Distinción de especies del género Persea mediante RAPD e ISSR de ADN¹*

Distinction of species of the genus Persea by RAPD and ISSR DNA markers¹

Juan Carlos Reyes-Alemán¹, Ernestina Valadez-Moctezuma², Lisandro Simuta-Velázco³, Alejandro Facundo Barrientos-Priego^2§ y Clemente Gallegos-Vázquez⁴

¹ Fundación Salvador Sánchez Colín CICTAMEX S. C. Ignacio Zaragoza No. 6 Coatepec Harinas, México. C. P. 1700. (reyesaleman@hotmail.com).

³ Facultad de Agrobiología "Presidente Juárez". Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Av. Revolución esq. Berlín. Uruapan, Michoacán, México. (subgenpersea@gmail.com).

⁴ Centro Regional Universitario Centro Norte, Universidad Autónoma Chapingo, México. A. P. 196. Zacatecas, Zacatecas. C. P. 98001. México. (clemgava5@hotmail.com).

*Recibido: octubre de 2012
Aceptado: marzo de 2013

Resumen

Con la finalidad de establecer bases para diferenciar parte de la diversidad genética de Persea y en especial del subgénero Persea resguardado en la colección nacional de germoplasma de aguacate de México, se estudiaron ocho especies (P. americana, P. steyermarkii, P. schiedeana, P. lingue, P. nubigena, P. floccosa, P. cinerascens y P. indica) con marcadores moleculares mediante las técnicas de RAPD e ISSR, donde los productos de PCR fueron separados en geles de acrilamida. Las huellas de ADN se analizaron con métodos estadísticos multivariadas y de remuestreo para conocer su relación genómica. Se detectaron fragmentos polimorfismos de ADN útiles para la distinción inter e intraespecífica de las ocho especies del género Persea en estudio. Los análisis estadísticos de las huellas de ADN mediante RAPD a diferencia de ISSR, agruparon de forma congruente a las diferentes especies de acuerdo a la taxonomía actual. De acuerdo al presente estudio, P. indica y P. lingue mantienen poca relación genómica con el resto de las especies estudiadas por pertenecen al subgénero Eriodaphne. Por otra parte los resultados permitieron diferenciar genotipos de las diferentes especies del subgénero Persea incluyendo a P. americana y un híbrido interespecífico incluido en el estudio.

Palabras clave: germoplasma, marcadores moleculares, recursos fitogenéticos.

Abstract

With the aim of establishing a basis to differentiate part of the Persea genetic diversity, specially of the subgenus Persea maintained in the National Avocado Germplasm Repository of Mexico, eight species were studied (P. americana, P. steyermarkii, P. schiedeana, P. lingue, P. nubigena, P. floccosa, P. cinerascens y P. indica) with molecular markers by means of RAPD and ISSR techniques, where the PCR products were separated in acrylamide gels. The DNA fingerprinting was analyzed with multivariate statistical methods and bootstrapping to establish their genomic relationships. Useful DNA polymorphic fragments were found for the inter and intra-specific distinction of the eight species of Persea considered in the study. The statistical analysis of the DNA fingerprints by means of RAPD grouped the different species congruently with the actual taxonomic classification, compared with ISSR. According to the present study, P. indica y P. lingue show less genomic relationship with the rest of the species studied, and this is accordance to the fact that they correspond to the subgenus Eriodaphne. The results permitted to differentiate genotypes of the different species of the subgenus Persea that includes P. americana and an inter-specific hybrid included in the study.

Key words: Lauraceae, avocado, germplasm, molecular markers, plant genetic resources.

Introducción

México cuenta con amplia variabilidad en aguacate y existen en el al menos 20 diferentes especies relacionadas con el aguacate (Barrientos et al., 2007). El género Persea que pertenece a la familia Lauraceae es considerado como uno de los más difíciles de abordar taxonómicamente (Kopp, 1966). Hace unos años se publicó que el subgénero Persea sólo está formado por P. americana y P. schiedeana, dejando fuera a P. nubigena, P. steyermarkii, P. parvifolia, P. tolimanensis, P. floccosa, y P. zentmyerii, y se indicó que la variabilidad en aguacate se debe a los procesos de selección y cultivo que el hombre ha hecho a través del tiempo (Van der Werff, 2002).

Mediante RFLP se pudo separar P. nubigena y P. steyermarkii y a P. floccosa de P. americana (Furnier et al., 1990); sin embargo, indicó que pueden ser solo variantes de P. americana. Recientemente se planteó que los subgéneros Persea y Eriodhapne se consideren como géneros, basado en un análisis de parsimonia algorítmica (Campos et al., 2006), donde también reconoce a la mayoría de las especies del subgénero Persea.

Las dificultades en la clasificación de las razas de aguacate, junto con la influencia del hombre, es el hecho de que su progenie es extremadamente variable (Gama, 1994), por lo que las herramientas como los marcadores moleculares podría tener una aplicación directa para resolver la ubicación taxonómica dentro del complejo Persea, existen ya antecedentes en aguacate con RFLP (Davies et al., 1998), con SSR (Mhameed et al., 1997), con RAPD (Fiedler et al., 1998), con AFLP (Chao et al., 2003) y con microsatélites (Ashworth y Clegg, 2003).

Si se dan las condiciones estandarizadas y estrictas a lo ensayos con marcadores basados en RAPD, se pueden realizar pruebas rápidas y de menor demanda técnica, comparados con minisatélites y microsatélites (Fiedler et al., 1998). Asimismo, estos mismos autores indicaron que los RAPD pueden ayudar a elucidar la variación genética de todo el subgénero Persea, ya que se demostró la detección de fragmentos monomórficos específicos para cada raza de P. americana, lo cual no se ha encontrado con microsatélites (Schnell et al., 2003).

Materiales y métodos

En el presente estudio se realizó durante 2008, un total de 14 genotipos de Persea fueron evaluados, provenientes del banco de germoplasma de la Fundación Salvador Sánchez Colín CICTAMEX, S.C. localizado en Coatepec Harinas, Estado de México, México. Correspondiendo a ocho especies del género Persea: P. americana, P. steyermarkii, P. schiedeana, P. lingue, P. nubigena, P. floccosa, P. cinerascens, P. indica, posible híbrido P. nubigena x P. americana y un híbrido P. schiedeana x P. americana var. guatemalensis (Cuadro 1).

Extracción de ADN

Basándose en el método del CTAB ("cetyltrimethylammonium bromide") conforme en los protocolos ya establecidos (Saghai-Maroof et al., 1984), con leves modificaciones, se realizó la extracción de ADN de hojas frescas de aguacate de los genotipos correspondientes. Posteriormente el ADN obtenido se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Condiciones de PCR

Mediante la técnica de la reacción de polimerización en cadena (PCR) se sintetizaron in vitro fragmentos específicos de ADN con la finalidad de detectar mediante el uso del termociclador secuencias específicas en el genoma de hojas de aguacate. Se usó para RAPD e ISSR un equipo Gene Amp PCR System 2700. Para RAPD el programa de termociclaje comprendió un ciclo inicial de desnaturalización de 1'00'' a 94 °C, 35 ciclos comprendiendo la desnaturalización, alineamiento y extensión de 0'30'' a 94 °C, 0'30'' a 40 °C y 1'30'' a 72 °C, respectivamente, y al final 1 ciclo de extensión de 2'30'' a 72 °C. Para ISSR se utilizó un ciclo inicial de desnaturalización de 1'00'' a 94 °C, 38 ciclos comprendiendo desnaturalización, alineamiento y extensión de 0'30'' a 94 °C, 0'30'' a 48 °C y 2'00'' a 72 °C, respectivamente, y al final 1 ciclo de extensión de 2'30'' a 72 °C.

Los componentes de reacción para el análisis tipo RAPD se colocaron en tubos de 500 µl conteniendo cada uno 25 µl de los siguientes componentes; 5 µl de ADN (20 ng µl^-1), 0.3 µl enzima Taq polimerasa (5 U µl^-1), 10 ml DNTPs (500 µM), 2.5 µl amortiguador Taq (1x), 2 µl de MgCl₂ (25 mM), 2 µl de Primer y 3.2 µl de agua.

Los componentes de reacción para el análisis tipo ISSR fueron los mismos que se utilizaron para RAPD solo que en este caso se utilizaron; 2.5 µl de ADN [20 ng µl^-1] y 3 µl de MgCl₂ [25 mM].

Elaboración de geles

Los productos amplificados de PCR se separaron mediante electroforesis con una cámara en sistema vertical mediante geles de poliacrilamida 8%. Para el corrimiento de las muestras se utilizaron 2.5 µl de la mezcla del producto de la reacción de PCR agregando 1 µl de buffer de carga "blue orange" y se utilizó un marcador estándar de 1 Kb. Los geles se corrieron a 280 volts por 2.5 h en amortiguador TBE 1X y se tiñeron con AgNO₃ 0.2% de acuerdo al protocolo convencional. Para la documentación de las huellas de ADN se utilizó el sistema Digital Science 1D V.2.0.3.

Análisis estadístico

Mediante los perfiles de bandas obtenidos en los geles se elaboró una matriz básica de datos correspondiente a cada iniciador utilizado, donde la presencia y ausencia de bandas fue registrado, asignando 1 y 0, respectivamente.

Para el análisis de los datos obtenidos y agrupados en cada matriz, respectiva, se utilizó el criterio de distancias de similitud mediante el índice Jaccard (Jaccard, 1908) y para el agrupamiento se utilizó el método Neighbor-Joining recomendado para generar grupos por similitud (Saitou y Nei 1987), este método ha sido utilizado con RAPD en germoplasma de cacao (Whitkus et al., 1999) y RAPD para germoplasma de yuca (Manihot esculenta Crantz) donde se comprobó que el mejor método de agrupamiento fue Neighbor-Joining con valores del índice de Jaccard (Demey et al., 2003). Para elaborar el árbol se utilizó el programa FreeTree v. 0.9.1.50 (Pavlícek et al. 1999), y se realizó un remuestreo ("bootstrapp") de 1000 repeticiones, obteniendo el árbol consenso con las frecuencias de cada uno de los agrupamientos (Hampl et al. 2001), para visualizar el árbol obtenido se utilizó el programa Tree View v. 1.6.6 (Page, 1996).

Resultados y discusión

Cada iniciador derivó diversos fragmentos de ADN que sirvieron para generar las dos matrices, tanto con RAPD e ISSR (Figuras 1 y 2).

Dichos fragmentos fueron más abundantes en la mayoría de los iniciadores RAPD (Cuadro 2), mientras que en los ISSR fueron menos abundantes (Cuadro 3); donde todos los iniciadores mostraron 80% o más fragmentos polimórficos.

El patrón de bandeo en general defirió marcadamente entre individuos, donde se detectaron bandas únicas para cada uno de los individuos variando en su número con RAPD (Cuadro 4); sin embargo, para ISSR solo se encontraron fragmentos únicos para algunos individuos. Los patrones de las bandas detectadas para todos los iniciadores fueron altamente informativos y distintivos para cada uno de los individuos.

La matriz de datos para RAPD contó con 3 808 caracteres de todos los 14 individuos, mientras que para ISSR la matriz se constituyó de 1 470 caracteres. Dichas matrices fueron utilizadas para derivar árboles filogenéticos (filogramas) para RAPD e ISSR.

Todos los individuos se pudieron diferencias y no existieron redundancias. La distancia genética más lejana para el caso de RAPD fue de 0.875 entre P. schiedeana y P. indica, y la con mayor cercanía fue entre P. nubigena y para el posible híbrido P. nubigena x P. americana con 0.511. Para ISSR la distancia genética más lejana fue de 0.903 entre P. gigantea y P. nubigena, mientras que la menor distancia fue para el híbrido P. nubigena x P. americana y P. americana var. drymifolia ("Tochimilco") con una 0.604.

Mediante RAPD los individuos formaron una marcada separación inicial que fue entre P. indica y el resto de los individuos, lo cual fue soportado por un alto valor de remuestreo (100%). La siguiente bifurcación fue de P. lingue con el restante de los individuos (Figura 3). La tercera bifurcación formó dos grupos que incluyeron a todo el subgénero Persea, con la excepción de P. cinerascens.

En el caso de RAPD la formación de un árbol filogenético resultó en separación y agrupación general conforme a la taxonomía indicada para el subgénero Persea (Williams, 1977) y parcial con la de todo el género Persea (Kopp, 1966). Donde fue marcada la separación de P. indica, especie de las Islas Canarias, España (Kopp, 1966) y que hasta hace unos años era la única Persea fuera de las Américas; sin embargo, se ha indicado la existencia de especies del género Persea en Asia designados dentro del subgénero Machilus (Chanderbali et al., 2001). La separación clara de P. indica fue seguida por la de P. lingue, especie proveniente de Chile, por lo que la separación de estas dos primeras ramas del árbol incluyó a las dos especies del subgénero Eriodaphne del presente estudio, lo cual coincidió en otro estudio donde se dio la separación del subgénero Persea de Eriodaphne con secuencias ITS (Chanderbali et al., 2001); sin embargo, en otro trabajo donde se consideró a 10 especies, tanto del subgénero Persea (seis) y Eriodaphne (cuatro), así como las tres razas de aguacate, no se pudo separar los dos subgéneros con marcadores SSR (Mhameed et al., 1997), pero si a P. americana del resto de las especies, y además dentro de P. americana se tuvo clara separación entre las razas.

En el presente estudio tres individuos de Persea americana se agruparon y se pudieron separar, con excepción de "Tochimilco" que se agrupó con Persea floccosa, especie que se piensa es ancestro de Persea americana var. drymifolia (Scora y Bergh, 1990).

La inclusión de P. cinerascens que es del subgénero Eriodaphne contrasta al agruparse con P. schiedeana y el híbrido interespecífico P. schiedeana x P. americana var. guatemalensis, P. schiedeana es la especie más distintiva del subgénero Persea y se ha encontrado que es altamente variable, donde probablemente existen razas dentro de P. schiedaena (Barrientos et al., 1992) y por las evidencias encontradas con marcadores SSR donde se encontró alta variación en tres fuentes de P. schiedeana (Mhameed et al., 1997). P. cinerascens tiene características intermedias entre los subgéneros Persea y Eriodaphne al igual que P. pallida y P. rigens (Kopp, 1966), como es la pubescencia en el pistilo que es característico del subgénero Persea y donde las especies del subgénero Eriodaphne no tienen pubescencia, de hecho se ha reportado la posible existencia de híbridos interespecíficos entre P. cinerascens y P. americana (García, 1973), por lo que es posible que comparta algunas características genéticas con P. schiedeana, ya que con los marcadores ISSR también se encontró una alta afinidad.

La separación de los individuos de acuerdo a la taxonomía clásica del aguacate, hasta el nivel de razas, ya había sido indicada con anterioridad, donde se pudieron separar con RAPD las tres razas (Fiedler et al. 1998) y la nueva posible raza Costaricensis (Ben-Ya'acov et al., 1995), además que las mismas presentaron una distancia genética equidistantes, tal como ya lo había indicado anteriormente Bergh (1975) y de igual forma también con AFLP (Chao, 2003).

Es probable que esta separación conforme a la taxonomía se deba a que los marcadores moleculares de ADN genómico con base a RAPD usan iniciadores arbitrarios de oligonucleótidos de 10 bases y que toman al azar secuencias a lo largo de todo el genoma o sea muestreos al azar del mismo (Williams, 1990), lo cual no es el caso de otros marcadores moleculares de la categoría de anclados como los SSR (Zietkiewicz et al., 1994), permitiendo a RAPD mostrar un aspecto general de similitudes.

En comparación con aloenzimas y microsatélites, existen algunas limitaciones y defectos de los RAPD, tales como marcadores de alelos dominantes y algunas veces baja reproductividad, lo cual pudo haber desalentado a muchos investigadores del uso de RAPD; sin embargo, sus ventajas pesan más que sus desventajas además de que se ha probado que al tener un buen control del perfil de temperatura en los tubos los fragmentos de RAPD son reproducibles (Penner et al., 1993).

En el caso de ISSR los genotipos formaron una marcada separación inicial que fue entre P. floccosa y el resto de los individuos (Figura 4), lo cual estuvo sustentado por un alto valor de remuestreo (100%). La siguiente bifurcación fue de un grupo que abarcó dos individuos de P. americana var. drymifolia (raza Mexicana) y en otro grupo el restante de los individuos, incluyendo a los dos subgéneros.

La separación con ISSR no fue como en RAPD, ya que no concordó con la taxonomía clásica de Persea. Sin embargo, si permitió diferenciar todos los genotipos. Los marcadores ISSR se piensa que son particularmente útiles para el estudio de individuos relativamente cercanos que exhiben bajos niveles de polimorfismo (Zietkiewicz et al., 1994) y se han utilizado exitosamente como una buena alternativa para obtener la huella genética y análisis genético en especies frutales incluyendo a los cítricos (Citrus spp.) (Fang y Roose, 1997; Fang et al., 1998), vid (Vitis vinifera L.) (Moreno et al., 1998), grosella (Ribes grossularia) (Lanham y Brennan, 1999) y ciruelo (Prunus sp.) (Goulão et al., 2001) y nopal tunero (Opuntia spp.) (Luna-Páez et al., 2007).

En el presente estudio, con ISSR se agruparon algunos individuos con características en común como a los dos individuos de la raza Mexicana, a los dos individuos de la raza Guatemalteca, y a Persea lingue y Persea indica del género Eriodaphne (Kopp, 1966). No así a P. nubigena, al posible híbrido P. nubigena x P. americana, P. gigantea y P. steyermarkii, que son especies que se sabe dieron origen a la raza Guatemalteca (Furnier et al., 1990), donde se mostraron dispersos en cuadro ramificaciones diferentes. Algo parecido sucedió con P. schiedeana y el híbrido interespecífico P. schiedeana x P. americana var. guatemalensis (Ellstrand et al., 1986), que también se ubicó en ramificaciones distintas, al igual que P. cinerascens y P. floccosa.

Al respecto es marcada la falta de afinidad entre las especies e híbridos tanto del subgénero Persea (con excepción de las razas de P. americana) como de Eriodaphne, lo anterior también se ha encontrado con marcadores SSR para especies diferentes a P. americana cuando se analizaron junto a esta última (Mhameed et al., 1997), donde sí se pudo separar las tres razas de aguacate del resto de las especies.

En general los resultados indicaron que el género Persea es polifilético tal como se ha planteado (Chanderbali et al., 2001), así como P. americana (Furnier et al., 1990). Sin embargo, indudablemente se debe abarcar una buena cantidad de genotipos para un estudio futuro con el fin de confirmar lo encontrado.

Agradecimientos

Se agradece el apoyo financiero a través del Proyecto clave 61 "Estudio de las relaciones genéticas entre especies del género Persea subgénero Persea" de la Red Aguacate del Sistema Nacional de Recursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura SNICS-SAGARPA del Gobierno Federal de México.

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