | 0.848‡ | |
N = tamaño de muestra; E₊n = formato científico donde E (exponente) multiplica el número anterior por 10 a la potencia n; DE = desviación estándar; * Prueba U de Mann-Whitney, no diferencia estadísticamente significativa, p > 0.05; ‡ Prueba t para muestras independientes, no diferencia estadísticamente significativa, p > 0.05.
En el grupo 1 no se encontró relación estadísticamente significativa entre el número de células y la viabilidad celular con respecto al género del paciente (p = 0.232 y p = 0.526, respectivamente). Del mismo modo, en el grupo 2 no hubo relación entre el número de células y la viabilidad celular con el sexo del paciente (p = 0.915 y p = 0.282, respectivamente).
DISCUSIÓN
Uno de los objetivos del presente estudio fue determinar el efecto del tiempo postextracción en relación con la viabilidad de las células de la pulpa dental. En la actualidad existen escasas investigaciones que hayan abordado esta relación.11-14 Parece ser que 24 horas es el tiempo postextracción adecuado para realizar cultivos. Sin embargo, no se ha establecido si se pueden realizar cultivos celulares exitosos de pulpa dental a las 72 horas postexodoncia. Esto nos llevó a realizar este estudio comparando la viabilidad celular antes de las 24 horas y después de las 72 horas postexodoncia.
Woods et al.11 obtuvieron un número de células viables de 0.5-2.0 × 106 de CTPD (una recuperación celular mayor al 93%) después de seis meses de congelamiento, verificado con el método de tinción de azul de tripano. En cambio, nosotros obtuvimos un mayor número celular en el grupo de la pulpa dental obtenida antes de 24 horas postextracción (un promedio de 4.1 × 106). La diferencia entre ambos resultados se debe a que nosotros evaluamos toda la población celular, no un grupo específico de células como son CTPD. Asimismo no sometimos a las células a un periodo de congelamiento, que puede ser causante de la disminución del número celular.
En el presente estudio, el grupo 1 obtuvo una viabilidad celular de 65.64% y el grupo 2 de 35.43%. Benício et al.14 establecieron cultivos celulares de piezas a las 0, 0.5, 1, 2 y 5 horas postexodoncia. Aunque no precisan la viabilidad exacta obtenida en cada tiempo, indican que obtuvieron la misma capacidad proliferativa y similar morfología celular en los diferentes tiempos de procesamiento postextracción. En contraste a nuestro estudio, obtuvimos una diferencia significativa al comparar la viabilidad celular de ambos grupos, 24 y 72 horas. La discrepancia en ambos estudios se puede atribuir al tiempo mayor empleado por nosotros. El tiempo de 72 horas postexodoncia de obtención de la pulpa dental posiblemente sea un factor importante para que exista diferencia en la viabilidad celular.
Perry et al.15 compararon la viabilidad celular de terceros molares almacenados en 0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas antes del procesamiento para obtener CTPD. Los dientes que fueron almacenados en PBS y HTS a las 24 horas (1.5 × 106 y 2.2 × 106, respectivamente) obtuvieron mayor cantidad de CTPD que a las 72 horas (0.6 × 106 y 0.7 × 106, respectivamente). Estos hallazgos fueron similares al nuestro al comparar las células obtenidas a las 24 y 72 horas. Sin embargo, nosotros conseguimos mayor número de células a las 24 horas (4.1 × 106) y 72 horas (1.6 × 106) en comparación a lo obtenido por Perry et al.15 Como se mencionó anteriormente, esto puede deberse a que nosotros trabajamos con la población celular total.
Este estudio también evaluó la relación entre la viabilidad celular con la edad y el sexo de los pacientes. Suchánek et al.19 mencionan que usaron para su estudio los dientes de 19 mujeres y tres hombres, en un rango de edad de ocho a 23 años. Viña-Almunia et al.20 usaron las pulpas dentales de 85 mujeres y 35 hombres, en un rango de edad de 14 a 67 años. En ambos estudios lograron aislar cultivos de CTPD satisfactoriamente. Sin embargo, no estudiaron la viabilidad de los cultivos con respeto a la edad y sexo de los pacientes, tampoco mencionan cuál fue el tiempo postexodoncia.
Obtuvimos pulpas de 16 mujeres y 26 hombres; según los resultados, se pudo inferir que el sexo del paciente no influye en la obtención de una mayor viabilidad celular. Los pacientes se dividieron en dos grupos etarios, de 13 a 27 años y de 28 a 42 años. La limitación en este estudio fue que se obtuvieron muy pocas muestras del grupo etario mayor (tres muestras) a diferencia del grupo etario menor. Esto se debió a que la mayor población que acudió a la clínica para la exodoncia de terceras molares fueron pacientes jóvenes.
Es importante evaluar la viabilidad celular en los ensayos de cultivos celulares de la pulpa dental porque cumple la función de control de calidad de los cultivos. Sugerimos utilizar la pulpa dental antes de las 24 horas postexodoncia para obtener un óptimo número celular y viabilidad celular. Sin embargo, se necesitan más investigaciones que puedan corroborar lo manifestado. Se recomienda realizar cultivos de células obtenidas en otros puntos de tiempo (48 horas y más de 72 horas postexodoncia) para evaluar la capacidad de proliferación celular. Asimismo considerar mayor número de muestra en grupos etarios adultos.
Este estudio abre camino a más investigaciones donde se puedan indagar más factores que modifi quen la viabilidad celular. Siendo éstas las que contribuirían a optimizar los protocolos de aislamiento celular, cultivos celulares, pruebas de citotoxicidad, que se ejecutan en medicina regenerativa e ingeniería tisular.4-7,11-14
CONCLUSIONES
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, se concluye que las pulpas dentales que fueron obtenidas antes de las 24 horas postextracción presentan mayor porcentaje de viabilidad y población celulares con respecto a las pulpas dentales que fueron obtenidas después de las 72 horas postexodoncia. Existe relación inversa entre la edad de los pacientes con la viabilidad celular y el número de células en el grupo de pulpas dentales obtenidas antes las 24 horas postextracción. Tanto la viabilidad celular como el número se células son mayores en pacientes de 13 a 27 años. Asimismo, no existe relación entre el sexo de los pacientes y la viabilidad celular y el número de células, en ambos grupos de tiempo.
Se recomienda usar piezas dentales antes de cumplir las 24 horas postextracción, para la obtención de la pulpa con una mayor viabilidad celular y un mayor número de células.
