Producción de biopelículas y resistencia a desinfectantes en cepas de Salmonella aisladas de nopal, agua y suelo*

Biofilm production and resistance to disinfectants in Salmonella strains isolated from prickly pear, water and soil

Alfricia Adriana De los Santos Villamil¹, Ana María Hernández Anguiano^1§, Carlos Alberto Eslava Campos², Patricia Landa Salgado¹, Gustavo Mora Aguilera¹ y John Bernard Luchansky³

¹ Fitopatología. Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Carretera México- Texcoco, km 36.5. C. P. 56230. Tel 01 (595) 9520200. Ext. 1610. ^§Autora para correspondencia: (ahernandez@colpos.mx) (avillamil@colpos.mx), (ahernandez@colpos.mx); (landa@colpos.mx); (morag@colpos.mx).

³ USDA/ARS/ERRC, 600 East Mermaid Lane, Wyndmoor, P. A. 19038, USA. Tel. +52(55)58045900. (John.Luchansky@ars.usda.gov.).

* Recibido: diciembre de 2011
Aceptado: septiembre de 2012

Resumen

Una característica de Salmonella es su capacidad para formar biopelículas. Estas estructuras pueden convertirse en focos de contaminación en la producción de alimentos inocuos, ya que resisten tratamientos con antimicrobianos y son difíciles de remover en procedimientos normales de limpieza. Por lo anterior los objetivos del presente estudio fueron: 1) determinar la capacidad de cepas de Salmonella, aisladas de nopal verdura (10 cepas), muestras de agua (2 cepas) y suelo (3 cepas), para formar biopelículas y 2) evaluar el efecto bactericida de los desinfectantes ácido cítrico, ácido láctico e hipoclorito de sodio sobre cepas formadoras de biopelículas. Se utilizó el método de OToole y Kolter (1998) y placas de poliestireno (Coster®) con medio esencial mínimo con glucosa (MEM) y se determinó la densidad óptica (D.O) para estimar la producción de biopelículas. Los desinfectantes se aplicaron a placas con formación de biopelículas en MEM simple de 48 h a 37 °C. Todas las cepas registraron producción de biopelículas desde las 24 h aunque se obtuvieron diferencias significativas (Tukey α= 0.05), dependiendo del tiempo de incubación con respecto a los valores de D. O. Las cepas de suelo expresaron su capacidad más rápidamente que las de agua y nopal. El hipoclorito de sodio (200 ppm) y el ácido láctico (1.5 X 10^-4) inhibieron el crecimiento de células cuando se aplicaron por 20 min sobre las biopelículas. Los resultados aquí obtenidos evidencian la importancia de implementar las buenas prácticas agrícolas en la producción de nopal, como estrategia para prevenir la contaminación por cepas de Salmonella formadoras de biopelículas in vivo, donde el efecto de los tratamientos con sanitizantes pudiera variar.

Palabras clave: Salmonella, biopelículas, desinfectantes, nopal.

A characteristic from Salmonella is its capacity to form biofilms. These structures can become sources of contamination in the production of safe food, as they resist treatment with antibiotics and are difficult to remove in normal cleaning procedures. Therefore the objectives of this study were: 1) determine the capacity of Salmonella strains isolated from prickly pear (10 strains), water samples (2 strains) and soil (3 strains) to form biofilms and 2) evaluate the bactericidal effect of disinfectants citric acid, lactic acid and sodium hypochlorite on biofilm-forming strains. We used the method of O'Toole and Kolter (1998) and polystyrene plates (Coster®) with minimal essential medium with glucose (MEM) and determined the optical density (OD) to estimate the production of biofilms. The disinfectants were applied to plates with biofilm formation in simple MEM 48 h at 37 °C. All strains showed biofilm production after 24 h although there were significant differences (Tukey α= 0.05), depending on the incubation time with respect to the values of OD. The soil strains expressed it's the capacity faster than water and prickly pear. Sodium hypochlorite (200 ppm) and lactic acid (1.5 x 10^-4) inhibited cell growth when applied for 20 min on biofilms. The results obtained demonstrate the importance of implementing good agricultural practices in the production of prickly pear as a strategy to prevent contamination by Salmonella strains biofilms forming in vivo, where the effect of treatment with sanitizers may vary.

Key word: Salmonella, biofilms, disinfectant, prickly pear.

Introducción

En México, el cultivo de nopal (Opuntia ficus-indica) ocupa una superficie promedio, a nivel nacional, de 9 318 hectáreas y como muchos otros cultivos hortofrutícolas está expuesto a contaminación por diversos microorganismos enteropatógenos, debido a las condiciones generadas durante su producción y manejo postcosecha (Hernández et al., 2009). Una característica importante de estos microorganismos es su capacidad para producir biopelículas, la que les permite adherirse y colonizar superficies bióticas y abióticas como tejido vegetal y animal, plástico, cemento y acero (Hood y Zottola, 1997; Annous et al., 2005; Vanegas et al., 2009). Por ejemplo en cilantro por Salmonella Thompson (Annous et al., 2009) y en melón Cantalupe por Salmonella sp. (Annous et al, 2005), entre otros vegetales.

Las biopelículas son comunidades de células microbianas embebidas en una matriz de exopolímeros que ellas mismas producen, como mecanismo de supervivencia y protección (Branda et al, 2005). La composición de esta matriz es variable, puede estar formada de carbohidratos, péptidos, proteínas, lípidos o una combinación de estas sustancias aunque la mayor parte del volumen la constituye el agua, la cual representa hasta 90% del contenido total (Costerton y Rodney, 2002; Lasa, 2006).

La formación de biopelículas por microorganismos representa un serio problema para los sectores industrial, de salud y de la producción de alimentos, ya que, es una fuente de contaminación microbiológica constante, debido a la dificultad para eliminarlas una vez formadas. Entre los métodos de control de las biopelículas se encuentran la utilización de desinfectantes, antibióticos, detergentes, agentes quelantes o sus combinaciones, entre otros (Scher et al, 2005). Costerton y Rodney (2002) reportan que para que el desinfectante tenga efecto sobre las células, este debe reaccionar primero con los polisacáridos de la biopelicula; con el riesgo de oxidarse al entrar en contacto con estos compuestos y perder su efectividad (Sapers, 2003). Por otra parte, Kumar y Anand (1998) indican que, después de un tratamiento con biocida, las células bacterianas pueden incrementar la producción de exopolimeros, como respuesta de defensa, dejando sin efectividad al producto.

Por lo expuesto anteriormente y debido a que durante un análisis sobre la pureza de cepas de Salmonella en Agar Soya Tripticaseina (AST) se observó la presencia de colonias rugosas, característica indicadora de formación de biopelículas, los objetivos de este estudio fueron evaluar la capacidad de cepas de Salmonella aisladas de nopal verdura fresco y muestras de agua y suelo de uso agrícola, para formar biopelículas y determinar la sensibilidad de estas a desinfectantes orgánicos e inorgánicos, con fines de prevención y control. La hipótesis es que las cepas de Salmonella asociadas a nopal verdura tienen la capacidad de formar biopelículas, lo que les confiere una mayor resistencia a los desinfectantes.

Cepas bacterianas

En este estudio se analizaron 15 cepas de Salmonella, todas, excepto una, correspondientes a Salmonella entérica serotipo Typhimurium (S. typhimurium) y a Salmonella entérica serotipo Javiana (S. javiana), aisladas de nopal verdura (10 cepas), muestras de agua (2 cepas) y suelo de uso agrícola (3 cepas) de una zona productora de nopal en Tlalnepantla, Morelos, México, en 2006 (Cuadro 1). Como testigos se utilizaron las cepas de Escherichia coli O44:H18 y S. typhimurium Copenhague 4,12:I 12, obtenidas de una colección del Laboratorio de Investigación Básica del Departamento de Salud Pública, de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

Morfología de colonias

Las cepas individuales de Salmonella se desarrollaron en AST e incubaron a 37 ºC por 24 h y, posteriormente, a temperatura ambiente por 38 días. Se registró el tipo de crecimiento, coloración y formación de microcanales (matriz extracelular) de las colonias. Esto último para correlacionarlo con la capacidad de formación de biopelículas in vitro (Malcova et al., 2008).

Capacidad para formar biopelículas

La formación de biopelículas se analizó por el método de O'Toole y Kolter (1998), con algunas modificaciones. En placas de poliestireno (Coster®) de 24 pozos, con medio esencial mínimo con glucosa, se depositaron 50 μL de suspensión bacteriana ajustada a una densidad de 1 en la escala de McFarland (3 x 10⁸ UFC/mL) en solución salina a 0.85%. Después de incubarse a 37 °C por 24, 48 y 72 h, se retiró la suspensión y los pozos se lavaron enérgicamente con agua destilada estéril (el lavado se repitió dos veces). A cada pozo se le agregaron 950 μL de cristal violeta a 1% y después de 20 min de reposo se eliminó el colorante y se lavó con agua destilada estéril. Se agregó 1.0 mL de etanol al 96% por pozo y el sobrenadante se transfirió a una celda para medir la densidad óptica (D. O), a 570 nm en un espectrofotómetro Spectronic® (Genesys 2). La prueba se repitió tres veces, cada una con dos repeticiones.

D. O ≤ D.O_L= no productora de biopelícula (0)

D. O_L <D.O ≤ (2 x D.O_L)=productora débil de biopelícula (+)

(2 x D. O_L) < D. O ≤ (4 x D.O_L)= productora moderada de biopelícula (++)

(4 x D. O_L) < D.O= productora fuerte de biopelícula (+++)

Sensibilidad de biopelículas de Salmonella a desinfectantes orgánicos e inorgánicos

Se seleccionaron las cepas N18 de nopal verdura, A8 de agua y S1 de suelo de uso agrícola, definidas como productoras fuertes de biopelículas, para conocer la sensibilidad de estas cepas a los ácidos cítrico y láctico (orgánicos), así como al hipoclorito de sodio (inorgánico), a las concentraciones recomendadas para la desinfección superficial de frutas y hortalizas frescas (Sapers, 2003). El ácido láctico se utilizó a 1.5 X 10^-4, el ácido cítrico a 1 X 10^-4 y el hipoclorito de sodio a 200 ppm; como control se utilizó agua destilada estéril.

Los desinfectantes se aplicaron a placas de poliestireno (Coster®) con formación de biopelículas en MEN simple de 48 h e incubadas a 37 °C. Previo al tratamiento, la suspensión MEN se retiró con una pipeta Pasteur y cada pozo se lavó tres veces con agua destilada estéril. Enseguida, se depositó 1 mL de desinfectante por pozo y se dejó reposar por 20 min. Transcurrido ese tiempo, se retiró el desinfectante con una pipeta Pasteur y cada pozo se enjuagó con agua destilada estéril.

Para recuperar y cuantificar las células viables, en cada pozo se depositó 1 mL de CST y se incubó a 37 °C, por 24 h, sin agitación en oscuridad. Transcurrida la incubación, se tomaron 100 μL de cada suspensión bacteriana y se depositaron en tubos Eppendorf (1 mL) con 900 μL de agua peptonada amortiguada (DIFCO^TM) a 0.1%, previamente esterilizados. Después de agitarse, se tomaron 100 μL para hacer diluciones seriadas (de 10^-1 a 10^-6). De cada dilución se tomaron muestras y se sembraron en cajas Petri con AST, por la técnica de la gota (Pérez et al., 2002), y se incubaron a 37 °C, por 18 h. Se contaron únicamente aquellas cajas con desarrollo de colonias separadas bajo una lupa con luz.

Resultados y discusión

Formación de matriz extracelular por cepas de Salmonella

Los resultados obtenidos muestran la presencia de diferentes comportamientos, uno de los cuales corresponde a un crecimiento de colonia con forma de microcanales y otro liso sin microcanales. El tipo de morfología con microcanales está relacionado con bacterias formadoras de una matriz extracelular típica de biopelículas (Malcova et al., 2008). Las cepas que mostraron este tipo de forma bien definida fueron A8, S8, N3, N12, N13, N17 y N18 (Figura 1). Jonas et al. (2007) mencionan que este tipo de crecimiento característico, puede deberse a la producción de curli, fibra secretada por Salmonella que tiene la función de adhesión a superficies, agregación celular y resistencia ambiental. Estas estructuras fibrilares de curli, junto con celulosa y otros polisacáridos, se unen para formar una matriz extracelular visible (Branda et al, 2005). En contraste, la morfología de las colonias de las cepas A3, S1, S4, N4, N7, N8, N10 y N14 se encontró lisa, sin los microcanales característicos de las cepas que secretan exopolisacáridos (Figura 1).

Los resultados obtenidos concuerdan con los reportados por Malcova y colaboradores (2008), quienes compararon la morfología de las colonias de Salmonella typhimurium con microscopia electrónica, mediciones de absorbancia y ELLA (por sus siglas en inglés, Enzyme-Linked Lectinsorbent Assay) y evaluaron el tipo de morfología (microcanales) de la bacteria pero en medio agar rojo congo. Dichos autores señalan, con base en sus resultados, que en ausencia de producción de fibras de curli y celulosa, las células bacterianas pueden mantener su capacidad de formar biopelículas con la sobreproducción de polisacáridos capsulares (componente de biopelículas de Salmonella). Considerando lo anterior las ocho cepas de Salmonella que registraron colonias planas sin microcanales pueden también calificarse como productoras de biopeliculas en AST e incubadas en condiciones ambientales por 38 días (Figura 1).

Capacidad para formar biopelículas

Todas las cepas de Salmonella analizadas mostraron capacidad de formar biopelículas desde las 24 h de incubación, de acuerdo a los valores registrados de D.O a 570 nm (Cuadro 1). Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre la capacidad de las cepas (Tukey α= 0.05), dependiendo de los tiempos de incubación, con respecto a los valores de absorbancia. Los resultados indicaron que las cepas procedentes de suelo expresan su capacidad de adhesión más rápidamente que las cepas de agua y nopal (Figura 2). Las cepas que mostraron valores de absorbancia mayores fueron el testigo positivo, con 0.694 (E. coli O:44 H:18), seguido por las cepas S1, S8 y S4 con 0.217, 0.188 y 0.178, re spectivamente; en tanto que las cepas N13 y N17 registraron valores bajos de absorbancia, con 0.053 y 0.056, respectivamente (Cuadro 1).

Asimismo, las cepas A3 y A8, procedentes de agua, mostraron un comportamiento similar al de las cepas de suelo pero sin mostrar diferencias significativas (Tukey, α= 0.05) entre sus valores (Figura 2A). Con respecto a las cepas provenientes de nopal, la cepa N8 registró el valor promedio de absorbancia más alto (0.184), seguido de las cepas N14 y N18 (0.149 y 0.161 respectivamente) (Figura 2A). En tanto que las cepas N3, N4, N7, N10, N12 y N14 registraron valores intermedios similares estadísticamente desde las 24 h. En contraste, las cepas N13 y N17 presentaron los valores de absorbancia más bajos (0.053 y 0.056, respectivamente) de todas las cepas de nopal (Figura 2A).

También se observó que la intensidad de las lecturas se incrementa con el transcurso de las horas; los valores de absorbancia más altos se registraron en 48 y 72 h. Por ejemplo, algunas cepas mostraron un aumento en los valores de densidad óptica (indirectamente, un incremento en la producción de biopelículas) con el transcurso de las horas, tal es el caso de las cepas N7 y N8, aisladas de nopal; A3 y A8, de agua; y, S1 y S4, de suelo.

Éstas cepas presentaron una fuerte producción de biopelículas desde las 24 h (Cuadro 2), no obstante, los valores más altos de absorbancia se registraron a las 72 h (Figura 2A). Scher et al. (2005) mencionan que Salmonella tiene la capacidad de formar biopelículas, independientemente de su origen (alimentos y animales, entre otros) cuya formación puede hacer resistir a la bacteria condiciones variantes del medio ambiente y constituirse en un riesgo cuando productos como el nopal se consumen frescos (Costerton y Rodney, 2002; Hernández et al., 2009).

Algunas cepas de nopal, como N4, N12, N14, N17 y N18, presentaron una fuerte producción de biopelículas a las 24 h, pero esta disminuyó a las 48 h, ubicando a estas cepas dentro de la clasificación de moderadas productoras de biopelículas; no obstante, a las 72 h nuevamente registraron una fuerte producción (Figura 1A). La formación de biopelículas in vitro es un evento muy complejo relacionado con diferentes factores físicos y químicos, como la composición del medio, la temperatura, el pH, los niveles de oxígeno (Hostacka et al, 2010), y los cambios dentro de las mismas cepas (Malcova et al., 2008), entre otros. Cuadro 3.

Donde: 0, no productora; +, productora débil, ++, productora moderada; y +++, productora fuerte. La producción de microcanales se registró en AST a 37 ºC por 24 h y posteriormente a temperatura ambiente por 38 días. Cada valor representa el promedio de tres repeticiones.

Sensibilidad de biopelículas de Salmonella a desinfectantes orgánicos e inorgánicos

En este ensayo se incluyeron las cepas A8, S1 y N18, por haber sido registradas dentro de la categoría de productoras fuertes de biopelículas, desde las 24 h (Cuadro 3). Los resultados obtenidos con los desinfectantes solubilizados en agua destilada muestran que solo los tratamientos con hipoclorito de sodio (200 ppm), y el ácido láctico (1.5 X 10^-4 ppm) aplicados por 20 min sobre las biopelículas, inhibieron significativamente el crecimiento de las tres cepas de Salmonella (Figura 3). Lo anterior coincide con Joseph y colaboradores (2001) quienes reportaron que el hipoclorito de sodio a 100 ppm, aplicado por 20 min, sobre biopelículas inhibe el crecimiento de células de Salmonella.

El mecanismo del cloro para inhibir microrganismos puede ser el resultado de varios factores: oxidación de enzimas sulfhídrilo y aminoácidos; pérdida del contenido intracelular; disminución de la toma de nutrientes; inhibición de la síntesis de proteínas, decrecimiento en la toma de oxígeno; oxidación de componentes respiratorios; disminución en la producción de adenosín trifosfato, rompimiento del DNA y represión de la síntesis de DNA (Rutala, et al, 2008). Sin embargo, los resultados contrastan con los obtenidos por Rupasinghe y colaboradores (2006) quienes reportaron una disminución de 4 log, cuando evaluaron la eficacia del ácido láctico (1.5%) combinado con el ácido peroxiacético (80 ppm) en manzanas inoculadas con Salmonella Newport.

Por otra parte el ensayo con ácido cítrico no mostró inhibición del crecimiento de las células adheridas de las cepas A8, S1 y N18, ya que estas se mantuvieron viables, mostrando cuentas similares a las obtenidas con el testigo (Figuras 3). Previamente Zhuang et al. (1996), reportaron que el ácido cítrico a 0.2% carece de efecto inhibitorio pero sobre Salmonella montevideo en tomate.

Los resultados obtenidos con los desinfectantes orgánicos e inorgánicos evidencian la importancia de implementar las buenas prácticas agrícolas en la producción de nopal verdura, como estrategia para prevenir la contaminación por cepas de Salmonella formadoras de biopelículas in vivo, donde el efecto de los tratamientos con sanitizantes pudiera variar.

Conclusiones

Las cepas de Salmonella N4, N7, N8, N10, N12, N13, N14, N17, N18, A3, A8, S1, S4 y S8, aisladas de cladodios de nopal verdura (N), agua (A) y suelo (S) de uso agrícola de la región de Tlalnepantla Morelos, tienen capacidad de formar biopelículas.

Las cepas S1, S4, S8 de suelo yA3 de agua tuvieron la mayor capacidad formativa de biopelículas.

Las cepas S1, S4 y S8 de suelo expresan su capacidad de adhesión más rápidamente que las cepas de agua A3 y A8 y que N4, N7, N8, N10, N12, N13, N14, N17, N18 de nopal.

El ácido láctico a 1.5 X 10^-4 y el hipoclorito de sodio a 200 ppm, disueltos en agua, inhibieron significativamente el crecimiento de las cepas A8, S1 y N8 de Salmonella, cuando se aplicaron por 20 min a placas de poliestireno con formación de biopelículas de éstas cepas.

El ácido cítrico a 1 X 10^-4 ppm no tuvo efecto inhibitorio sobre las cepas A8, S1 y N8 de Samonella cuando se aplicó por 20 min a placas de poliestireno con formación de biopelículas de estas cepas.

Agradecimientos

Literatura citada

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