Área de estudio

La investigación se realizó en un invernadero tipo túnel del Departamento de Horticultura, de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Saltillo, Coahuila, México, que se localiza entre las coordenadas geográficas 25° 22’ de latitud norte y 101° 02’ longitud oeste y a una altitud de 1 742 m. Se utilizaron plantas de frambuesa (xz28), fueron plantadas en el mes de febrero de 2021 a una edad de dos meses, en la plantación se utilizaron tres camellones de suelo con 12 m de largo y 1 m de ancho, se utilizó un sistema de riego por goteo con cintilla de 20 cm de separación entre goteros.

Sustancias húmicas

Las sustancias húmicas y fúlvicas se extrajeron de Leonardita, compuesto orgánico mineral, aportado por la empresa minera DHD de México ubicada en Sabinas, Coahuila. La extracción se realizó con la metodología de ^{López et al. (2014}), se utilizó hidróxido de potasio (KOH) 1 N y para la separación se utilizó ácido acético hasta obtener un pH de 4, después de 24 h, por decantación, se obtuvieron los ácidos fúlvicos con una coloración amarilla dorada, mientras los ácidos húmicos con apariencia de suelo y color café oscuro permanecieron en el fondo del contenedor.

Material microbiológico y preparación de cepas bacterianas

Las cepas de rizobacterias de Azospirillum brasilense, Pseudomonas putida y Pseudomonas fluorescens descubiertas por Johana Dobereiner, Ananda Mohan Chakrabarty y Migula respectivamente, fueron proporcionadas por la Colección Nacional de Cepas Microbianas y Cultivos Celulares, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. La rizobacteria Azospirillum brasilense se reactivó en medio de cultivo NRCB, las especies de Pseudomonas se sembraron en medio King B. En la preparación, las bacterias se cultivaron en caldo nutritivo y en agitación constante a 150 rpm durante 48 h a 25 °C ±5 °C, donde el crecimiento bacteriano fue evidenciado por la turbidez en el medio. La concentración celular bacteriana fue de 10⁹ cel ml^-1 de acuerdo con la escala de turbidez de ^{Mc Farland (Mc Farland, 1907}).

Tratamientos

Se aplicaron cinco mezclas diferentes con dos dosis, resultando 10 tratamientos más un control con cuatro repeticiones cada uno, aplicados en un diseño completamente al azar. En el experimento se utilizaron los siguientes tratamientos: 1) ácidos fúlvicos + mezcla de microorganismos dosis 1 (AFyMM d1); 2) ácidos fúlvicos + mezcla de microorganismos dosis 2 (AFyMM d2); 3) ácidos húmicos + Pseudomonas fluorescens dosis 1 (AHyPF d1); 4) ácidos húmicos + Pseudomonas fluorescens dosis 2 (AHyPF d2); 5) ácidos fúlvicos + Azospirillum brasilense dosis 1 (AFyAzoz d1); 6) ácidos fúlvicos + Azospirillum brasilense dosis 2 (AFyAzoz d2); 7) ácidos fúlvicos + Pseudomonas fluorescens dosis 1 (AFyPF d1); 8) ácidos fúlvicos + Pseudomonas fluorescens dosis 2 (AFyPF d2); 9) mezcla de ácidos húmicos y ácidos fúlvicos + Azospirillum brasilense dosis 1 (MHyF+Azoz d1); 10) mezcla de ácidos húmicos y ácidos fúlvicos + Azospirillum brasilense dosis 2 (MHyF+Azoz d2) y 11) control se aplicó solución nutritiva ^{Steiner (Steiner, 1961}).

En la mezcla de microorganismos se utilizaron: Pseudomona fluorescens, Pseudomona putida y Azospirillum brasilense. La dosis 1) ácidos húmicos o fúlvicos: 3 ml y microorganismo 5 ml, en dosis 2) ácidos húmicos y fúlvicos: 3.5 ml y microorganismo 4 ml, los tratamientos fueron aplicados directamente en el suelo cerca de la base de las raíces de la planta, las sustancias húmicas cada 15 días y las rizobacterias cada 30 días.

Variables evaluadas

Las variables agronómicas se evaluaron al final del ciclo de cultivo, 180 días después del trasplante. La altura de planta se midió con cinta métrica desde la base de la corona hasta el ápice de la hoja más alta, el diámetro basal del tallo fue medido con un calibrador digital vernier marca Steren modelo HER-411. El peso de fruto fue registrado con báscula gramera marca TJ modelo MH-500. El diámetro polar de fruto y diámetro ecuatorial de fruto fue medido con un calibrador digital vernier marca Steren modelo HER-411, el peso de fruto fue registrado con bascula gramera marca TJ modelo MH-500, el número de frutos se registró por planta y en el rendimiento se pesó el total de frutos por planta, se reportó como g planta^-1.

En las variables de calidad, los sólidos solubles totales (SST) se midieron al colocar una gota de jugo del fruto de frambuesa sobre el lente del refractómetro digital marca Hanna modelo 96-801, las lecturas fueron expresadas en °Brix. El potencial de hidrogeno (pH), se midió con un potenciómetro digital HI98130 (Hanna Instruments). La acidez titulable se determinó por colorimetría de acuerdo con la ^{AOAC (2000)}. La determinación de vitamina C en fruto de frambuesa fue con la metodología de ^{Padayatt et al. (2001}).

Análisis estadístico

Los datos se analizaron por medio de un análisis de varianza (Anova), se utilizó el paquete estadístico ^{Infostat versión 2020}. Para la separación de medias se utilizó la prueba de LSD de Fisher (p≤ 0.05). El análisis de componentes principales se realizó con el paquete computacional ^{Minitab16, 2009}.

Variables agronómicas y de producción

Se evaluó la altura de planta de frambuesa (Figura 1A), se observaron diferencias significativas entre tratamientos, la altura se benefició con la aplicación de AFyAzoz d1, AFyPF d2, MHyF + Azoz d1, AHyPF d2, MHyF + Azoz d2, AHyPF d1, AFyAzoz d2 el incremento con respecto al control fue de 24.3, 23.6,22.2, 21.6, 15.5, 11.4 y 10.8% respectivamente, el resto de los tratamientos se comportaron estadísticamente iguales al testigo. Estos resultados coinciden con ^{Schoebitz et al. (2016}), al aplicar ácidos húmicos más un consorcio bacteriano en el cultivo de arándano incrementaron en 16% la altura de planta en comparación con el control. Con aplicación de ácidos húmicos y fúlvicos se promueve el crecimiento de las plantas a través de efectos similares a las hormonas, ya que la descomposición de estas sustancias libera auxinas (^{Shahrajabian et al., 2021}).

Figura 1 Altura de planta (A) y diámetro basal de tallo (B) en frambuesa con aplicaciones de sustancias húmicas y rizobacterias. Letras diferentes entre barras indican diferencias significativas entre tratamientos LSD de Fisher (p≤ 0.05).  

En la evaluación del diámetro basal de tallo en plantas de frambuesa (Figura 1B), se observó que la aplicación de AFyPFd2 y los AHyPF d2 incrementaron el diámetro de tallo en 30.4 y 20.8%, el resto de los tratamientos se comportaron iguales al testigo.

En un estudio realizado por^{Protim et al. (2017}), al inocular cepas del género pseudomonas en plantas de ricino aumentaron el diámetro de tallo en 10.6% comparado con la fertilización química. Este aumento observado fue causado por la combinación de sustancias húmicas y rizobacterias, de acuerdo con ^{Ahmad et al. (2018}) encontraron que la aplicación combinada de ácido húmico y rizobacterias es mucho mejor que su efecto individual y observaron una mejora considerable del crecimiento de plantas de canola.

El peso de fruto Figura 2A, se favoreció en forma significativa con la aplicación de AFyMM d2 y con AFyPF d2 donde obtuvieron un incremento de 37.8 y 24.9%; sin embargo, este último tratamiento estadísticamente fue igual al control, como el resto de los tratamientos. En un estudio por ^{Zejak et al. (2021}), al evaluar la producción y calidad de frutos frambuesa reporta en peso de fruto valores entre 3.4 y 4.7 g los cuales fueron similares a los hallazgos en este trabajo.

Figura 2 Peso de fruto (A); diámetro ecuatorial de fruto (DEF) y diámetro polar de fruto (DPF) (B); número de frutos (C) y rendimiento (D) en frambuesa, con aplicaciones de sustancias húmicas y rizobacterias. Letras diferentes entre barras indican diferencias significativas entre tratamientos LSD de Fisher (p≤ 0.05).  

El peso de fruto fue incrementado por los ácidos fúlvicos y húmicos, al respecto ^{Kumar et al. (2019}), al aplicar ácidos fúlvicos derivados de diferentes fuentes y aplicados al cultivo de maíz, obtuvo un crecimiento significativo en peso de grano de 4% con respecto al control, el aumento encontrado en la investigación es consecuencia a que los ácidos fúlvicos fueron extraídos de Leonardita y no de extractos de plantas como los utilizados por ^{Kumar et al. (2019)} en su investigación.

La evaluación del diámetro ecuatorial de fruto (DEF) se observa en la Figura 2B, el crecimiento observado en esta variable es con la aplicación de AFyMM d2, AFyPF d2, AFyAzoz d2 y AHyPF d2 con incrementos respecto al control de 44.5, 29.8, 28.6 y 28.4% respectivamente, los otros tratamientos aplicados se comportaron iguales al testigo. El diámetro polar de fruto (DPF) en la Figura 2B, se favoreció con los tratamientos AFyPF d2, AFyMM d2, AFyAzoz d1, con 13.3, 11.8 y 8.4%, los demás tratamientos estadísticamente fueron iguales al control.

En un estudio por ^{Abd El-Razek et al. (2020}) con aplicaciones de ácidos húmicos y materia orgánica en cultivo de olivo, al evaluar el fruto se benefició el DPF en 30.2% y el DEF en 28.9%. ^{Abd El-Rheem et al. (2017}) con aplicaciones de ácidos fúlvicos con dosis 2 ml L^-1 en árbol de persimón (Diospyros kaki L.) incremento el DPF en 5.3% y el DEF 8.8%, este incremento inferior fue generado a que aplicaron dosis menores de ácidos fúlvicos, al utilizado en el estudio que fue de un rango de 3 a 3.5 ml L^-1 más el uso de rizobacterias. ^{Espinosa et al. (2017)} al aplicar rizobacterias como Pseudomonas lini con diferentes sustratos en el cultivo de tomate, al evaluar el fruto aumentó el DPF en 6.1% y en DEF 4% con respecto a su testigo sin rizobacteria. Sin embargo, ^{Andrade-Sifuentes et al. (2020}) al aplicar una bioinoculación con Azospirillum brasilense en cultivo de tomate no encontraron diferencias entre tratamientos al evaluar DPF y DEF.

El número de frutos (Figura 2C), fue favorecido con la aplicación de, AFyPF d2, AFyAzoz d1, MHyF+Azoz d2 y con AHyPF d2 con 45.8, 39.5, 33.3 y 29.1% respectivamente en comparación al control, el resto de los tratamientos estadísticamente fueron iguales al testigo. Estos resultados concuerdan con lo reportado por ^{García-Seco et al. (2015}) con la inoculación de una rizobacteria promotora del crecimiento vegetal Pseudomonas fluorescens incrementó en 42.8% el número de frutos en el cultivo de arándano.

En un estudio observado por ^{Kamal et al. (2017}) al usar ácidos húmicos en plantas de granada elevó el número de frutos en 38.2%. ^{Andrade-Sifuentes et al. (2020}) realizaron un experimento donde aplicaron la cepa Azospirillum brasilense en el cultivo de tomate, donde aumentaron el número de frutos por planta en 27%.

El rendimiento que se observa en la Figura 2D, se favoreció con la aplicación de los tratamientos AFyPF d2, AFyAzoz d1, AHyPF d2 y con la MHyF+Azoz d2 registró un aumento de 78.2, 66.8, 57.5 y 48.7% respectivamente en comparación con el control, el resto de los tratamientos se comportaron iguales al testigo. Trabajos demostrados por ^{Hernández-Montiel et al. (2017}) al aplicar cepas de Pseudomona putida en cultivo de tomate elevó el rendimiento en 20.7%. ^{Andrade-Sifuentes et al. (2020}) en un experimento al aplicar la rizobacteria Azospirillum brasilense incremento el rendimiento en el cultivo de tomate en 35%. Sin embargo, ^{Rosales et al. (2015)}, al aplicar ácidos fúlvicos en cultivo de melón, compararon tres tratamientos en suelo con un testigo sin aplicación de ácidos fúlvicos (AF0), aplicación de ácidos fúlvicos a pH6 (AF6) y de ácidos fúlvicos a pH7 (AF7) al evaluar el rendimiento no encontraron diferencias entre los tratamientos aplicados.

Este rendimiento más alto presentado en el estudio fue causado por la combinación de rizobacterias con sustancias húmicas que sirvieron de fuente de carbono. ^{Olivares et al. (2017}) menciona que las sustancias húmicas incrementan la exudación de ácidos orgánicos en la raíz, favoreciendo la interacción de la planta con microorganismos benéficos permitiendo incrementar la absorción y transporte de nutrientes minerales.

Variables de calidad de fruto

Se evaluaron atributos de calidad en fruto de frambuesa (Cuadro 1), los sólidos solubles totales (SST), que se midieron en °Brix, fueron favorecidos por los tratamientos AF y MM d1 en 12.3 °Brix y por los AF y PF d1 en 12.2 °Brix el aumento fue de 23 y 22% con respecto al control, los demás tratamientos se comportaron de acuerdo con el análisis estadístico de la misma forma que el testigo. ^{Dujmović et al. (2012)} al evaluar diferentes variedades de frambuesa encontraron en su investigación valores en sólidos solubles totales un rango de 9.4 a 11.5 °Brix.

En el incremento de SST respecto al control, los resultados fueron diferentes a ^{Aghaeifard et al. (2015}), donde valoraron el impacto del ácido húmico aplicado a plantas de fresa y obtuvieron crecimientos de SST de 13.9% con respecto al control. ^{Ortiz et al. (2016}), al utilizar rizobacterias del género Pseudomonas reportaron incrementos en SST de 1.2% en el fruto de fresa en comparación con el testigo.

El pH del fruto se acrecentó con la aplicación de AFyMM d2 con un crecimiento respecto al control de 5.6%. Estos resultados fueron próximos a lo reportado por ^{El-Beltagi et al. (2022}), al aplicar un biofertilizante a base de rizobacterias de Azospirillum y Azotobacter en el cultivo de tomate cherry donde se incrementó el pH del jugo de fruto en 7% en comparación al testigo.

Sin embargo, fueron diferentes a lo mencionado por ^{Shehata et al. (2011}) al aplicar ácidos húmicos en el cultivo de fresa, al evaluar el pH de fruto no encontraron diferencias estadísticas entre tratamientos. ^{Trujano-Fragoso et al. (2017}), realizaron la evaluación en frutos de frambuesa de los cultivares Adelita, Erika, Lupita y Polka con valores de 3.42 a 3.83, estos mismos valores de pH fueron obtenidos en este estudio.

En la acidez titulable del fruto se observa que los tratamientos se comportaron en su mayoría iguales al control, a excepción de AF y MM d1 (0.96%) que presentó frutos con menor acidez con respecto a los demás tratamientos aplicados. ^{Alvarado et al. (2016)}, al estudiar diferentes densidades de plantación en el cultivo de frambuesa al evaluar la acidez titulable reportó valores de 1.37 a 1.42% que fueron con más acidez a lo encontrado en la investigación.

En un estudio realizado por ^{Todeschini et al. (2018}), donde utilizaron cepas del género Pseudomonas en combinación con hongos micorrízicos encontraron un incremento de acidez titulable en fruto de fresa de 2.2% con respecto a su control. Mientras que ^{González et al. (2018}), al aplicar la Pseudomonas lini en cultivo de tomate aumentó en un 18.9% la acidez del fruto con respecto al testigo sin inoculación. ^{Orhan et al. (2006}), al aplicar rizobacterias en el cultivo de frambuesa no encontraron diferencias significativas entre tratamientos.

La vitamina C se benefició con los AH y PF d2 en 53.8 mg 100 g^-1, AF y Azoz d1 52.5 mg 100 g^-1 y con aplicación de AF y MM d1 en 51.6 mg 100 g^-1, con incremento respecto al control de 20, 17 y 15% respectivamente, el resto de los tratamientos estadísticamente fueron iguales al testigo. ^{Ponder y Hallmann (2020)}, en una investigación al comparar la agricultura convencional y de forma orgánica, reporta que las frutas de frambuesa convencionales obtuvieron valores de vitamina C de 55.4 mg 100 g^-1 en comparación con las frutas orgánicas con 46.2 mg 100 g^-1. ^{Aminifard et al. (2012}), con aplicaciones de ácidos fúlvicos en el cultivo de pimiento no observaron diferencias entre tratamientos al evaluar la vitamina C. Sin embargo, ^{Eshghi y Garazhian (2015}) al utilizar ácidos húmicos en aplicaciones al suelo vía drench en el cultivo de fresa, incrementaron la vitamina C en 45% con respecto al control.

Análisis de componentes principales

Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) donde se incluyeron las variables agronómicas y de calidad en el cultivo de frambuesa. El análisis de los tres componentes principales de las poblaciones explicó el 85.9% de la variación de datos de las 11 variables analizadas tal porcentaje resultó en sumar consecutivamente los valores proporcionales determinados en el análisis (Cuadro 2).

De acuerdo con los vectores propios, en el primer componente principal las variables originales más importantes fueron: peso fruto, altura, número de frutos, rendimiento, las cuales contrastan con SST. En el segundo componente principal las variables con mayor influencia fueron: acidez y altura que contrastan con SST y pH. El tercer componente estuvo fuertemente influido por las variables: peso de fruto y DEF que se relacionan negativamente con diámetro de tallo.

En la Figura 3 se observaron las correlaciones entre las variables según los ángulos de los vectores que las representan. Se presentó una correlación positiva y altamente significativa entre las siguientes variables: número de frutos y altura de planta (r= 0.94^**), rendimiento y número de frutos (r= 0.91^**), peso de fruto y DEF (r= 0.89^**), peso de fruto y DPF (r= 0.85^**).

Figura 3 Biplot de tratamientos con sustancias húmicas más rizobacterias y con variables agronómicas y de calidad de fruto en frambuesa. SST= sólidos solubles totales; DEF= diámetro ecuatorial de fruto y DPF = diámetro polar de fruto. 

Esto indica que el número de frutos fue favorecido por la altura de planta, y el rendimiento por el número de frutos, el peso de fruto fue influenciado por el DEF y DPF. Respecto a las variables que presentan una relación negativa y altamente significativa se encuentran: acidez de fruto y los SST (-0.86^**). Por lo que los tratamientos con bajo porcentaje de acidez incrementaron los SST en el fruto de frambuesa.