Evaluación del riego y aplicación de bioestimulantes

Se utilizó un diseño experimental factorial (3×4) completamente al azar. El factor A fue la variación en el contenido de humedad por tres diferentes regímenes de riegos seguidos por un estrés hasta alcanzar -10 bares de potencial hídrico del tallo, el primero después de 15 días de riego normal, el segundo después de 30 días de riego normal y el tercero sin estrés (-4 bar) el cual constó de tres riegos semanales de un litro de solución Steiner por planta, con lo cual se obtuvo un drenaje del 30%. La concentración del fertirriego fue aumentando según requerimientos del cultivo llegando a un máximo de 75% con un CE menor a 1.2 dS m^-1 y pH entre 5.7 a 6.3.

El factor B consistió en aplicaciones quincenales de tres bioestimulantes, ácido salicílico 0.125 µM, ácido glutámico 5 g L^-1, cisteína 50 mg L^-1 y el testigo sin aplicación. Cada tratamiento tuvo 5 repeticiones.

Durante la puesta en marcha se llevaron a cabo podas de estolones con la finalidad de hacer a la planta productiva y no vegetativa. Para el control sanitario, al inicio del cultivo se utilizó un control químico, abamectina, el cual se cambió por un producto orgánico de producción propia a base de ajo, pimienta y chile. Con ambos productos se controlaron plagas como el falso medidor y la arañita roja. Hubo baja incidencia de botritis que se controló por la eliminación del órgano afectado. Para la polinización se colocaron abejorros durante la etapa de producción.

El potencial hídrico del tallo se midió usando hojas y peciolos de la parte baja de la planta, de acuerdo con procedimiento descrito por ^{Fulton et al. (2001)} con una bomba de presión Scholander (PMS Instrument Company). Las mediciones fueron a lo largo del periodo de estrés hasta alcanzar el nivel deseado de -10 bares; a partir de este punto se normalizó el riego hasta completar el ciclo siguiente.

Debido al alto contenido de sales en el agua de riego, y a la sensibilidad del cultivo de fresa a la salinidad, se diluyó el agua por una mezcla entre agua de riego normal y purificada en proporción 1:1.

Evaluación de la producción

La cosecha fue entre los meses de junio a septiembre del 2022, se realizaron cortes de fruto cada tercer día. Se pesaron los frutos de manera individual por planta y por repetición usando una báscula digital BASE 5-EP (TRUPER). En cada fruto se midió el diámetro ecuatorial y polar con un vernier digital CALDI-6MP (TRUPER).

Los sólidos solubles fueron determinados, al momento de la cosecha, con base en °Brix mediante el refractómetro óptico RHB-32ATC (PROCOMSA). Se utilizó un par de gotas del jugo, obtenidas por medio de trituración de una sección del fruto y colocadas en el equipo. Para el resto de las determinaciones los frutos se congelaron a -20 °C manteniéndolos así hasta su uso o liofilización para su posterior evaluación.

Capacidad antioxidante. La determinación se llevó a cabo por medio del método de DPPH descrito por Brand-Williams 1995 con modificación para micro placa en abril del 2023. Las extracciones se realizaron con 1500 µL de cada solvente, se tuvieron tanto extracciones lipofílicas, (Hexano:Acetona, a proporción 3:2) como hidrofílicas. Se utilizó como solvente un buffer de fosfatos, conformado de fosfato de sodio monobásico y di básico, con una concentración final de 14 mM y 36 mM respectivamente. Se añadieron 5mg de polivinilpirrolidona (PVP) el cual es un estabilizador, que se adiciona con el fin de evitar la pérdida de los compuestos y preservar la capacidad antioxidante real. Se llevó a vórtex y se procedió a colocar en un sonicador por 10 minutos. Se centrifugó a 12 500 RPM a 4 °C y finalmente se purificó con filtros de politetrafluoroetileno (PTFE). Cada extracción se diluyó en una relación 1:9 para continuar con el procedimiento.

Compuestos fenólicos. La determinación de compuestos fenólicos siguió el método de ^{Folin y Ciocalteu (1927)} con modificaciones para micro placa, la cual se realizó en el semestre septiembre - noviembre del 2022 al igual que el resto de las determinaciones.

Se pesaron 100 mg de muestra liofilizada y mezclaron, con solvente agua:acetona 1:1, para la extracción. Posteriormente se sometió a sónica por 5 minutos y finalmente se centrifugó a 12 500 RPM a 4 °C. Con el extracto se prosiguió con el método.

Prolina. El método seguido fue el descrito por ^{Bates, Waldren y Teare (1973)} donde se tomaron 50 mg de muestra liofilizada para realizar el extracto, los cuales fueron disueltos con 2 ml se ácido sulfosalicílico y sometidos a vórtex 1 minuto y a centrifugación por 30 minutos a 3500 RPM.

Vitamina C. Para la extracción se maceraron 10 g de la muestra congelada, no liofilizada, con 10 ml de HCl al 2%, posteriormente se filtraron por medio de una gasa fina y se aforó a 100 ml. Del extracto se toma una alícuota de 10 mililitros.

Se tituló con diclorofenol, el cual es preparado 24 horas previas a la evaluación con 50 mg de 2.6. diclorofenol aforado a 250 ml de agua destilada. Finalmente, los datos obtenidos se trasforman mediante la siguiente formula:

Donde el valor 0.088 es una constante específica para el ácido ascórbico.

Acidez titulable. La extracción se realizó de un fruto congelado completo macerado con 2-5 gotas de fenolftaleína, el cual se titula con hidróxido de sodio al 0.1N. El resultado se reporta como equivalentes de ácido cítrico con la siguiente formula:

Donde el valor 0.064 es la constante específica del ácido cítrico.

Los datos obtenidos se analizaron por medio de un análisis de varianza (ANOVA) usando el programa estadístico Infostat versión 2020 (^{Di Rienzo et al., 2020}). Para la separación de medias se utilizó la prueba LSD de Fisher (P < 0.05).

Parámetros agronómicos

Interacción de regímenes de riego y bioestimulantes en peso de fruto

En riego sin estrés, el peso de fruto se vio favorecido por el Glu en comparación con AS (10%), Cys (60%) y el testigo (65%) (Figura 1) teniendo un mejor resultado los tratamientos Glu y AS en relación al testigo. En el riego de 15 días + estrés el bioestimulante AS obtuvo un mayor peso de fruto y superó al testigo con 5%, Glu un 19% y Cys 20%. Sin embargo, aunque estas últimas obtuvieron menor peso que las plantas testigo, en este régimen de riego quincenal, al comparar las plantas tratadas con Cys en el régimen de riego regular, los frutos en el régimen quincenal incrementaron su peso en 35% a pesar de presentarse un estrés, lo que sugiere que la Cys es un anti estresante que aporta beneficio con respecto al peso del fruto. El resultado obtenido demuestra la acción de la Cys que activa la respuesta al estrés propia de la planta formando mensajeros y hormonas como el ácido abscísico para el cierre de estomas y así controlar el uso del agua haciéndolo más eficiente, además de elicitar osmolitos que son fotosintatos que dan peso y mantienen el agua evitando la pérdida de peso por transpiración Al no perder agua la fruta tampoco pierde su peso, ya que el agua contendida en el fruto representa el 85% del peso de este (^{Moreno y Patricia, 2009}; ^{Castillo-Rodríguez, 2005} y Raimond, 2015²).

Figura 1: Peso de fruto en la interacción de factores. Efecto en peso de frutos de fresa (Fragaria x ananassa) por la interacción del régimen de riego regular, estrés después de 15 y 30 días; y aplicaciones de ácido salicílico (AS), glutámico (Glu), cisteína (Cys) y sin aplicación (testigo) Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05).  

Figure 1: Fruit weight in the interaction of factors. Effect on weight of strawberry fruits (Fragaria x ananassa) due to the interaction of the regular irrigation regime, stress after 15 and 30 days; and applications of salicylic acid (AS), glutamic acid (Glu), cysteine (Cys) and no application (control) Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05). 

Por el contrario, en el tratamiento con Glu no se observó un efecto antiestresante, ya que en el riego con quincenal con estrés se obtuvo un 22% menos peso que en el regular sin estrés. En el riego de 30 días + estrés el testigo fue quien obtuvo un mayor peso de fruto, superando a los tratamientos Cys, AS y Glu, un 13, 22 y 23% respectivamente. Sin embargo, en este régimen de riego las plantas tratadas con Cys obtuvieron un peso de 5% más que las plantas tratadas con Cys en el riego quincenal. Esto indica que la Cys a medida que incrementan los tiempos a estrés continúa aportando un beneficio sostenido en incremento de peso, lo que no sucedió con las plantas tratadas con AS y Glu en las cuales disminuyó el peso al comparar con el régimen quincenal.

El ácido glutámico tiene su importancia en que ha demostrado que contrarresta los daños por estrés hídrico gracias a que mejora la absorción de nutrientes y la polinización evitando la perdida de producción. ^{Gang et al. (2024)} mitigaron el estrés hídrico por medio de aplicaciones de ácido glutámico en el cultivo de trigo. La acción del Glu fue de igual manera en este estudio (^{Viñals-Verde et al., 2011})

^{Shemi et al. (2021)} reportan que al aplicar ácido salicílico en otras plantas como el maíz aumentó rendimiento en condiciones de estrés hídrico. Aunado a lo anterior, ^{Khan, Fatma, Per, Anjum y Khan (2015)} reporta que al realizar aplicaciones de AS se eficientiza el uso del agua al cerrar estomas y reducir la traspiración, lo cual provoca un aumento de la biomasa en otras plantas como soya y pinos.

Interacción de regímenes de riego y bioestimulantes en diámetro polar

Los resultados fueron similar a la variable peso, ya que las plantas con riego regular y tratadas con Glu presentaron un aumento del 22% en relación con el testigo, superándola las plantas tratadas con AS que sólo incrementaron un 8%. La cisteína presentó una diferencia del 4% en relación al testigo. Mostrando que los dos bioestimulantes que favorecen el tamaño del fruto en el riego regular son Glu y AS.

En el régimen de riego con estrés cada 15 días y tratadas con AS presenta diferencia de un 3.5% más en el diámetro polar, comparado al testigo. En contraste Glu y Cys fueron inferiores al testigo con un 4 y 3.5% respectivamente dentro de este mismo régimen de riego. Sin embargo, en comparación con el testigo absoluto (riego regular sin estrés), los tres tratamientos lo sobrepasan, AS con un 19%, Cys un 11% y Glu un 10 por ciento.

Finalmente, en el régimen de riego de 30 días el diámetro polar de las plantas testigo, no fue diferente a los frutos de plantas tratadas con Glu y AS, sin embargo, el diámetro polar de las plantas tratadas con Cys fue menor en un 15% al comparar con el testigo.

Considerando lo anterior, los tratamientos con AS y Cys y que recibieron estrés moderado en el régimen de riego de 15 días (Figura 2) produjeron los mayores diámetros polares de frutos comparados con el riego regular y el régimen de 30 días. Con respecto a las plantas tratadas con Glu los frutos obtuvieron mayor diámetro polar con riego regular comparado con ambos regímenes de riego de 15 y 30 días. Finalmente, el diámetro en las plantas testigo incremento 15% en el régimen de 15 días y 24% más en el régimen de 30 días al comparar con los frutos de las plantas en riego regular.

Figura 2: Diámetro en la interacción de factores. Diámetro polar (cm) de frutos de fresa (Fragaria x ananassa) y su interacción con los factores de regímenes de riego: regular, 15 y 30 días; y aplicaciones: ácido salicílico AS, glutámico Glu, cisteína Cys y testigo. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05). 

Figure 2: Diameter in the interaction of factors. Polar diameter (cm) of strawberry fruits (Fragaria x ananassa) and its interaction with the factors of irrigation regimes: regular, 15 and 30 days; and applications: AS salicylic acid, glutamic Glu, Cys cysteine and control. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05).  

El aumento del peso se presenta por la formación y acumulación de osmolitos debido tanto al estrés presentando como a las aplicaciones realizadas, ya que los bioestimulantes aplicados son elicitores de tales compuestos. ^{Tucuch-Haas et al. (2016)} reportó que debido a que los osmolitos son azúcares en el fruto, al acumularse en este dan un aumento no sólo de peso, sino también de °Brix.

Aunado a lo anterior, ^{Chávez-Suárez, Álvarez y Ramírez (2012)} mencionó que el ácido salicílico es un regulador del crecimiento y regula los procesos de defensa contra el estrés de la planta. Por ello se presenta un incremento del tamaño del fruto en presencia del AS en comparación con el testigo.

Parámetros de calidad

El régimen de riego de 15 días con estrés moderado influyó positivamente con 21% más en °Brix con respecto a los frutos del riego regular (Figura 3), mientras que los °Brix en el régimen de 30 días fue similar al riego regular. Esto indica que se puede tener una producción de mejor calidad organoléptica con un estrés moderado (-10 bar) cada 15 días.

Figura 3: °Brix en frutos de fresa de acuerdo a los diferentes regímenes de riego: regular, 15 y 30 días con posterior estrés moderado (-10 bar). Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05).  

Figure 3: °Brix in strawberry fruits according to the different irrigation regimes: regular, 15 and 30 days with subsequent moderate stress (-10 bar). Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05). 

Al presentarse un estrés la planta genera osmoprotectores que mantienen un equilibrio en el potencial osmótico, permitiendo que el agua se mantenga en las estructuras celulares y no se pierda. Dichos compuestos son solutos compatibles como los azúcares (^{Florido-Bacallao y Bao, 2014}; ^{Tucuch-Haas et al., 2016}).

En otros cultivos como la caña de azúcar ^{Wahid (2007)} reportó que bajo un estrés por calor se presentó un incremento en la acumulación de azucares solubles y prolina de manera lineal. Lo anterior sugiere que el estrés hídrico causa el mismo efecto en el cultivo de fresa, aumentado el contenido de estos solutos compatibles ayudando a la retención de agua.

Con respecto a la capacidad antioxidante en el extracto de compuestos hidrofílicos, se presentó un incremento del 3.4% en el régimen de riego de 15 días en comparación con el testigo y el régimen de 30 días (Figura 4), mientras que estos dos últimos no fueron diferentes entre ellos.

Figura 4: Capacidad antioxidante en los diferentes riegos. Capacidad antioxidante promedio del fruto por el método del reactivo de DPPH (µM g^-1 PS) del factor riego: regular, 15 y 30 días con posterior estrés. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05). Figure 4: Antioxidant capacity in different irrigations. Average antioxidant capacity of the fruit by the DPPH reagent method (μM g^-1 PS) of the irrigation factor: regular, 15 and 30 days with subsequent stress. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05).  

En la respuesta contra el estrés, se generan metabolitos secundarios anti estresantes como el propio AS, por lo cual, el aumento de estos genera una actividad biológica potenciada en el parámetro evaluado. El AS por su naturaleza fenólica tiene la función de antioxidante dentro de la planta, sin embargo, no sólo realiza esa función, sino que a su vez modifica la síntesis y actividad de enzimas y otros compuestos antioxidantes regulando el balance redox (Ramírez-Zambrano, 2012⁴).

Los compuestos fenólicos proveen de actividad biológica al fruto, es decir, al aumentar estos compuestos se aumenta a su vez la capacidad antioxidante del fruto (^{Peñarrieta, Tejeda, Mollinedo, Vila y Bravo, 2014}). En el riego de 15 días con estrés, se presenta un incremento del 59% en la concentración de tales compuestos con respecto al riego regular. Sin embargo, para el riego de 30 días se presenta un decremento del 46% en este parámetro al comparar con el testigo (Figura 5a).

La aplicación de AS y Glu presentaron un incremento en la concentración de compuestos fenólicos con respecto al testigo de 67% y 36% respectivamente (P ≤ 0.05). Entre ambos tratamientos se presenta una diferencia estadística, con una relación Glu < AS. Por otro lado, la Cys fue estadísticamente igual al testigo y al Glu. Sin embargo, presentó un aumento del 22% (Figura 5b).

Figura 5: Compuestos fenólicos. (a) En los diferentes riegos. Compuestos fenólicos promedio de fruto por el método de Folin-Ciocalteu (mg L^-1) del factor riego: regular, 15 y 30 días con posterior estrés. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05); (b) Por tratamiento. Compuestos fenólicos promedio de fruto por el método de Folin-Ciocalteu del factor tratamientos: ácido salicílico, glutámico, cisteína y testigo. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05). Figure 5: Phenolic compounds. (a) In the different irrigations. Average phenolic compounds of fruit by the Folin-Ciocalteu method (mg L^-1) for the irrigation factor: regular, 15 and 30 days with subsequent stress. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05); (b) By treatment. Average phenolic compounds of fruit by the Folin-Ciocalteu method for factor treatments: salicylic acid, glutamic, cysteine and control. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05).  

La prolina es un indicador de estrés hídrico. Su acumulación en los tejidos se presenta cuando la planta percibe falta de agua, esto activa otros mecanismos para el uso eficiente de agua. Al restablecerse el riego, la prolina acumulada por la falta de agua, es utilizada por la planta como fuente de energía y material de reconstrucción para liberarse de los daños causados por el estrés (^{De la O-Quezada, Ojeda, Hernández, Sánchez y Martínez, 2011}). En la Figura 6 se observa que no se obtuvo una diferencia estadística entre los regímenes de riego de 15 y 30 días (P ≤ 0.05), lo cual indica que el nivel de estrés no aumentó considerablemente la prolina a pesar de someter a estrés moderado las plantas. Sin embargo, se observa una tendencia en las plantas que fueron sometidas al déficit hídrico (-10bar) después de 15 y 30 días de riego normal las cuales presentaron un menor grado de acumulación de prolina que aquellas que fueron regadas con normalidad, esto pudo haber sido ocasionado debido que las plantas no se sometieron a un estrés continuo. Estos resultados son análogos a los de Pagán-Rubio (2012⁵) donde se tuvo un riego similar al aplicado en este experimento, restituyendo el riego después de un estrés, y reportaron aumentos en el crecimiento de especies forestales evaluadas.

Figura 6: Prolina en los diferentes riegos. Prolina promedio de fruto por el método de ^{Bates, Waldren y Teare (1973)} (µg mL^-1) del factor riego: regular, 15 y 30 días con posterior estrés. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05). Figure 6: Proline in the different irrigations. Average fruit proline by the method of ^{Bates, Waldren y Teare (1973)} (μg mL^-1) for the irrigation factor: regular, 15 and 30 days with subsequent stress. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05).  

Uno de los principales antioxidantes presentes en la fresa es el ácido ascórbico o Vitamina C. Éste se encuentra relacionado con la acidez del fruto, ya que es uno de los ácidos de mayor concentración en estos, además de estar ligado con el ácido cítrico. Esta relación se debe a que el ácido ascórbico puede reducir el hierro ayudando a su absorción, sin embargo, a su vez requiere de la producción de ácido cítrico para ello (^{Smirnoff, 2018}).

La aplicación de AS fue el tratamiento que presentó variación con respecto al testigo, siendo superior un 32% (Figura 7), incrementando el valor nutracéutico de los frutos.

Figura 7: Concentración de vitamina C para los tratamientos. Concentración de vitamina C promedio de fruto por volumetría del factor tratamientos: ácido salicílico, glutámico, cisteína y testigo. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05). Figure 7: Vitamin C concentration for treatments. Average vitamin C concentration of fruit by volumetry method for the factor treatments: salicylic acid, glutamic, cysteine and control. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05).  

El incremento de la vitamina C con la aplicación del AS se debe a que existe una relación entre la concentración de la vitamina C que induce la activación de las señales del AS. Así, al desencadenarse las reacciones mediadas por el AS, la planta relaciona dicha acción con la baja concentración de ácido ascórbico, llevando a la producción y acumulación del mismo (^{Akram, Shafiq y Ashraf, 2017}).

La vitamina C es el antioxidante más abundante en plantas ya que se usa como cofactor de enzimas redox al donar sus electrones a los radicales libres, así (^{Gaucin-Delgado et al., 2022}) participa en la defensa contra estrés oxidativo biótico y abiótico al degradar H₂O₂ vía el ciclo glutatión-ascorbato (^{Akram et al., 2017}) favoreciendo el crecimiento de las plantas.

Además, ^{Gaucin-Delgado et al., (2022)} reportó que la vitamina C está presente en cloroplastos, vacuolas, citosol y espacio apoplástico, y lo cataloga como un precursor tanto de metabolitos secundarios como primarios ayudando a la defensa de la planta contra el estrés producido por exceso de energía.

Al estar presente en diferentes organelos y áreas de las células vegetales, Smirnoff (2021) reporta que la vitamina C influye directamente en la fotosíntesis lo que se refleja en frutos de mayor tamaño como se observa en este estudio donde las plantas tratadas con AS produjeron los frutos de mayor peso.

Finalmente, el parámetro de acidez se expresa en % equivalente a ácido cítrico, ya que es uno de los más abundantes en el fruto. Al igual que el ácido ascórbico, es un antioxidante natural con características nutracéuticas.

El tratamiento hídrico que favoreció al parámetro de acidez, en relación con el testigo, fue el de 15 días de riego regular + estrés, presentando un incremento del 250%. El riego de 30 días + estrés fue estadísticamente igual al testigo (Figura 8a). Así que el riego con mayor dulzor (ºBrix) fue el de 15 días.

Figura 8: Acidez titulable. (a) En diferentes riegos. Acidez total titulable promedio de fruto del factor riego: regular, 15 y 30 días con posterior estrés. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05); (b) Por tratamientos. Acidez titulable promedio de fruto del factor tratamientos: ácido salicílico, glutámico, cisteína y testigo. Letras diferentes simbolizan diferencia estadística (P ≤ 0.05). Figure 8: Titratable acidity. (a) At different irrigation. Average titratable total acidity of the fruit of the irrigation factor: regular, 15 and 30 days with subsequent stress. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05); (b) For treatments. Average titratable acidity of fruit of the factor treatments: salicylic acid, glutamic, cysteine and control. Different letters symbolize statistical difference (P ≤ 0.05).  

Por lo que toca a los bioestimulantes, la aplicación de AS fue superior 215% respecto al testigo, lo cual puede observarse con claridad en la Figura 8b. Respecto a los tratamientos, se comportaron de igual manera que el parámetro anterior, siendo sólo significativo el riego de 15 días.

^{Rodríguez-Larramendi, Santos y Infante (2008)} encontraron que, al aplicar concentraciones de ácido salicílico a semillas de tomate, los frutos obtenidos tenían un incremento tanto en peso fresco como en contenido de vitamina C y ácido cítrico. Así también al aplicar AS a frutos de frambuesa se incrementó la acidez de los frutos proporcionando un mejor balance en el sabor del mismo (^{Sigala-Aguilar et al., 2023}) ya que el sabor dulce-acido de los frutos es causado por el balance de la acidez originado por ácidos orgánicos (^{Pašalić, Todorović, Koleška, Bosančić y Đekić, 2016}) y por la concentración de azucares (^{Iglesias et al., 2015}).

Aunado a lo anterior, se tiene que el valor de acidez titulable de la fresa para considerarse de buena calidad debe ser menor del 0.7 % para mantener su sabor característico. Como se observa en los resultados en la Figura 8, a pesar de incrementar el ácido cítrico y ascórbico que dan calidad nutracéutica, la calidad del sabor no se ve afectada (^{Madrid y Beaudry, 2020}).

Disponibilidad de Datos

No aplicable.