Asociación entre la evolución clínica de pacientes con tuberculosis y la resistencia al tratamiento de los aislados de Mycobacterium

Association between the clinical course of patients with tuberculosis and the treatment resistance of isolates of Mycobacterium

José de Jesús Alba R.^1,2, José Luis Ortega S.,⁵ Perla Karina Espino S.,⁶ Julieta Luna H.,³ Blanca Estela García P.,³ Norma Urtiz E.,⁴ Maribel Cervantes F.,⁴ Estela Ruíz B.,⁴ José Ramón Hernández S.,⁵ Pablo Ruíz F.,⁶ Aurora Martínez R.¹

¹ Facultad de Ciencias Químicas, Unidad Gómez Palacio, Universidad Juárez del Estado de Durango.

³ Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional.

⁴ Facultad de Ciencias Químicas, Unidad Durango.

⁵ Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas, Universidad Autónoma Chapingo.

⁶ Centro de Investigación Biomédica, Universidad Autónoma de Coahuila.

Correspondencia 

Dra en C Aurora Martínez Romero
Facultad de Ciencias Químicas, Unidad Gómez Palacio,
Universidad Juárez del Estado de Durango ]]> Av. Articulo 123 S/N Col. Filadelfia, CP 35010 AP No. 51
Gómez Palacio, Durango México
Tel. (871) 7 15 88 10 Fax (871) 7 15 29 64
e-mail: quimicaaurora@hotmail.com

Fecha de recepción: 6 de septiembre de 2011.
Fecha de recepción de modificaciones: 25 de noviembre de 2011.
Fecha de aceptación: 15 de diciembre de 2011.

Resumen

Palabras clave: resistencia, rifampicina, isoniazida. 

Abstract

The tuberculosis has increased by the emergence of multidrug-resistant strain (MDR). Was associated clinical course of patients with tuberculosis and treatment resistance. 268 samples were obtained, the resistance to drugs was determined for blue Alamar; 41.04% corresponded to strain sensitive to all the drugs; 17.91% MDR. The resistance was: isoniazid 28%, rifampin 52%, streptomycin 24%, and ethambutol 27%. Of 268 patients, 197 were virgins to treatment, of which 44% presented primary resistance, but of these, only 5% MDR. 71 patients (26.49%) with previous treatment presented secondary resistance, of which 14.55% was MDR. At the end of the follow-up, 72% recovered, 21% remained sick, and 7% died. The patients with better forecast were with sensitive strain, followed by patients with primary resistance and those of badly forecast they were MDR.

Key words: resistance, rifampin, isoniazid.

Introducción

La tuberculosis (TB) es considerada como un problema de salud, económico y social de gran magnitud.¹ En la actualidad, constituye uno de los problemas más importantes de salud pública en el mundo, a pesar de la disponibilidad de terapia anti-TB desde hace más de 50 años.² Según la Norma Oficial Mexicana (NOM-006-SSA2-1993), la TB es una enfermedad infecciosa generalmente crónica causada por las especies del género Mycobacterium, principalmente por M. tuberculosis en humanos y M. bovis en animales. M. tuberculosis se transmite del enfermo a un sujeto sano por la inhalación de material infectante mientras que M. bovis lo hace a través de la ingestión de leche de vaca contaminada.³ En las últimas décadas esta enfermedad se ha visto potenciada por el surgimiento de cepas multidrogorresistentes (MDR) de M. tuberculosis y por la co-infección con el virus de inmunodeficiencia humana (HIV).^4,5

La presencia del HIV incrementa el riesgo de reactivación de la infección de la TB latente y ha aumentado dramáticamente la muerte por TB en años recientes. La MDR se define como la resistencia a por lo menos, isoniazida (INH) y rifampicina (RIF).² La TB afecta a millones de personas a nivel mundial, al respecto, la OMS ha declarado que existen 8 millones de nuevos y 2 millones de defunciones anualmente como consecuencia de esta enfermedad.^6,7

Una encuesta realizada en América Latina por la OMS y la OPS entre 1986 y 1990, mostró que México presentaba una preocupante frecuencia de resistencia primaria del 19.1%. En contraste, entre 1989 y 1993 el Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica (INDRE), evaluó 1811 aislamientos de diversos Estados de la República encontrando una resistencia primaria de 8.3%. Sin embargo, en 1995 Sifuentes y Cols, reportaron una resistencia primaria a INH del 9%, a RIF del 6% y la MDR en el 6% de los casos, así como tasas alarmantes de resistencia secundaria: 44% para INH, 35% para RIF y un 35% de MDR. En 1997, en una encuesta realizada bajo los lineamientos de la OMS en tres Estados de la República Mexicana, por De la Fuente y Cols, se encontraron niveles de resistencia de 12.8% en casos nuevos y del 50% en casos de TB con tratamiento anterior con uno o más medicamentos de primera línea.¹⁰ El Laboratorio de Salud Pública de Baja California, en un estudio realizado del 1° de enero de 1998 a 31 de abril de 1999 encontró una resistencia por lo menos a un fármaco antituberculoso en el 41% de los pacientes, de los cuales el 17% eran MDR. Así, Laniado-Laborín ha planteado la necesidad de regionalizar los laboratorios de diagnóstico de TB con el fin de facilitar la realización de estudios regionales y optimizar el tiempo de diagnóstico e inicio del tratamiento.¹¹

Según la Dirección General de Epidemiología de la Secretaria de Salud, en la Comarca Lagunera de Durango y Coahuila en el año 2007 en las Jurisdicciones 2, 6 y 7, se reportaron 338 casos nuevos, treinta de los cuales presentaron falla terapéutica de etiología no especificada, aunque se especula que tal falla pudo haberse debido a la presencia de cepas resistentes.¹² El micrométodo colorimétrico Alamar azul (MABA), descrito por Luna Herrera en año 2003 es una prueba eficiente en la determinación de la resistencia de las micobacterias ante los medicamentos anti-TB,¹³ por lo que, su uso como una herramienta confiable, rápida, fácil de realizar y económica resulta muy favorable, sobre todo en países de escasos recursos. El MABA permite la reducción en tiempos y costos y aumenta la sensibilidad de la detección de la enfermedad.

La situación actual de la TB incluyendo la aparición de cepas MDR a los antifímicos, ha provocado que se den cambios sustanciales en el diagnóstico de esta enfermedad. Asimismo, dado que la TB es un problema de salud genera la necesidad de la búsqueda de nuevas alternativas para otorgar el tratamiento preciso a cada individuo afectado, por lo que es pertinente realizar el aislamiento, identificación y sobre todo determinar la sensibilidad de las cepas ante los fármacos anti-TB de primera línea, dada la alta incidencia y prevalencia de casos de TB en la región de la Comarca Lagunera, aunado a esto, surge la necesidad de conocer las causas de las fallas terapéuticas en los pacientes con TB, por las implicaciones económicas, sociales y sobre todo epidemiológicas. El conocimiento de las razones de las fallas permitirá disminuir de una manera eficiente el número de casos TB-MDR. La demora en el diagnóstico y tratamiento conlleva mayor deterioro de la salud del paciente e incrementa el riesgo en la comunidad, con lo cual aumenta la morbimortalidad y transmisión de la infección. Por esa razón, el objetivo del presente trabajo fue establecer con el MABA un diagnóstico rápido a partir de muestras pulmonares con TB, asociando la evolución clínica de pacientes con la resistencia al tratamiento de los aislados de Mycobacterium.

Material y método

Aislamientos clínicos

Se procesaron 268 muestras de expectoración de pacientes con diagnóstico de TB pulmonar (TBP), canalizados de diferentes hospitales y jurisdicciones de las ciudades de Gómez Palacio Durango y Torreón, Coahuila, México, con la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Juárez del Estado de Durango (UJED) Unidad Gómez Palacio (17/2009), según acuerdos de la declaración de Helsinki.

Para preparar las muestras para cultivo se procedió a desarrollar la descontaminación de las muestras por el método de Petroff (Solución de NaOH al 4%), según la Nota Técnica No. 27 OPS/OMS.¹⁴ Las cepas de referencia ATCC H37Rv 27294 sensible, H37Rv 35837 RIF resistente, H37Rv 35822 INH resistente, H37Rv 35820 estreptomicina (SM) resistente y H37Rv 35837 etambutol (EMB) resistente, fueron facilitadas por el Departamento de Inmunología de la ENCB del IPN.

Condiciones de crecimiento y preparación de la suspensión bacteriana

Ensayo del micrométodo colorimétrico Alamar azul (MABA)

La resistencia a fármacos de los aislados fue determinada por el MABA, el cual utiliza un colorante óxido-reductor como indicador de viabilidad de crecimiento y metabolismo celular, cuya forma oxidada es azul y la reducida es rosa, cuantificándose en unidades relativas de fluorescencia, el cambio de color de detecta visualmente, esta propiedad se utiliza para medir la viabilidad de M. tuberculosis luego de la exposición a los medicamentos anti-TB.¹⁷ Se procedió a realizar los experimentos según ha sido descrito por Luna-Herrera y cols.¹⁸

Las placas se colocaron en bolsa de plástico para evitar la evaporación y se incubaron a 37°C durante 5 días. Posteriormente, se adicionó como revelador el colorante resarzurina, de acuerdo a las siguientes indicaciones: 20 µE de resarzurina a los pozos de problemas y controles, se incubó nuevamente 24 h y se leyó tomando como punto de corte, para obtener la concentración mínima inhibitoria (CMI), el control 1:100. En el caso de no existir cambio de coloración en el primer control, se dejó incubando de 2 a 3 días más, si existió el cambio se adicionó el colorante a toda la placa.¹⁹

Los resultados de MABA se obtuvieron después de 8 días de incubación en promedio. La sensibilidad fue establecida determinando la CMI para cada fármaco, de donde se obtuvo el resultado de sensibilidad y resistencia global para cada uno de los antibióticos. La evolución clínica de los pacientes se determinó dando seguimiento durante un año. Cada mes, con las muestras de expectoración se realizó el BAAR, cultivo con Lówenstein-Jensen y Middlebrook, posteriormente, los pacientes se categorizaron como: resistencia secundaria (pacientes con tratamiento previo), resistencia primaria (pacientes sin tratamiento previo) y sensibles (pacientes sin tratamiento previo).

Una vez desarrolladas las cepas se procedió a determinar la resistencia a los fármacos por el MABA, aplicando el tratamiento acortado estrictamente supervisado por el médico tratante. Al realizar el seguimiento a cada paciente, algunos mostraron curación (BAAR negativo) desde el 2° y 3er mes, continuando el monitoreo hasta el 6° mes y así se fueron dando de alta, siguiendo los estudios respectivos con los pacientes que continuaban enfermos (bacilíferos). Una vez concluido el año de seguimiento se realizó el análisis estadístico correspondiente.

Análisis estadístico

Para determinar la dependencia entre sensibilidad, resistencia y curso de la enfermedad, se realizó un análisis de asociación entre dos variables categóricas con dos posibles resultados, utilizando la prueba de Chi-cuadrada de Pearson.²⁰ El Programa estadístico utilizado fue SAS versión 9.01 (SAS Introductory guide for personal computers. SAS Institute Inc, US. Cary, NC. 2002).

Resultados

Para los fenotipos INH resistente y sensible con el estado de salud, se determinó una Chi-cuadrada de 82.0419 con una p<0.0001 se observa que existe una mayor frecuencia 86.53% entre personas sanas con cepas sensibles respecto a sanos con capas resistentes 13.47%; sin embargo, el porcentaje de defunciones es mayor 94.44% en cepas resistentes que en cepas sensibles 5.56%, siendo de mayor porcentaje dentro de las cepas resistentes, con las personas enfermas. Para los fenotipo RIF resistentes y sensibles con el estado de salud, se determinó una Chi-cuadrada de 86.3075 con una p<0.0001 se observó que existe mayor frecuencia 65.80% entre cepas sensibles respecto a pacientes sanos con cepas resistentes 34.20%; sin embargo, la frecuencia de defunciones fue mayor (100%) con cepas resistentes respecto a las sensibles (0%).

Discusión

La situación actual de la TB, con la aparición de cepas multirresistentes a los fármacos, ha provocado que se den cambios sustanciales en la concepción del diagnóstico de esta enfermedad, no bastando con la observación única de los BAAR en la muestra, sino resaltando la importancia del aislamiento, identificación taxonómica de la bacteria y la realización de estudios de sensibilidad que indique de manera precisa el tratamiento de elección para cada paciente afectado, sobre todo a aquellos pacientes que porten una micobacteria MDR. En nuestra investigación, al estandarizar y desarrollar el MABA, dio buen resultado el introducir las placas costar de baja evaporación de 96 pozos en bolsas de polietileno, sin embargo, también se pueden sellar las microplacas con parafilm dando buenos resultados.²¹

Se determinaron los niveles de resistencia primaria y secundaria, así como la MDR a fármacos antituberculosos de primera línea. Los niveles de resistencia primaria y secundaria, así como MDR fueron más altos que los descritos por otros autores, aunque estos fueron estudios aislados con un número de muestra pequeño y con cepas de pacientes con TB sin importar si eran de diagnóstico o de pacientes con falla terapéutica. Resultados que proporcionaron información epidemiológica regional de los casos de TB.

Además, el estudio proporcionó también datos importantes a los epidemiólogos de los servicios de salud, con el fin de mejorar la atención a este padecimiento y así evitar la elevada tasa de resistencia y MDR, como se muestra en este estudio. Se observó la actividad del indicador redox resarzurina, que cambió sus propiedades fisicoquímicas al estar sujetos a un potencial de reducción elevado, como el que se genera cuando la micobacteria resistente a los fármacos crece irrestricta en el medio de cultivo. Al término del periodo de incubación de 24 o 48 h se observó la placa para determinar si había un cambio de coloración azul a rosa.

Los resultados obtenidos en cuanto a la reproducibilidad del método en la determinación de la sensibilidad a fármacos anti-TB de primera línea: INH, RIF, SM y EMB, en cepas aisladas de pacientes con TB aplicando el MABA, al respecto, Collins y Franzblau en 1997, utilizaron ensayos colorimétricos para determinar la susceptibilidad a las drogas anti-TB, ellos reportaron valores de concordancia de 87.9% y 97% con el método de proporciones en agar y el sistema radiométrico BACTEC-460, respectivamente, en donde se utilizaron tres cepas micobacteriales: H37Rv y H37Ra de M. tuberculosis y M. avium, en donde concluyeron que la diferencia entre la CMI de H37Rv y H37Ra de M. tuberculosis fueron significativas con nueve de los medicamentos probados y no se observó diferencia significativa entre la CMI determinada con BACTEC 460 y el método MABA.¹⁷ Un año después, Franzblau y cols, utilizaron el MABA para conocer la CMI de la INH, RIF, SM y del EMB de 34 aislamientos de M. tuberculosis, utilizaron como revelador el indicador óxido-reductor tetrazolio, usado para obtener la medición de susceptibilidad de la bacteria.²¹

En ese trabajo, se hizo también un comparativo con el método BACTEC 460 es otro método radiactivo usado para determinar la susceptibilidad de los medicamentos, en donde se encontró que de 19 aislamientos, 16 resultaron sensibilidad a 0.1 μg/mL de INH en el método BACTEC 460 y la CMI por el MABA fue de ≤0.25 μg/mL.²¹ El indicador oxido-reductor resarzurina se identificó como indicador óptimo para el MABA,²² lo que permitió su empleo para determinar la susceptibilidad de la micobacteria frente a fármacos anti-TB, mostrando muy buena correlación con el método de proporciones en agar.

Los resultados de este trabajo respecto a la sensibilidad obtenida por el MABA, coinciden también con una evaluación realizada para ver la exactitud del MABA, en donde se detectó de una manera muy rápida la resistencia a la RIF e INH en aislamientos clínicos de M. tuberculosis en Perú,²³ en el cual, se manifiesta que el MABA es una alternativa excelente como prueba a la sensibilidad a los medicamentos antimicobacteriales, considerando las ventajas de la susceptibilidad a los medicamentos fenotípica, tales como ensayos de microdilución, costo-beneficio, velocidad y resultados cuantitativos de la CMI.

En este trabajo de investigación se observó que el MABA es un método conveniente para determinar la sensibilidad a los aislamientos antimicobacterianos, es rápido y su aplicación requiere de mínima tecnología. También, estas observaciones coinciden con el trabajo realizado por Franzblau y cols, en 1998; al respecto, Collins y Franzblau, además de las observaciones antes mencionadas, concluyen que el MABA es sobre todo útil para el escaneo de medicamentos antimicobacteriales.¹⁷

También, para verificar la sensibilidad y especificidad de MABA se publicó en el año 2005, por Kumar y cols, que realizaron un comparativo con el método colorimétrico en microplaca rápido basado en la nitrato reductasa, con el método en microplaca MABA, para determinar M. tuberculosis de aislamientos clínicos, los resultados reproducibles fueron obtenidos en siete días por las dos técnicas.²³ De igual manera, se evidencia la elevada sensibilidad y especificidad de los métodos colorimétricos para la detección rápida de MDR-TB.¹⁹ Al respecto, se ha evaluado el MABA en cepas de M. tuberculosis con una sensibilidad (89%) y especificidad (100%) de resistencia a INH y RIF.16,24 Se observó que MABA es un método conveniente para determinar la sensibilidad a los aislamientos antimicobacterianos, es rápido y su aplicación requiere de mínima tecnología.

Se determinó la CMI para cada muestra y para cada fármaco (CMI del antibiótico necesaria para impedir el 99% o menos del crecimiento bacteriano), de acuerdo con el cambio de color del indicador redox de azul a rosa, utilizando como referencia los controles positivos del 100%, 10% y 1% de la actividad bacteriana. Se obtuvieron los niveles de resistencia a fármacos por el método de MABA y fueron corroborados por la ENCB del IPN del departamento de inmunología celular, encontrándose elevada concordancia con los resultados obtenidos previamente (>90%).

Los niveles de resistencia primaria y secundaria, en este estudio fueron del 56% y 45%, respectivamente. Así como una MDR del 47% y un 8% de cepas resistentes a todos los fármacos de primera línea. Los cuales, son más altos que los reportados por otros investigadores, como el obtenido por el INDRE en 1993 que fue del 8.3% de resistencia primaria, ese estudio fue similar al hallazgo obtenido en el año 1995 por De la Fuente y colaboradores, que obtuvieron una resistencia primaria de 9% para INH y 6% para RIF y una resistencia secundaria de 44% para INH y 35% para RIF y una MDR del 35%, el INDRE en 1997 encontró una resistencia primaria del 12.8%.

La implementación de la técnica de diagnóstico MABA, dará la oportunidad de ser en nuestra Región el primer Laboratorio Regional de Referencia, ya que el Gobierno Federal a través de CENAVECE, INDRE, en el Proyecto Salud-2004-01-089, contemplan el MABA como estrategia para el control y prevención de resistencia y MDR realizando estudios a nivel laboratorios regionales en los diferentes Estados de la República Mexicana. De otro lado, las técnicas de biología molecular aplicadas al estudio de la TB han permitido comprender la dinámica de la transmisión, patogenicidad y factores de riesgo asociados con la enfermedad. Al evaluar las muestras con falla terapéutica, de las 268 muestras procesadas, 126 (47%) de las cepas fue MDR, el 121 (45%) observó resistencia secundaria y 21 (8%) cepas mostraron resistencia a los cuatro fármacos (RIF, INH, SM y EMB). De manera semejante, en Iraq, Nema y colaboradores en el año 2009, encontraron de un total de 411 pacientes con TBP, que la resistencia a RIF, INH, SM y EMB fue en 52 (24.4%), 22 (10.3%), 21 (9.9%) y 8 (3.8%) de aislamientos, respectivamente.

La MDR y la resistencia a los cuatro fármacos fue de 52 (24.4%) y 24 (11.3%), respectivamente.²⁵ Ando y cols, en el año 2010, al analizar el perfil de la drogo-sensibilidad de 63 aislamientos realizados, detectaron cinco grupos, de los cuales el grupo I (20%) fue resistente a la INH (0.2 μg/mL) y sensible a la INH (0.1 μg/mL), y los del grupo V (5%) fueron altamente resistentes a la INH. Seis de los aislamientos fueron MDR y un aislamiento fue extremadamente MDR (XDR).²⁶ Aunque, la eficiencia del MABA ha sido aprobada en algunos países de América Latina como Colombia, Argentina, Perú y República de Cuba. En México, han sido muy pocos los estudios realizados con este fin, Luna-Herrera y colaboradores han realizado el MABA para determinar la drogo-sensibilidad de aislamientos clínicos de M. tuberculosis,¹⁸ es necesario realizar más estudios de sensibilidad, linealidad, crecimiento, no solo para Mycobacterium sino también para otro tipo de microorganismos,^19,20,27-30 en donde se ha probado la sensibilidad y el beneficio económico del MABA.

Considerando los resultados de la presente investigación se sugiere para un estudio posterior la inclusión de aislamientos clínicos de individuos considerados de alto riesgo de desarrollar TB, con el objeto de determinar la farmacorresistencia y otorgar oportunamente el tratamiento apropiado.

Conclusiones

Se estableció con el MABA un diagnóstico rápido a partir de muestras pulmonares con TB, asociando la evolución clínica de pacientes con la resistencia al tratamiento de los aislados de Mycobacterium. Se subraya el uso de la metodología fenotípica de MABA por la facilidad en su montaje e interpretación de resultados, lo cual la convierte en una herramienta útil en la determinación rápida de la farmacorresistencia de M. tuberculosis.

La determinación de la sensibilidad a los fármacos antituberculosos de primera línea, INH, RIF, SM y EMB, en cepas de Mycobacterium, fue exitosa aplicando el MABA, por lo que este ensayo, en primer lugar, permite con los cultivos realizados previamente, determinar la CMI a los fármacos de primera línea y posteriormente, aplicar el tratamiento adecuado con la determinación de resistencia y MDR a los medicamentos específicos para esta enfermedad.

Los resultados del estudio muestran que los pacientes con mejor pronóstico fueron aquellos que tenían cepas sensibles, seguidos de los que tenían resistencia primaria no MDR y los de mal pronóstico fueron los MDR. Lo que permite tomar medidas apropiadas como la modificación de la dosis terapéutica para lograr el control de la TB y la prevención de la morbimortalidad. Se determinó estadísticamente que existe una asociación determinante entre la MDR y las defunciones, por lo que es un indicador epidemiológico de riesgo para el paciente infectado con este tipo de cepas, así como para la población expuesta.

La TB es una enfermedad que requiere mayor atención por parte de las autoridades del sector salud, principalmente de la disponibilidad de técnicas que acorten los tiempos para hacer diagnósticos, principalmente en lo que se refiere a la resistencia y MDR en la Comarca Lagunera.

Agradecimientos

Especial agradecimiento al Departamento de Genética y Medicina Molecular del Centro de Investigación Biomédica de la Universidad Autónoma de Coahuila y al Departamento de Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN, por la confianza otorgada al permitir el uso de su equipo y respectivas instalaciones. Los autores agradecen a la Facultad de Ciencias Químicas Unidad Gómez Palacio de la Universidad Juárez del Estado de Durango, por el financiamiento en la realización del presente proyecto.

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