Antecedentes/Objetivo.

La enfermedad de la meleira en papaya en México está asociada al Virus de la meleira de la papaya variante mexicana (PMeV-Mx) y se caracteriza por la exudación espontánea de látex en los frutos. El ORF2 de PMeV-Mx codifica una proteína que tiene motivos de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) la cual es esencial para la replicación viral. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método para la producción y purificación de la proteína recombinante codificada por el ORF2 de PMeV-Mx (pORF2) en Escherichia coli y generar anticuerpos específicos para su detección.

Materiales y Métodos.

El genoma de PMeV-Mx se analizó utilizando UGENE para predecir los ORFs e identificar el posible sitio deslizante. Se utilizaron plantas de papaya inoculadas con látex de frutos de plantas sintomáticas como reservorio del virus, la infección por PMeV-Mx se confirmó mediante RT-PCR. El ORF1 y ORF2 se amplificaron por PCR a partir de ADNc de papayas infectadas. Ambos se clonaron en el vector pGEM-T Easy y se transfirieron a pDONR221 y pDEST17 para su expresión en E. coli. La proteína recombinante 6xHis-pORF2 se expresó en la cepa BL21 de E. coli y se purificó bajo condiciones desnaturalizantes. La proteína purificada se utilizó para generar anticuerpos policlonales. La especificidad del antisuero y sus diluciones óptimas de trabajo se evaluaron mediante ensayos de inmunodetección, utilizando la proteína recombinante como diana y proteínas etiquetadas con His como controles negativos.

Resultados.

Se logró la expresión y purificación de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx. Se detectó una banda de aproximadamente ~46,5 kDa, consistente con su peso molecular estimado. La expresión de la proteína se observó entre 2 y 6 horas después de la inducción. El análisis por western blot confirmó la presencia de la etiqueta de Histidinas y la integridad de la proteína recombinante. La purificación con resina Ni-NTA resultó en una banda intensa de ~46,5 kDa, junto con bandas menores de 15 a 150 kDa. Se generaron anticuerpos policlonales contra pORF2, los cuales reconocieron específicamente la proteína purificada en los ensayos de inmunodetección, con detección en diluciones de 1:500 a 1:3000. No se observó reactividad cruzada con los controles negativos, aunque se detectó una banda inespecífica de ~75 kDa en extractos de E. coli.

Conclusión

. Se estableció un protocolo para la expresión, detección y purificación de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx en E. coli. Los anticuerpos policlonales generados en conejo reconocieron la proteína de interés en extractos proteicos de células bacterianas, aunque se requiere una mayor optimización para mejorar la especificidad. Estos anticuerpos contribuirán al desarrollo futuro de herramientas de diagnóstico y a la caracterización de la proteína en plantas.

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