Caracterización molecular de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis en bovinos y ovinos de Mexicali, Baja California, México

Molecular characterization of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from sheep and cattle in Mexicali, Baja California, Mexico

Magnolia Correa Muñoz^a, Gerardo Medina Basulto^a, Tomas Rentería Evangelista³, Francisco Monge Navarro^a, Víctor González Vizcarra^a, Gilberto López Valencia^a

^a Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, Autónoma de Baja California México. Carretera Mexicali-San Felipe Km. 3.5 S/N Fracc. Laguna Campestre 21386. Mexicali, Baja California, México. Tel/Fax: (686)5.63.69.06. gilbertolopez@uabc.edu.mx. Correspondencia al último autor.

Recibido el 20 de septiembre de 2012.
Aceptado el 8 de febrero de 2013.

Resumen

Este es el primer reporte sobre aislamiento y tipificación molecular de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map) en ganado bovino y ovino en Mexicali-Baja California; región con antecedentes serológicos de paratuberculosis en pequeños rumiantes. Se analizaron cinco muestras de ovinos y uno de bovino provenientes de animales que presentaban signos compatibles con paratuberculosis. Los resultados de serología mostraron reacción positiva al ELISA con una razón S/P (densidad óptica (DO) del suero problema sobre la DO del suero testigo positivo), superior al 70 % en tres de las muestras de ovinos y la de bovino. Mediante el cultivo bacteriológico se obtuvieron tres aislamientos, dos de origen ovino y uno de origen bovino, los cuales fueron identificados como Map según la PCR IS900 y f57 y tipificados como Tipo C de Map, mediante el ensayo de PCR IS 1311 y análisis de endonucleasas de restricción (IS1311 PCR-REA). Los datos obtenidos en este estudio confirman la presencia de Map en la región, y contribuyen al conocimiento de su distribución en el país, así como también confirman la presencia del tipo C de Map en el ganado bovino y ovino; sin embargo se requiere de más estudios que incluyan una mayor cantidad de animales, así como la inclusión de técnicas que permitan la subtipificación de Map, para conocer acerca de la biodiversidad de esta micobacteria en Baja California.

Palabras clave: Mycobacterium avium, Subspecie paratuberculosis, Aislamientos, Cepas tipo C.

Abstract

The present study is the first report of the isolation and molecular typing of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) in cattle and sheep in Mexicali-Baja California; region with serological history of paratuberculosis in small ruminants. In this study, 5 blood samples of sheep and 1 from cattle showing signs sugestive of paratuberculosis were analyzed; serology results showed positive reaction to the Map ELISA with a reason s/p greater than 70 % for all samples. Fecal culture was also performed, three isolates were obtained , two from sheep and one from cattle, all were identified as Map according to the PCR IS900 and f57 and typified as type C on Map, by testing PCR IS1311 and analysis of endonucleases of restriction (IS1311 PCR-REA). The data obtained in this study confirmed the presence of Map in this region and contribute to the knowledge of its distribution within the country; in addition, confirms the presence of Map type C in cattle and sheep. More studies involving a larger number of animals, as well as the inclusion of techniques that allow for the subtyping of Map are require to learn about the biodiversity of this Mycobacterium in Baja California.

Mycobacterium avium subspecie paratuberculosis (Map) es el agente etiológico de la enfermedad de Johne o paratuberculosis (Ptb), la cual ocasiona una enteritis granulomatosa crónica que causa pérdidas económicas a la industria pecuaria⁽¹⁾. Fenotípicamente los aislamientos de Map se distinguen por la lentitud en su crecimiento, la dependencia a la micobactina⁽²⁾ y por la pigmentación que es típica sólo de algunos aislamientos de origen ovino⁽³⁾. Para la identificación de Map a nivel genotípico se utiliza la secuencia de inserción IS900 (IS900)⁽⁴⁾, la cual junto con el resultado positivo de otros blancos específicos de Map como f57⁽⁵⁾, confirman su presencia en un aislamiento. Por otro lado, las diferencias genotípicas encontradas en las cepas de Map, han sido utilizadas para caracterizarlas en dos grandes grupos: Tipo bovino o Tipo "C" del inglés cattle y Tipo ovino o Tipo "S", del inglés sheep⁽⁶⁾. Aunque la técnica más utilizada para la tipificación de Map ha sido el ensayo de los Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, basado en IS900 (IS900-RFLP)⁽⁷⁾. Otras técnicas como la PCR y el análisis de enzimas de restricción basado en los polimorfismos de la secuencia de inserción 1311 (IS1311 PCR-REA)^(8,9), proporciona un método fácil y rápido para distinguir entre los dos grandes grupos de las cepas de Map.

En México, existen pocos estudios moleculares de identificación y tipificación de Map; la primera identificación molecular se realizó en caprinos, por medio del ensayo IS900-RFLP en el Valle de México⁽¹⁰⁾. Este estudio reveló la presencia de Map del Tipo C1, uno de los tipos más diseminados a nivel mundial entre las diferentes especies de animales⁽⁷⁾. Investigaciones posteriores realizadas en muestras de leche de ganado caprino y bovino en la zona central de México, encontraron que además del Tipo C otros tipos de Map como el I y el S también estaban presentes en estas especies⁽¹¹⁾.

La Ptb también ha sido detectada en otras regiones del país como: San Luis Potosí, Guanajuato, Querétaro, Distrito Federal, Estado de México, Veracruz y Jalisco; en donde por medio de metodologías como cultivo bacteriológico, PCR IS900 y PCR IS900 anidada, se identificó Map en muestras de ovinos y caprinos^(12,13). Aunque en estos estudios no se realizó la tipificación de Map, sus resultados indican que la Ptb en México está afectando a rumiantes de diferentes especies. De igual manera, otro reporte documenta la presencia de la Ptb en ganado bovino, ovino y caprino en 16 estados del país⁽¹⁴⁾, indicando la amplia distribución de la enfermedad en el territorio nacional. En Baja California, estado fronterizo con los Estados Unidos no se cuenta con estudios previos sobre aislamientos y caracterización molecular de Map.

El objetivo del presente estudio fue evidenciar la presencia de Map en ganado bovino y ovino en el Municipio de Mexicali, Baja California y realizar la caracterización molecular de las cepas encontradas. Se muestrearon cinco ovejas de 2 años de edad, con crías en lactancia y con signos compatibles con la Ptb de un rebaño dedicado a la venta de pie de cría ubicado al noroeste de la ciudad de Mexicali, Baja California. El mencionado rebaño históricamente ha mostrado animales con signos compatibles con la Ptb desde el 2009. El estudio también incluyó una muestra de una vaca Holstein, gestante, de 3 años de edad, y que también presentaba signos compatibles con la Ptb. Esta última muestra se tomó de un hato dedicado a la venta de pie de cría de bovinos ubicado al oriente de la ciudad de Mexicali, Baja California.

A todos los animales se les tomaron muestras de sangre completa por punción yugular y excremento directamente del ámpula rectal, empleando guantes estériles. Las muestras fueron almacenadas a -70 °C, hasta su procesamiento. Las muestras de suero obtenidas se probaron por medio del kit comercial Pourquier®ELISA Paratuberculosis Antiboy Screening (Institut Pourquier, Francia). Para el desarrollo de la prueba y la interpretación de los resultados, se siguieron las instrucciones del fabricante. Los puntos de corte para cada muestra se calcularon con base en la razón de la densidad óptica (DO) del suero problema sobre la DO del suero testigo positivo, y se expresa como S/P. Una muestra con una razón S/P igual o menor al 60 % se consideró negativa, entre el 60 y 70 % dudosa y mayor al 70 % positiva. La muestra obtenida del bovino se procesó de forma individual mientras que las muestras provenientes de los ovinos se procesaron en dos grupos: el grupo 1 contenía excremento de los ovinos 1 y 2, los cuales presentaban emaciación severa: el grupo 2 contenía excremento de los ovinos 3, 4 y 5, los cuales al momento de la toma de las muestras presentaban caquexia (Cuadro 1). Para cada grupo se pesaron 2 g de excremento individualmente, se homogenizaron y de ahí se tomaron 2 g para la realización del cultivo bacteriológico, según la metodología descrita por Harris et al⁽¹⁵⁾; con una modificación relacionada con la concentración del antibiótico, el cual se utilizó en una dilución de 1:2. Las muestras procesadas se sembraron por duplicado en los medios de cultivo Middlebrook 7H11 (M7H11) suplementado con yema de huevo, Lowenstein-Jensen (LJ) y Middlebrook 7H9 (M7H9); con y sin suplemento de 2 ug/ml de micobactina (Institut Pourquier). Los inóculos se incubaron a 37 °C y su crecimiento se verificó cada semana hasta la observación de colonias. Después del crecimiento primario, se aisló una colonia que se diluyó en 150 μl de agua destilada estéril y fue sometida a ciclos seriados de enfriamiento y calentamiento para la obtención de un lisado, del cual se utilizaron 5 μl para las reacciones de amplificación⁽¹⁶⁾.

La identificación de Map se realizó empleando los marcadores moleculares IS900 y f57 y la tipificación por medio del análisis IS1311 PCR-REA. Todas las reacciones de PCR se hicieron a un volumen final de 50 ul utilizando como testigo positivo la cepa referencia de Map ATCC19698 y como testigo negativo agua grado biología molecular (SIGMA). Las mezclas de PCR se amplificaron en un termociclador iCycler (BioRad). Los productos se visualizaron en geles de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 μg/ml. Para la PCR IS900 se utilizaron los iniciadores MP10-1 (5'- ATGCGCCACGACTTGCAGCCT-3') y MP11.1 (5'-GGCACGGCTCTTGTTGTAGTCG-3'); descritos por Kawaji et al⁽¹⁷⁾ que amplifican un fragmento de 183 pb. La mezcla consistió de: 1U de Taq polimerasa, 20 mM Tris-HCl, 50 mM de KCl, 2.5 mM de MgCl₂, 2.5 mM de una mezcla de dNTP's y 20 pmol de cada iniciador. Las condiciones de amplificación fueron las descritas por el autor⁽¹⁷⁾. Se llevó a cabo también un PCR para f57, para el cual se utilizaron los iniciadores F57 (5'-CCTGTCTAATTCGATCACGGACTAGA-3') y R57 (5'- TCAGCTATTGGTGT ACCGAATGT-3'); descritos por Vansnick et al⁽⁵⁾ que amplifican un fragmento de 432 pb. La mezcla consistió de: 1 U de Taq polimerasa, 20 mM Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1.6 mM de MgCl₂, 2.0 mM de una mezcla de dNTP's y 20 pmol de cada iniciador. Las condiciones de la amplificación fueron las descritas por el autor⁽⁵⁾. La tipificación de los aislados se llevó a cabo por medio de un PCR IS1311, para el cual se utilizaron los iniciadores M56 (5'-GCGTGAGGC TCTGTGGTG AA-3') y M119 (5'-ATGACGACCGCTTGGGAGAC-3'); descritos por Marsh et al⁽⁹⁾ que amplifican un fragmento de 608 pb. La mezcla consistió de: 2 U de Taq polimerasa, 20 mM Tris-HCl, 50 mM de KCl, 2.5 mM de MgCl₂, 2.0 mM de una mezcla de dNTP's y 0.8 uM de cada iniciador. Las condiciones de la amplificación fueron las indicadas por el autor⁽⁹⁾. El análisis de restricción enzimática se realizó en un volumen final de 30 μl, el cual consistió de 1 μl de la enzima Hinf I, 2.0 μl del buffer FastDigest®10X (Fermentas), 10 ul del amplificado IS1311 y agua destilada estéril. La digestión se realizó por 1 h a 37 °C y los fragmentos se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 3.5 % y tinción con bromuro de etidio.

La interpretación de los resultados se realizó según lo reportado por Marsh⁽⁹⁾, donde un aislado es clasificado como perteneciente al Tipo C, si presenta un patrón de digestión correspondiente a los fragmentos de 67, 218, 285 y 323 pb. Las cepas del tipo S son definidas por las bandas de 285 y 323 pb.

Los seis animales analizados en este estudio presentaban síntomas compatibles con la Ptb al momento de la toma de las muestras (Cuadro 1). El análisis por ELISA mostró que los ovinos 1, 2 y 4 así como el bovino, resultaron positivos con una razón S/P superior al 70 %. Los ovinos 3 y 5 fueron negativos al ELISA al mostrar una razón S/P menor al 70 %. El cultivo primario obtenido a partir del grupo 1, no creció en ninguno de los medios sólidos utilizados. Debido a lo anterior, se procedió a la identificación de Map por PCR a partir del cultivo líquido M7H9 suplementado con micobactina. Una vez confirmada la presencia de Map por PCR, se inoculó una placa de petri con medio Middlebrook 7H10 (M7H10) con y sin suplemento de micobactina, observándose un escaso crecimiento de colonias (ocho colonias) solamente en el medio que contenía micobactina, después de cinco semanas de incubación. Las colonias en este medio presentaron morfologías hemisféricas, lisas y opacas. El aislamiento obtenido a partir del grupo 2 creció únicamente en el medio M7H11 suplementado con micobactina; el tiempo de crecimiento fue de seis semanas, el número de colonias bacterianas aisladas fue escaso (12 colonias) de color semejante al medio de cultivo y con morfología similar a las observadas en el grupo 1. El aislamiento de la muestra de origen bovino, se obtuvo sólo en el medio LJ suplementado con micobactina, después de seis semanas de cultivo; sin embargo a diferencia de los aislados de origen ovino, estas colonias se observaron translúcidas, brillantes, muy pequeñas, hemisféricas, abundantes y distribuidas en toda la superficie del medio.

Los resultados aquí mostrados son el primer reporte de aislamientos y tipificación de Map en el Municipio de Mexicali Baja California, región en donde se ha encontrado una seroprevalencia del 7.8 % en ganado ovino y del 2.5 % en ganado caprino⁽¹⁸⁾. Los animales muestreados en este estudio pertenecían a distintos ranchos, los cuales presentaban factores de riesgo para la infección por Map tales como ser hatos abiertos, tener antecedentes de animales con signos compatibles con la Ptb, malas condiciones de higiene en los corrales y la convivencia de animales enfermos con sanos dentro del mismo corral. Adicionalmente, estos animales eran hembras en las cuales estaba comprometido su estado hormonal debido a que se encontraban en estado de gestación o tenían crías en lactancia. Dichas condiciones de estrés, han sido reportadas como favorables para la aparición de los signos clínicos de la Ptb, los cuales en bovinos suelen presentarse a los 2 años mientras que para pequeños rumiantes estos síntomas pueden aparecer antes de esta edad^(19,20).

El análisis serológico, mostró resultados positivos para las muestras del bovino y tres de los cinco ovinos, con razones S/P superiores al 70 %. Los animales que presentaron los títulos más altos de anticuerpos se encontraban en avanzado estado de la enfermedad. Los ovinos que resultaron negativos al ELISA, no presentaban emaciación ni la presencia de excremento pastoso observado en los otros animales; es posible que estos animales no se encontraran infectados por Map y la caquexia observada pudo haber sido ocasionada por causas no determinadas; sin embargo se debe tener en cuenta la baja sensibilidad del ELISA cuando se prueban muestras de animales que están en estadio subclínico de la enfermedad, así como también la variabilidad del huésped relacionada con la producción de anticuerpos y proteínas enteropáticas en respuesta a la infección por Map^(21,22).

Los cultivos bacteriológicos de origen ovino presentaron mayores dificultades para lograr el aislamiento comparado con el cultivo de origen bovino. Inicialmente, no se logró obtener crecimiento alguno en los cultivos de muestras individuales de excremento ovinas. La dificultad en aislar Map a partir de excremento ovino ha sido reportada por otros estudios^(23,24), donde factores tales como bajas concentraciones de micobacterias excretadas, la presencia de acúmulos densos de excremento⁽²³⁾ o la inactivación de Map, durante el proceso de descontaminación, pueden interferir con la obtención del aislamiento. En la búsqueda de condiciones que favorecieran el crecimiento bacteriano, se redujo en un 50 % la concentración del antibiótico aplicado a las muestras durante el procesamiento de las mismas y se tomó la mayor cantidad posible de materia fecal por lo cual se conformaron grupos. Es posible que estas modificaciones pudieran haber influido positivamente en la obtención de los aislamientos de Map de origen ovino^(25,26).

Con respecto a los cultivos primarios de Map, se observó que los tres aislamientos presentaron dependencia a la micobactina. El aislamiento primario obtenido en el grupo 1 se logró solo en el medio de cultivo líquido M7H9. Este tipo de medio ha sido recomendado particularmente para muestras de origen ovino debido a que producen crecimiento más rápido con una mejor sensibilidad analítica y diagnóstica, comparado con los resultados obtenidos en medio sólido^(24,27,28). Después de identificar Map por PCR en el medio de cultivo líquido, realizamos una resiembra en medio 7H10, observándose crecimiento de colonias solamente en el medio suplementado con micobactina, comprobándose así la dependencia a dicho sideróforo.

El aislamiento primario obtenido a partir del grupo 2, se logró solamente en el medio de cultivo M7H11 y el aislamiento de origen bovino, en el medio LJ. En ambos casos, se detectó crecimiento de colonias a las seis semanas de incubación. Los medios de cultivo de donde se aislaron y el tiempo de crecimiento, son característicos de las cepas del tipo C de Map; comprobándose el hecho de que el tiempo de crecimiento de una cepa de Map, se correlaciona con el tipo de cepa, mas no con el origen del huésped⁽²⁹⁾. Igualmente la morfología de las colonias observadas en el medio de cultivo en donde creció cada aislamiento, coinciden con las descripciones reportadas por otros estudios⁽²⁹⁾. La utilización de medios sólidos y líquidos, nos permitió aumentar la posibilidad de obtener cultivos primarios, lo cual concuerda con lo reportado anteriormente por Whinttington et al⁽³⁰⁾, quienes propusieron que para asegurar el éxito de los cultivos de Map se deben incluir varios tipos de medios de cultivo, ya que de lo contrario se estaría afectando la sensibilidad diagnóstica de los mismos.

La identificación de Map, realizada mediante la PCR IS900 y f57, fue necesaria para confirmar la presencia de MAP, ya que se pueden encontrar elementos similares a IS900 (IS900-like) en otras micobacterias⁽³¹⁾, lo cual podría conducir a la obtención de resultados falsos positivos⁽⁵⁾. De igual manera, el análisis de tipificación realizado mediante el ensayo IS1311 PCR-REA, permitió clasificar a los tres aislamientos como tipo C de Map; cepa que ha mostrado tener un amplio rango de huéspedes. En distintos estudios de tipificación molecular de Map realizados en otras regiones de México, también se ha encontrado este tipo de cepa en ganado caprino y bovino^(10,11). En estos estudios se utilizaron metodologías de tipificación diferentes a la empleada en este trabajo, como IS900-RFLP y PCR tipo específico. El ensayo IS1311 PCR-REA permite también tipificar a las cepas de Map. La amplificación de un fragmento de 608 pb de IS1311 combinado con el análisis de restricción enzimática con Hinfl, pone de manifiesto la mutación presente en el nucleótido 223 (C/T), presente en algunas copias de IS1311 en cepas del tipo C y ausente en las del tipo S^(8,9). Aunque los tipos C y S obtenidos mediante esta técnica corresponden con los descritos por IS900-RFLP⁽⁸⁾, IS1311 PCR-REA no permite subtipificar a las cepas de Map. La subtipificación de Map, es importante ya que nos permite el rastreo del origen de un brote y su diseminación, así como otras inferencias epidemiológicas⁽⁶⁾.

Se envió DNA de los aislados al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) en Argentina, quienes, según la metodología reportada por Thibault et al⁽³²⁾ llevaron a cabo un ensayo de unidades repetitivas intercaladas micobacterianas - repeticiones en tándem de número variable (MIRU-VNTR). Como resultado se obtuvo un patrón INMV2 solamente para el aislamiento de origen bovino, mientras que para los dos aislamientos de origen ovino los resultados no fueron concluyentes, ya que solamente en uno de ellos se pudieron amplificar algunos de los locus que contempla la prueba de tipificación (A.K. Gioffré, comunicación personal). En México, no se conocen estudios de genotipificación de Map por medio de esta técnica; sin embargo distintos reportes muestran que es uno de los patrones predominantes que circulan en varios países de Europa y también en Argentina^(32,33). Por lo tanto este resultado indicaría que al menos, uno de los genotipos más frecuentes está presente en el país.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Dra. Andrea Gioffré del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Buenos Aires Argentina, por la realización del análisis MIRU-VNTR. Durante el desarrollo de este estudio, el primer autor fue estudiante de doctorado con beca CONACYT, correspondiente a la Convocatoria enero-junio 2009.

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