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Introducción
La zarzamora (Rubus spp.) produce un fruto muy valorado debido a su sabor atractivo, a la cantidad de nutrientes que contiene, como carbohidratos, lípidos, vitaminas y minerales, además de ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas; así mismo, por los beneficios que ofrece como antioxidante, antimicrobiano y antipirético (Chauhan y Chauhan, 2022), atributos que le han otorgado la clasificación de alimento funcional; es decir, además de su valor nutricional, posee componentes que ofrecen beneficios a la salud (Sik et al., 2024).
El número cromosómico básico en el género Rubus es reconocido como x = 7, los niveles de ploidía que se conocen oscilan desde 2x hasta 14x, y posiblemente 18x, incluyendo números de cromosomas impares (3x, 5x, 7x, etc.) y aneuploides (Thompson, 1995; 1997), por lo que se destaca la complejidad y la variabilidad genética existente dentro del género. Se han realizado conteos de cromosomas en 387 especies, que representan el 40 % de las que se conocen (Thompson, 1997); no obstante, Rubus es uno de los géneros más diversos que presenta un amplio espectro de especies silvestres y cultivadas.
La zarzamora se propaga de forma sexual mediante semillas, o asexual a través de divisiones de la corona, acodos aéreos, acodos subterráneos, estacas de tallo subterráneo, y mediante técnicas de propagación in vitro(Orozco-Rodríguez et al., 2011). La forma de propagación de las plantas puede provocar modificaciones en el nivel de ploidía (Vallejo-Marín, 2014), factor que estimularía la pérdida de identidad genética en variedades comerciales y la dificultad del uso de germoplasma para el mejoramiento genético por hibridación; además, la progenie con números de cromosomas desequilibrados puede reducir su fertilidad (Poehlman y Allen, 2003; Thompson, 1995) o ser genéticamente inestable (Vélez-Torres y Fernández-Pavía, 2023).
La alteración de la ploidía manifiesta inestabilidad cromosómica, que puede ser dada por cambios expresados como euploidía (aumento o disminución del conjunto completo de cromosomas) o aneuploidía (pérdida o ganancia de cromosomas individuales) (Garber, 1975; Vélez-Torres y Fernández-Pavía, 2023). La poliploidía es un tipo de euploidía que puede afectar la estabilidad cromosómica (Matos, 2014) porque se asocia con una rápida y extensa reestructuración del genoma, que incluye cambios en el número cromosómico y en la estructura cromosómica debido a translocaciones o eliminaciones (De Storme y Mason, 2014). Vallejo-Marín (2014) ha reportado que la reproducción asexual facilita el establecimiento de la poliploidía, la cual evoluciona más en las especies diploides que se reproducen asexualmente, y raramente en las diploides sin reproducción asexual; por lo tanto, concluye que la reproducción asexual permite la persistencia de genotipos poliploides y plantea que la poliploidía y la reproducción asexual están fuertemente correlacionadas; sin embargo, son escasos los estudios que han investigado tal asociación.
Por lo anterior, es importante estudiar el papel de la reproducción sexual y asexual en su interacción con el nivel de ploidía y la estructura cromosómica, lo cual, estaría directamente relacionado con el efecto sobre la estabilidad cromosómica; por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar el número y longitud de cromosomas en genotipos silvestres y cultivados de zarzamora reproducidos sexual y asexualmente a fin de analizar si la forma de propagación se relaciona con la estabilidad cromosómica.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se emplearon los cultivares introducidos de uso libre de zarzamora denominados Kiowa, Shawnee, Cheyenne, Apache, Ébano y Choctaw, una población silvestre recolectada en la localidad de Mexcalcuautla, municipio de Teziutlán, Puebla, México, a una altitud de 2200 msnm, 19° 43’ 00” latitud N y en el meriadiano 97° 38’ 42” de longitud O, además de una variedad de uso común adquirida en un vivero ubicado en la localidad de Ahuacatán, municipio de Jalacingo, Veracruz, México, a una altitud de 1864 msnm, a 19° 46’ 55” N y en el meridiano 97° 17’ 11” de longitud O.
Reproducción sexual y asexual
Para evaluar la reproducción sexual, se recolectaron raíces de plantas silvestres de zarzamora en el municipio de Teziutlán, Puebla, México; asimismo, raíces de la variedad Kiowa propagada bajo condiciones de invernadero en el Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Texcoco, México, a través de la siembra de semilla en sustrato peat moss, utilizando como agente escarificante Agrophon®. Para evaluar la reproducción asexual, las variedades Shawnee, Cheyenne, Apache, Ébano, Choctaw, y la variedad de uso común de Jalacingo se propagaron mediante acodos aéreos de meristemo apical usando como sustrato peat moss y se mantuvieron bajo condiciones de invernadero hasta recolectar las raíces, 15 días después del establecimiento de acodos aéreos.
Preparación del material vegetal y preparaciones cromosómicas
En frascos con agua destilada se recolectaron los ápices de raíz durante la mañana, pero con temperaturas soleadas, específicamente entre las 10:00 y 11:00 am, ya que en horas posteriores, la cantidad de células en mitosis disminuye. Se procedió a la aplicación de un pretratamiento que consistió en colocar los frascos del material recolectado en frío (4 °C aproximadamente) durante 24 h, con la finalidad de acumular las células en metafase; a continuación, se realizó la fijación en solución Farmer (etanol 96° y ácido acético glacial, 3:1 v/v). Se llevó a cabo la hidrólisis con HCI 1N en estufa durante 15 min, a una temperatura de 60 ± 1 °C. De inmediato, se realizó la tinción con el reactivo de Schiff durante 15 min a 60 ± 1 °C, también en la estufa. Las muestras se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 20 min, después de este tiempo se efectuó el aplastado de los ápices, para lo cual se añadió una gota de acetocarmín 1 %.
Conteo, medición de cromosomas y análisis
Se hicieron observaciones de los meristemos apicales de raíz teñidos, bajo microscopio (Zeiss, Carl Zeiss AG, Jena, Alemania) con objetivos de 63 y 100x. Se eligieron las cuatro mejores metafases por cada variedad y se realizó el conteo de los cromosomas. Se determinó la longitud total de los cromosomas de manera individual en μm, procesando las metafases seleccionadas con el software ImageJ 1.54g; estos datos fueron sometidos a análisis de varianza y comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05) utilizando el modelo lineal general de un diseño experimental completamente al azar con el PROC GLM de SAS V9 (SAS Institute, 2002), donde se emplearon como repeticiones el número de cromosomas totales encontrados por variedad.
Resultados y discusión
Recuento cromosómico para identificar niveles de ploidía
Los resultados de las observaciones cromosómicas mostraron variación en el nivel de ploidía para las variedades evaluadas, se encontraron niveles desde diploides (2x = 14), triploides (3x = 21), hasta tetraploides (4x = 28) (Cuadro 1), este último fue el nivel que prevaleció con mayor frecuencia en las muestras observadas. La diversidad en los niveles de ploidía observada concuerda con los estudios realizados por Thompson (1995; 1997), quien reportó que el número básico de cromosomas en Rubus es siete, con niveles de ploidía desde diploides 2x = 14 hasta dodecaploides 12x = 84.
Cuadro 1 Niveles de ploidía observados bajo microscopio en variedades y recolectas de zarzamora (Rubus spp.) reproducidas en forma sexual o asexual, tratadas con baja temperatura.
| Variedad | Reproducción | Nivel de ploidía |
| Kiowa | Sexual | 4x = 28 |
| Kiowa | Asexual | 3x = 21 |
| Choctaw | Asexual | 4x = 28 |
| Shawnee | Asexual | 4x = 28 |
| Cheyenne | Asexual | 4x = 28 |
| Apache | Asexual | 4x = 28 |
| Ébano | Asexual | 3x = 28 |
| Teziutlán | Sexual | 2x = 14 |
| Jalacingo | Asexual | 3x = 21 |
La ploidía identificada en la variedad Kiowa propagada de forma sexual fue tetraploide (4x = 28), mientras que el nivel de ploidía observado en la misma variedad, pero propagada de forma asexual, fue triploide (3x = 21) (Figura 1).
Figura 1 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) variedad Kiowa propagada en forma sexual (A y B), conteo de cromosomas 4x = 28; y propagada en forma asexual (C y D), conteo de cromosomas 3x = 21, escala 10 µm.
El resultado del conteo cromosómico en la variedad Kiowa propagada en forma sexual coincide con lo reportado por Rodríguez et al. (2018), quienes también identificaron a esta variedad con un nivel de ploidía tetraploide (4x = 28). Moore y Clark (1996) señalaron que Kiowa fue el resultado de una cruza entre progenitores tetraploides y en su ascendencia completa, en la cual intervienen cultivares como Comanche, Rosborough, Thornfree, Brazos y Wells Beauty, también se muestra su origen tetraploide; sin embargo, el hecho de que se encontró triploidía (3x = 21) en el material propagado asexualmente indica la alteración en la estabilidad cromosómica de la variedad, pues la disminución de cromosomas significa inestabilidad cromosómica mediante cambios en el nivel de ploidía (Vélez-Torres et al., 2024). Al respecto, Thompson (1997) mencionó que esta variante puede representar la unión de un gameto no reducido con un gameto reducido, un fenómeno común en el género Rubus, que da lugar a individuos ocasionales con diferente nivel de ploidía.
El conteo de cromosomas realizado en la variedad Choctaw propagada de forma asexual, mostró un nivel de ploidía tetraploide (4x = 28) (Figura 2).
Figura 2 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) variedad Choctaw propagada en forma asexual (A y B). Conteo de cromosomas 4x = 28. Escala 10 µm.
El conteo de cromosomas coincide con los resultados de Thompson (1995), quien señala que la ancestría de Choctaw corresponde a ARK 526 (Darrow × Brazos) × Rosborough, y el número de cromosomas que reporta es 28 basado en el número de cromosomas de los progenitores, en lugar de contarse. Esto concuerda con los registros de Moore y Clark (1989) sobre el pedigrí de Choctaw integrado por progenitores tetraploides.
La variedad de zarzamora Shawnee propagada de forma asexual presentó un nivel de ploidía tetraploide (4x = 28) (Figura 3).
Figura 3 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) variedad Shawnee propagada en forma asexual (A y B). Conteo de cromosomas 4x = 28. Escala 10 µm.
El resultado del conteo de cromosomas coincide con Thompson (1995), ya que reporta un número cromosómico de 28 para Shawnee con base en el número de cromosomas de los progenitores directos [Cherokee × AR. 586 (Thornfree × Brazos)] en lugar de contarse; asimismo, en el pedigrí de la variedad registrado por Moore et al. (1985) se incluyen otros cultivares, entre ellos Merton Thornless, Darrow y los cultivares viejos Lawton y Eldorado, los cuales se han reportado como tetraploides (Thompson, 1995).
La variedad Cheyenne propagada de forma asexual presentó un nivel de ploidía tetraploide (4x = 28) (Figura 4) en las células analizadas.
Figura 4 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) variedad Cheyenne propagada en forma asexual (A y B). Conteo de cromosomas 4x = 28. Escala 10 µm.
El resultado del conteo de cromosomas coincide con Thompson (1995), quien reporta el número cromosómico de 28 para Cheyenne, basado en el número de cromosomas de los progenitores directos (Brazos × Darrow) en lugar de contarse. En el pedigrí de la variedad, registrado por Moore et al. (1977), también se encuentra ascendencia tetraploide, como los cultivares Lawton y Hedrick.
Los conteos cromosómicos realizados en la variedad Apache propagada de forma asexual mostraron un nivel de ploidía tetraploide (4x = 28) (Figura 5).
Figura 5 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) variedad Apache propagada en forma asexual (A y B). Conteo de cromosomas 4x = 28. Escala 10 µm.
El resultado del conteo de cromosomas coincide con Clark y Moore (1999), quienes señalaron que Apache fue el resultado de una cruza entre progenitores tetraploides, y su pedigrí así lo demuestra, ya que incluye los cultivares Navaho, Comanche, Thornfree, Brazos, Cherokee, Darrow, Merton Thornless y Eldorado, todos ellos reportados como tetraploides por Thompson (1995).
La variedad Ébano propagada de forma asexual presentó un nivel de ploidía tetraploide (4x = 28) en las células analizadas (Figura 6).
Figura 6 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) variedad Ébano propagada en forma asexual (A y B). Conteo de cromosomas 4x = 28. Escala 10 µm.
El resultado del conteo de cromosomas coincide con Thompson (1995), ya que reporta el número cromosómico de 28 para Ebano, pero se asumió con base en los números de los padres [F2 de Comanche × (Thornfree × Brazos)] en lugar de contarse, Bassols y Moore (1981) registraron la misma ascendencia, en su totalidad tetraploide.
La ploidía encontrada en la población de zarzamora silvestre proveniente de Teziutlán tuvo un nivel diploide (2x = 14) (Figura 7).
Figura 7 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) población de Teziutlán propagada en forma sexual (A y B). Conteo de cromosomas 2x = 14. Escala 10 µm.
Spies y du Plessis (1985) afirmaron que la ocurrencia de especies diploides en el genero Rubus indica reproducción sexual. Este genotipo presentó el menor número de cromosomas en comparación con las demás variedades evaluadas, lo cual puede atribuirse a su naturaleza silvestre, ya que la poliploidía es considerada una característica importante en la domesticación y es un fenómeno más frecuente en las plantas cultivadas que en especies silvestres (Salman-Minkov et al., 2016). En el mismo tenor, en zarzamoras es más común que el proceso de domesticación se realice a través de la propagación asexual que de manera sexual.
De modo opuesto, en la accesión proveniente de Jalacingo se encontró un nivel de ploidía triploide (3x = 21) (Figura 8).
Figura 8 Observaciones citológicas en zarzamora (Rubus spp.) población de Jalacingo propagada en forma asexual (A y B) Conteo de cromosomas 3x = 21. Escala 10 µm.
Al respecto, Thompson (1997) mencionó que no es raro que las especies diploides den lugar a un individuo triploide, el cual mediante reproducción vegetativa o semillas apomícticas puede propagarse para formar poblaciones de medida razonable. Esto coincide al considerar que el germoplasma de esta recolecta representa una variedad de uso común.
La variación encontrada en los niveles de ploidía exige la identificación y selección del germoplasma apto para su uso en mejoramiento genético. Thompson (1995) señaló que la no concurrencia del número de cromosomas de cultivares con sus especies progenitoras hace necesario el conteo de cromosomas, debido principalmente a que los gametos no reducidos y la poliploidía espontanea son muy comunes en Rubus. Bajo esta consideración, la hibridación puede ser afectada, lo cual ha sido señalado por Poehlman y Allen (2003) y explicado por Vélez-Torres y FernándezPavía (2023). Por otra parte, la propagación asexual manifestó relación con los cambios en el nivel de ploidía, lo que debe tomarse en cuenta en el mantenimiento de germoplasma y el uso de variedades para la producción agrícola, aspectos en los que está implícita la identidad genética.
Longitud de los cromosomas en los distintos niveles de ploidía
Kiowa
Cuando la variedad provino de propagación sexual y mostró niveles de ploidía tetraploíde, la longitud de los cromosomas varió de 0.82 a 2.78 µm; en cambio, cuando la variedad fue propagada de forma asexual y presentó un nivel de ploidía triploide, los valores de la longitud de los cromosomas fueron desde 0.8 hasta 2.80 µm.
Choctaw
Esta variedad propagada de forma asexual, que reveló un nivel de ploidía tetraploide, tuvo longitudes de los cromosomas que variaron de 0.76 a 2.74 µm.
Shawnee
Propagada de forma asexual y mostrando niveles de ploidía tetraploide, tuvo cromosomas con longitudes que oscilaron entre 0.90 y 2.12 µm.
Cheyenne
Proveniente de propagación asexual, con un nivel de ploidía tetraploide, exhibió longitudes de los cromosomas desde 0.63 hasta 2.35 µm.
Apache
Propagada de forma asexual y con niveles de ploidía tetraploide, presentó longitudes de los cromosomas que oscilaron desde 0.56 hasta 2.24 µm.
Ébano: En esta variedad propagada de forma asexual y con niveles de ploidía tetraploide no se encontaron longitudes menores de 1 µm y se observaron algunos cromosomas con longitud superior a 2 µm, siendo 2.61 µm la medición de mayor tamaño.
Teziutlán
Esta población silvestre, proveniente de reproducción por semilla, mostró un nivel de ploidía diploide, las medidas de sus cromosomas oscilaron desde 0.75 hasta 3.14 µm.
Jalacingo
Esta población, que procedió de propagación vegetativa, mostró niveles de ploidía triploide, la longitud de sus cromosomas varió de 0.90 a 2.69 µm.
De manera general, la variabilidad existente en la longitud total de los cromosomas encontrados en cada nivel de ploidía identificado se muestra en la Figura 9.
Figura 9 Variación de la longitud de cromosomas en distintos niveles de ploidía encontrados en variedades y poblaciones de zarzamora (Rubus spp.) reproducidas sexual y asexualmente.
Se observa que destacó la variación en las medianas, así también, en los valores mínimos y máximos y en los rangos intercuartiles que mostraron la dispersión de los datos, incluso se presentaron datos atípicos, esto indica diferencias existentes en longitud de cromosomas, no únicamente entre variedades y recolectas, sino también entre los materiales tetraploides, no obstante que comparten ascendencia con este nivel de ploidía, o pese a que incluyen en su pedigrí a los mismos progenitores.
De manera detallada, mediante análisis de varianza, se comprobó que con un nivel de significancia del 5 % hubo diferencias altamente significativas entre las variedades analizadas; es decir, no presentaron las mismas longitudes de cromosomas, lo cual se muestra en el Cuadro 2.
Cuadro 2 Análisis de varianza para longitud de cromosomas en distintos niveles de ploidía encontrados en variedades y poblaciones de zarzamora (Rubus spp.) reproducidas sexual y asexualmente.
| Fuente de variación | GL | SC | CM | p_value | SIG |
| Variedades | 8 | 4.26 | 0.53 | 0.0001 | ** |
| Error | 835 | 96.05 | 0.11 | ||
| Total | 843 | 100.31 | |||
| CV (%) | 23.02 |
GL: grados de libertad, SC: suma de cuadrados, CM: cuadrados medios, CV: coeficiente de variación, SIG: significancia, **: P ≤ 0.01.
La prueba de comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05) (Cuadro 3) indicó que hubo diferencias significativas en longitud de cromosomas entre las variedades o recolectas reproducidas asexualmente; por el contrario, entre las variedades reproducidas por semilla (Teziutlán y Kiowa) no hubo diferencias. Estos resultados muestran indicios de que la propagación asexual tiene mayor relación con la inestabilidad cromosómica, en comparación con la reproducción sexual, lo cual coincide con lo señalado por Vallejo-Marín (2014).
Cuadro 3 Comparación de medias para longitud de cromosomas en distintos niveles de ploidía encontrados en variedades y poblaciones de zarzamora (Rubus spp.) reproducidas sexual y asexualmente.
| Variedad - Propagación | Media (μm) |
| Ebano - Asexual | 1.60 a |
| Choctaw - Asexual | 1.58 ab |
| Jalacingo - Asexual | 1.52 abc |
| Kiowa - Asexual | 1.48 abc |
| Apache - Asexual | 1.47 abc |
| Teziutlán - Sexual | 1.44 abc |
| Kiowa - Sexual | 1.42 bc |
| Shawnee - Asexual | 1.40 c |
| Cheyenne - Asexual | 1.39 c |
Medias con letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.05).
Conclusiones
Existe variación en la ploidía, desde el nivel diploide hasta tetraploide, en los genotipos de zarzamora (Rubus spp.) evaluados. Se identificaron poliploidías que indicaron inestabilidad cromosómica. Kiowa presentó tetraploidía cuando fue reproducida en forma sexual y triploidía al ser propagada vía asexual, lo que exhibió que la forma de propagación puede afectar la estabilidad cromosómica. La población silvestre Teziutlán presentó un número cromosómico diploide, probablemente al provenir de semilla, y fue indicativo de estabilidad cromosómica. En longitud de cromosomas, las variedades o poblaciones reproducidas asexualmente mostraron diferencias estadísticas entre ellas; contrariamente, las reproducidas sexualmente fueron iguales, lo cual indicó mayor inestabilidad en la propagación vegetativa que en la propagación por semilla. Por lo tanto, existe relación de la reproducción sexual con estabilidad cromosómica y de la reproducción asexual con inestabilidad cromosómica.
