Phytotoxic activity of manzano hot pepper (Capsicum pubescens R & P) extracts
Ma. del Rosario García-Mateos1*; Claudia Sánchez-Navarro2; Juan Martínez-Solís3; Mario Pérez-Grajales3
1 Universidad Autónoma Chapingo, Departamento de Preparatoria Agrícola. km 38.5 Carretera México-Texcoco.Chapingo, Estado de México. MÉXICO. C.P. 56230. Correo-e: rosgar08@hotmail.com (*Autor para correspondencia).
2 Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza. Batalla 5 de Mayo s/n, Colonia Ejército de Oriente. Iztapalapa, Distrito Federal. MÉXICO. C.P. 09230.
3 Universidad Autónoma Chapingo, Departamento de Fitotecnia. km 38.5 Carretera México Texcoco.Chapingo, Estado de México. MÉXICO. C.P. 56230.
]]>Recibido el 26 de marzo, 2012.
Aceptado el 21 de mayo, 2013.
Resumen
La búsqueda de nuevos herbicidas de origen natural se ha realizado mediante los estudios de sustancias fitotóxicas debido a que no afectan el ambiente y son menos tóxicos que los sintéticos. En la literatura existen pocas evidencias de los efectos fitotóxicos de los capsaicinoides presentes en el género Capsicum, por lo que el objetivo de la presente investigación fue evaluar in vitro el efecto fitotóxico de los extractos del fruto de chile manzano (Capsicum pubescens R & P) en la germinación y vigor de Amaranthus hybridus L., Lactuca sativa L., Ipomoea purpurea L. y Bidens odorata Cav. Se realizó una prueba de germinación de acuerdo con la metodología de la International Seed Testing Asociation. El efecto de seis concentraciones de extractos (0.5, 1.5, 2.5, 5.0, 10, 20 % v/v), capsaicina (0.1 p/v) y ABA (0.01 p/v) fue evaluado en un experimento, usando un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones de 50 semillas cada una. El testigo fue agua destilada. Las variables evaluadas fueron el número de semillas germinadas (NSG) y el vigor (longitud de radícula, LR; longitud de la parte aérea, LPA). Se realizaron análisis de varianza y comparaciones de medias de Tukey (P ≤ 0.05). El extracto de diclorometano, comparado con el extracto etéreo, causó el mayor efecto fitotóxico sobre la germinación de A. hybridus y L. sativa, en las que el porcentaje se redujo hasta 100 %. También afectó en forma negativa el vigor de I. purpurea. El efecto fitotóxico de la capsaicina sobre la germinación y vigor sólo se manifestó en A. hybridus.
Palabras claves: Capsaicina, extractos, fitotoxicidad, germinación, vigor.
Abstract
The search for new natural herbicides was performed using studies of phytotoxic substances because they do not affect the environment and are less toxic than synthetics. In literature there is little evidence of phytotoxic effects of capsaicinoids, present in the genus Capsicum, thus the objective of this research was to evaluate in vitro the phytotoxic effects of the extracts of the manzano hot pepper (Capsicum pubescens R & P) fruit on germination and vigor of Amaranthus hybridus L., Lactuca sativa L., Ipomoea purpurea L. and Bidens odorata Cav. A germination test was performed according to the methodology of the International Seed Testing Association. The effect of six concentrations of extracts (0.5, 1.5, 2.5, 5.0, 10, 20 % v/v), capsaicin (0.1 w/v) and ABA (0.01 w/v) was evaluated in an experiment using a completely random design with four replications of 50 seeds each. The control was distilled water. The variables evaluated were: number of germinated seeds (NGS) and vigor (length of radicle, RL, length of the aerial part, LAP). Variance analysis and Tukey comparisons (P ≤ 0.05) were performed. The dichloromethane extract, compared to the ether extract, caused the most phytotoxic effect on the germination of A. hybridus and L. sativa, in which the percentage dropped to 100 %; it also negatively affected the vigor of I. purpurea. The phytotoxic effect of capsaicin on germination and vigor was only evident in A. hybridus.
]]> Keywords: Capsaicin, extracts, phytotoxicity, germination, vigor.
INTRODUCCIÓN
Desde hace treinta años, los trabajos sobre la aplicación de la alelopatía han aumentado considerablemente. La alelopatía está en concordancia con la actual demanda social, preocupada por una conciencia respetuosa al medio ambiente de las prácticas agrícolas (Chiapusio et al., 2004). Muchos productos naturales son fitotóxicos. Algunos de ellos son alelopáticos, representan una gran diversidad de estructuras (Einhelling, 2002), son biodegradables (Duke et al., 2002a) y algunos no generan resistencia (Duke et al., 2002b). Los estudios de sustancias alelopáticas contribuyen a la utilización directa de los compuestos con dicha actividad en la formulación de herbicidas, o a la mejora genética de plantas cultivadas que sintetizan naturalmente sustancias con potencial alelopático (Chiapusio et al., 2004), que coadyuven para reducir pérdidas económicas en la producción de algunos cultivos. Por tanto, la búsqueda de nuevos herbicidas de origen natural se ha intensificado debido a que no afectan el ambiente y son menos tóxicos que los sintéticos (Duke et al., 2002b). Los sintéticos se han usado indiscriminadamente en 47 países desde hace 50 años para el control de malas hierbas. Como consecuencia, se ha desarrollado resistencia en más de 235 especies de arvenses (Narwal, 2002).
En diversas investigaciones (Macías et al., 1997; Anaya et al., 1994) se ha demostrado el efecto alelopático de diversas especies como Ambrosia cumanensis, Brassica oleraceae, Brasica campestris, Croton pyramidalis, Eucalyptus y Piper auritum, entre otras. Casi la totalidad de las moléculas caracterizadas como agentes alelopáticos son metabolitos secundarios de los vegetales. Estos compuestos influyen sobre el crecimiento y el desarrollo de los sistemas biológicos y su variabilidad está controlada por factores genéticos y ambientales (Chiapusio et al., 2004). Los alelopáticos son más específicos y menos dañinos que los sintéticos utilizados en la agricultura y sirven de modelo en la búsqueda de nuevos herbicidas naturales (Macías, 1995). Muchos de los productos naturales son fitotóxicos, pero sólo algunos de éstos pueden ser alelopáticos (Dukeet al., 2002b).
Con el propósito de reducir el uso de herbicidas sintéticos, actualmente son objeto de investigación los efectos fitotóxicos de especies cultivadas sobre malas hierbas (Chiapusio et al., 2004). Se han realizado investigaciones de los extractos de Capsicum annuum como fitotóxicos (Cho et al., 1992) y potentes inhibidores del crecimiento de bacterias (Bacillus subtilis, Bacilllus cereus) y hongos (Cladosporium, Fusarium, Pyricularia) (Greger y Zechner, 1996; Dorantes et al., 2000). Dentro de las especies de Capsicum poco explotadas se encuentra el chile manzano (Capsicum pubescens R & P), originario de las partes altas del Perú y Bolivia (Pérez y Castro, 2008), de amplia distribución desde México hasta Argentina. La pungencia o picor del chile es causada por al menos uno de los 14 compuestos alcaloides conocidos como capsaicinoides (Kobata et al., 1998). Estos metabolitos presentan actividad antioxidante (Rosa et al., 2002), anticancerígena (Macho et al., 2003) e insecticida. Sin embargo, poco se conoce sobre el efecto fitotóxico de algunas especies de Capsicum. El objetivo de la presente investigación fue evaluar in vitro el efecto fitotóxico de los extractos del fruto de chile manzano (C. pubescens) en la germinación y vigor de Amaranthus hybridus L., Lactuca sativa L., Ipomoea purpurea L. y Bidens odorata Cav.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se recolectaron 20 kg de fruto de chile manzano 'Grajales St.', producido en 2009 bajo condiciones de invernadero en sistema hidropónico (Pérez y Castro, 2008), en el Campo Agrícola Experimental de la Universidad Autónoma Chapingo, ubicado en Chapingo, Estado de México (19° 29' 23" LN, 98° 52' 24" LO), a una altitud de 2,268 m. Seis meses después del trasplante, fueron tomados al azar los frutos para la preparación de los extractos.
]]>Preparación de los extractos crudos
Se colocaron 18,523 kg de frutos de chile manzano sin semilla en maceración (dentro de 5,000 ml de éter de petróleo) por 72 h en recipientes de cristal de 20 L de capacidad. La extracción se realizó repetidamente (3 x 5,000 ml). El residuo vegetal, libre de disolvente se sometió nuevamente a una extracción con diclorometano (3 x 5,000 ml). Con la finalidad de eliminar el disolvente, los extractos se concentraron al vacío a través de un rotaevaporador marca Büchi. Se obtuvieron 16 g de extracto etéreo (0.086 % de rendimiento) y 14.5 g de extracto de diclorometano (0.078 % de rendimiento). Mediante diluciones seriadas a partir de la concentración más alta, se prepararon cinco concentraciones (0.5, 1.5, 2.5, 5.0, 10, 20 % v/v) de ambos extractos. Utilizando la técnica modificada del bioensayo de bioautografía en cromatografía de capa fina para bacterias, descrita por Hamburger y Cordell (1987) y Ghisalberti (1993), y para germinación de semillas (Anaya, 2003), se establecieron las concentraciones de los extractos y de capsaicina (0.1 p/v) para la evaluación de la fitotoxicidad.
Cromatografía en capa fina
Los extractos preparados se analizaron por cromatografía en capa fina (CCF). Se emplearon cromatoplacas de aluminio (Merck) de 10 x 5 cm de gel de sílice 60 F254, y como eluyente se usó la mezcla metanol:diclorometano en una proporción de 8:2 v/v. El agente cromogénico fue el reactivo de Dragendorff (Wagner y Bladt, 1996), y la presencia de manchas color marrón indicó la presencia del alcaloide en los extractos. Se empleó como estándar una muestra auténtica de capsaicina (8 metil N vanillil 6 none namida; Aldrich).
Bioensayo de fitotoxicidad
Las semillas de I. purpurea y B. odorata fueron proporcionadas por el Laboratorio de Malezas del Departamento de Parasitología Agrícola y el Departamento de Zootecnia de la Universidad Autónoma Chapingo, respectivamente, mientras A. hybridus y L. sativa fueron adquiridos de una casa comercial de semillas. Se realizó una prueba preliminar de germinación con base en las recomendaciones de la International Seed Testing Association (ISTA) (Anónimo, 2005), en la que B. odorata obtuvo 74 % y las especies restantes 100 %.
Los resultados de la bioautografía en cromatografía de capa permitieron definir las concentraciones de los extractos (0.5, 1.5, 2.5, 5.0, 10, 20 % v/v) y de la capsaicina para la evaluación de la fitotoxicidad.
]]> El experimento de fitotoxicidad se llevó a cabo según el método descrito por Anaya et al. (1999). En cajas de Petri de 10 cm de diámetro con papel filtro Wattman no. 1, se colocaron 1.5 ml de cada concentración de extracto, de capsaicina (0.1 % p/v) por separado y ácido abscísico (ABA) (Aldrich) 0.01 % p/v. El residuo de disolvente se dejó evaporar, se depositaron 50 semillas por tratamiento y finalmente se agregaron 2.5 ml de agua destilada a cada caja. Como testigo se usó agua destilada. Las cajas Petri se colocaron en una germinadora Seedburo® bajo condiciones de luz continua con intensidad luminosa de 15.39 mmol-s-1nr2, humedad relativa de 80 % y a temperatura de 25 °C.Se usó un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones de 50 semillas. La toma de datos en B. odorata se realizó a los 21 días después de la siembra (Vibrans, 1995), mientras que en las especies restantes, se consideraron los días establecidos por la ISTA para el segundo conteo en la prueba de germinación estándar (Anónimo, 2005). Las variables para evaluar la fitotoxicidad fueron número total de semillas germinadas (NSG), considerando como germinadas aquellas que emitieron la radícula, y vigor de plántula, mediante la medición de la longitud de raíz (LR) y longitud de parte aérea (LPA) (Lovett y Ryuntyu, 1992). La primera se midió de la base del cuello a la punta de la raíz, y la segunda se cuantificó desde la base del cuello de la raíz hasta la punta de la plúmula, ambas en milímetros.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza y una prueba de comparación de medias (Tukey, P ≤ 0.05) con el programa Statistical Analysis System (Anónimo, 2000).
RESULTADOS
Número de semillas germinadas
El extracto etéreo afectó negativamente la geminación de A. hybridus a partir de 5 % de concentración. Éste redujo el porcentaje de germinación de 98 a 99 % con la concentración más alta. Situación similar se mostró por capsaicina y ABA, que abatieron la germinación en relación al testigo en 37 y 74 %, respectivamente. Con respecto a L. sativa, el efecto negativo del extracto se presentó a partir de la concentración de 10 %, y alcanzó su mayor efecto en la concentración más alta (20 %), donde la germinación se abatió hasta 97 %, del mismo modo que con ABA. Sin embargo, la capsaicina no indujo diminución en la germinación (Cuadro 1).
Concentraciones mayores a 5 % del extracto etéreo redujeron la germinación de B. odorata desde 82 hasta 98 %, pero ABA presentó el efecto más drástico (100 %), mientras que la capsaicina no afectó negativamente la germinación. Con respecto a I. purpurea, solamente ABA promovió un efecto negativo en la semilla, abatiendo hasta 81 % la germinación. Por lo tanto, exceptuando I. purpurea, las especies restantes fueron susceptibles al extracto etéreo pero a concentraciones mayores (Cuadro 1).
]]> La concentración de 0.5 % del extracto de diclorometano promovió una reducción de la germinación (97 %) en A. hybridus, y alcanzó el máximo de inhibición (100 %) desde 2.5 % de concentración. Asimismo, la capsaicina y ABA mostraron efecto negativo al inhibir la geminación en relación al testigo en 37 y 74 %, respectivamente. En L. sativa, el efecto negativo se encontró a partir de la concentración 1.5 % con una disminución de 95 %, y llegó a 100 % con las concentraciones 2.5, 5 y 10 %. Por otra parte, la cap-saicina no mostró efecto fitotóxico en las semillas de esta especie. En contraste, ABA redujo la germinación 90 % en relación al testigo.En B. odorata fue contundente el efecto fitotóxico debido a que todas las concentraciones redujeron 100 % la germinación, del mismo modo que ABA, mientras que la capsaicina no ocasionó efecto tóxico. La respuesta del abatimiento de la germinación en I. purpurea se acentuó a medida que fueron mayores las concentraciones. Se registraron valores en la inhibición desde 27 hasta 97 % con las concentraciones 0.5 y 20 %, respectivamente (Cuadro 2). Capsaicina y ABA presentaron el mismo efecto que el observado con el extracto etéreo (Cuadro 1). Por lo tanto, A. hybridus y las malezas B. odorata e I. purpurea fueron las más afectadas por el extracto de diclorometano.
Longitud de raíz y longitud de la parte aérea
El extracto etéreo provocó menor crecimiento de la longitud de raíz (LR) y parte aérea de la plántula (LPA). Es decir, hubo efecto fitotóxico, especialmente por arriba del 5 % de concentración, particularmente en A. hybridus, L. sativa y B. odorata, como era de esperarse. El mayor crecimiento de la LR y de LPA se observó con el extracto etéreo en I. purpurea. En contraste, la capsaicina afectó negativamente sólo el crecimiento de LR y LPA de A. hybridus. En las especies restantes no se encontraron diferencias significativas con respecto al testigo.
Por otra parte, todos los tratamientos del extracto de diclorometano afectaron el vigor (LR y LPA) de las cuatro especies. El extracto causó efectos negativos desde 0.5 % de concentración en la longitud de la raíz y en la longitud de la parte aérea en todas especies (Cuadro 5 y 6). Los daños se caracterizaron por la presencia de raíces primarias con hendiduras raquíticas o ausentes, atrofiadas o ahiladas, hipocotilos y cotiledones cortos, gruesos o deformados, plántulas que en condiciones de campo no podrían sobrevivir. La falta de desarrollo o daño de la radícula es importante ya que una plántula normal requiere de una raíz fuerte que pueda penetrar al suelo con el fin de tener buen anclaje para seguir desarrollándose y formar una planta (Rice, 1984).
DISCUSIÓN
El potencial de los productos naturales usado por sus propiedades biológicas particulares como herbicidas, plaguicidas, antibióticos, inhibidores o estimulantes de crecimiento es prácticamente inagotable. Aunque en la búsqueda de nuevos herbicidas, los estudios con extractos orgánicos permiten extraer mayor diversidad de metabolitos, en algunos casos con mayor potencial fitotóxico que las mezclas. Éstos pueden servir de modelo para la síntesis de nuevos fitotóxicos naturales o para evaluar su actividad alelopática.
En este estudio, la capsaicina no afectó la germinación de las semillas de L. sativa, I. pupurea y B. odorata. No obstante, se encontraron diferencias estadísticas entre el alcaloide y las concentraciones de ambos extractos en el número de semillas germinadas (NSG) de A. hybridus (Cuadros 1 y 2). El efecto fitotóxico del alcaloide se manifestó con la inhibición del desarrollo de tejido radicular (Cuadros 3 y 5), misma tendencia que se encontró en el crecimiento de la LPA (Cuadros 4 y 6). Las diferencias en el NSG observadas en A. hybridus, en comparación con las especies restantes, coinciden con lo descrito por Chou y Yang (1982), quienes señalan que hay diferencias en el desarrollo radicular y en la germinación, lo que se debe a diferencias entre variedades y especies (Zárate et al., 2006; Pérez Leal et al., 2005).
]]> La reducción del crecimiento de la radícula y parte aérea puede ser debida a que la capsaicina afecta los procesos de división y elongación celular, tal como se ha observado con otros metabolitos (Besnier, 1989; Rice, 1984), y alcaloides (Zárate Hernández et al., 2006), aunque no se descartan las causas genéticas o ambientales. Cuando el efecto de un alelopático producido por una planta se manifiesta a través de la inhibición del crecimiento radicular, significa que se está afectando de manera específica a diversos organelos celulares relacionados con el funcionamiento de mitocondrias (respiración), cloroplastos (fotosíntesis), meristemos primarios y secundarios (división y elongación celular), propiedades de las membranas, cinética enzimática, síntesis de proteínas, estructura cromosómica, etc. (Anaya et al., 1992).Las diferencias observadas en el porcentaje de germinación, LR y LPA, en las especies afectadas por los extractos etéreo y de diclorometano se deben posiblemente a la variación en la composición y concentración de los metabolitos (capsaicina y otros capsaicinoides) presentes en las mezclas. El análisis por cromatografía de capa fina permitió detectar a la capsaicina en ambos extractos, y en mayor proporción en el extracto de diclorometano, debido a la alta afinidad en la polaridad de la capsaicina por el disolvente, lo cual podría explicar el mayor efecto del extracto en el crecimiento de las plántulas. Las diferencias encontradas entre el extracto y el alcaloide también pueden ser atribuidas a una acción sinérgica de los componentes involucrados y a la concentración de los diferentes alcaloides. Por lo tanto, estos factores pueden afectar la capacidad de penetración en la semilla y al tejido, o la dispersión y acumulación en los compartimentos intracelulares, lo que altera la germinación y crecimiento de plántula (Pérez Leal et al., 2005). Un efecto sinérgico similar de fitotoxicidad se observó en los extractos de Calia secundiflora y el alcaloide citisina en A. hybridus y L. sativa (Zárate Hernández et al., 2006).
La respuesta diferencial entre especies a los diversos tratamientos obedece a que la actividad biológica de extractos o compuestos no sólo depende de su naturaleza química, de su concentración y proporción de sus componentes, sino también de la sensibilidad de la planta receptora y del proceso metabólico implicado (Anaya et al., 1992). Es decir, que la interferencia de los alelopáticos con los procesos metabólicos es diversa, lo que implica una gran variedad de modos de acción.
Los mecanismos que explican las propiedades fitotóxicas de numerosos tipos de alcaloides (Aniszewski, 2007; Einhelling, 2002; Doan et al., 2000; Wink et al., 1999), en particular los del tipo quinolizidínicos, han sido estudiados (Wink, 1983). Aunque estos metabolitos afectan a un amplio espectro de organismos, no se descarta su interacción en los mismos sitios en las células vegetales (Einhelling, 2002), promoviendo la inhibición de la reproducción celular (Waller y Einhelling, 1999) del ADN, ARN, algunas enzimas (Wink y Laitz Bruning, 1995) y la biosíntesis de proteínas. Además, afectan la permeabilidad de las membranas y perturban su estabilidad (Wink et al., 1999; Liu y Lovett, 1993).
CONCLUSIONES
El extracto de diclorometano causó el mayor efecto fitotóxico sobre la germinación de las cuatro especies, particularmente en A. hybridus y L. sativa a partir de 2.5 % de concentración, y 0.5 % en B. odorata, en las que el porcentaje se redujo hasta 100 %. Asimismo, afectó negativamente la expresión del vigor de I. purpurea desde 0.5 % de concentración, particularmente la longitud de la parte aérea de plántula.
El extracto de etéreo abatió la germinación de A. hybridus y B. odorata con 5 % o más de concentración, y en L. sativa con 10 %. Del mismo modo, la longitud de raíz y longitud de la parte aérea de plántula fueron afectados negativamente en todas las especies. I. purpurea fue la menos susceptible, mientras que en A. hybridus se observó mayor suceptibilidad.
El efecto fitotóxico de la capsaicina sobre la germinación y vigor sólo se manifestó en A. hybridus.
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