Aspectos clínicos y de diagnóstico de la gnatostomosis experimental canina

Clinical and diagnostic aspects of experimental canine gnathostomosis

César Álvarez-Guerrero* Marco Antonio Muñoz-Guzmán** Fernando Alba-Hurtado**

* Departamento de Parasitología, Secretaría de Investigación y Posgrado, Universidad Autónoma de Nayarit, Ciudad de la Cultura Amado Nervo s/n, Tepic, Nayarit, 63155, México.

Responsable de correspondencia:
Fernando Alba-Hurtado,
Tel: +52 (55) 56 23 19 99, ext. 39411,
correo electrónico: fealba@hotmail.com

Recibido el 10 de febrero de 2011
Aceptado el 20 de septiembre de 2011.

Stages of the parasite were detected in the gastric wall of four female dogs infected with Gnathostoma binucleatum larvae. One showed a nodule with adult worms inside, two had nodules with larvae and the other one had juvenile stages without nodules. Pre-patent period in the bitch with adult worms was 22 weeks and patent period was 14 weeks. Egg morphology and clinical profile were described. In the bitch with adult worms, a 57 x 24 mm cavernous mass was detected by ultrasonography in the stomach wall and by endoscopy the mass was detected projecting into the gastric lumen. Antibodies against larvae antigens increased (P < 0.05) after the second pi month; Western blot showed a sequential recognition of the antigens. Results provide useful data for canine gnathostomosis diagnosis.

Key words: gnathostoma, canine gnathostomosis, diagnosis, antigens, ELISA, dog.

Resumen

En 4 perras infectadas con larvas de Gnathostoma binucleatum se detectaron fases del parásito en pared gástrica. Una presentó un nódulo con gusanos adultos en el interior, 2 presentaron nódulos con larvas y la otra presentó fases juveniles sin nódulos. El periodo de prepatencia en la perra con gusanos adultos fue de 22 semanas y el de patencia de 14 semanas. Se realizó la descripción de la morfología del huevo y del cuadro clínico. En la perra con gusanos adultos se detectó, por ultrasonografía, una masa cavernosa de 57 x 24 mm en la pared del estómago, y por endoscopia, se observó la proyección de esta masa hacia el lumen gástrico. Los niveles de anticuerpos contra antígenos de larvas aumentaron (P < 0.05) a partir del segundo mes pi, el Western blot mostró un reconocimiento secuencial de los antígenos. Los resultados obtenidos aportan datos útiles para el diagnóstico de la gnatostomosis canina.

Palabras clave: gnathostoma, gnatostomosis canina, diagnóstico, antígenos, ELISA, perro.

Introducción

La gnatostomosis es una zoonosis producida por la presencia y acción de larvas de Gnathostoma sp; la única especie confirmada en América que afecta a humanos es G. binucleatum.^1,2 Esta enfermedad es uno de los principales problemas de salud pública en algunas regiones del mundo, por ejemplo, en el estado de Nayarit, México, se registraron entre 1995 y 2005, 6328 casos humanos.³ Se considera que los primeros hospederos intermediarios de todas las especies de Gnathostoma sp son copépodos y se ha demostrado que peces estuarinos de las especies Cathorops fuerthi, Pomadasys macracanthus, Mugil curema y Dormitator latifrons y las tortugas de las especies Kinosternum integrum y Trachemys scripta actúan como segundos hospederos intermediarios y paraténicos, respectivamente, de G. binucleatum.⁴ El papel de los mamíferos carnívoros (ictiófagos) como hospederos definitivos en la dinámica del ciclo biológico de las diferentes especies de Gnathostoma en una región determinada, ha sido ampliamente documentado; estos hospederos eliminan huevos del parásito en sus heces, las cuáles pueden contaminar los cuerpos de agua infestando a los primeros hospederos intermediarios y posteriormente a los peces que sirven de alimento a otros hospederos entre los que se encuentran los humanos.^5-7

Material y métodos

Animales de experimentación

Se utilizaron 4 perras de 2 a 4 meses de edad, clínicamente sanas y de raza no definida. Antes del inicio del experimento se les realizó una desparasitación preventiva con prazicuantel, pamoato de pirantel y febantel,* por vía oral, externamente les aplicó 2-metiletoxifenil carbamato* y se inmunizaron contra moquillo y parvovirus. Las perras se mantuvieron en jaulas individuales dentro del bioterio de la Dirección de Investigación y Posgrado de la Universidad Autónoma de Nayarit, México. Antes del experimento ningún animal presentaba huevos de helmintos en heces o parásitos externos. La limpieza se realizó diariamente y se alimentaron con productos balanceados comerciales y agua ad libitum. Este estudio fue aprobado por el Subcomité Interno para el Cuidado de Animales en Experimentación (SICUAE), del Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal de la UNAM.

Obtención de larvas 3 de estadio avanzado (L3Av)

Las L3Av de Gnathostoma binucleatum se aislaron de 30 tortugas de la especie Kinosternon integrum capturadas en localidades pesqueras aledañas a la laguna de Agua Brava, ubicadas en la zona norte del estado de Nayarit, México. Se diseccionó el tejido muscular de las tortugas, se molió en una picadora casera, se comprimió entre dos cristales de 15 cm de ancho por 18 cm de largo y se observó a contra luz de una lámpara de 100 watts. Las L3Av encontradas se separaron con agujas entomológicas, se verificó la integridad del quiste y se contaron para preparar los inóculos.⁴ Para la identificación de las larvas se utilizaron las variables recomendadas por Miyazaki.⁹

Diseño experimental

Las 4 perras recibieron por vía oral aproximadamente 50 L3Av mezcladas en 50 g de carne molida de pescado (albóndiga). Diariamente se recolectó toda la materia fecal para buscar estructuras parasitarias y se realizó una minuciosa revisión clínica de las perras. Mensualmente se obtuvo por punción venosa, sangre de las perras, el suero se almacenó a -20ºC para determinar por ELISA los títulos de anticuerpos, y por Western blot (WB), los antígenos reconocidos. Para detectar la presencia de nódulos gástricos in vivo, en la semana 32 se le realizó una ultrasonografía (USG) abdominal y una endoscopia gástrica. Las perras fueron sacrificadas a los 7, 9 y 13 meses pi con una sobredosis de pentobarbital sódico. En la necropsia se extrajo el estómago (sitio donde se desarrolla el parásito adulto) y se revisó en forma macroscópica la pared, en busca de nódulos y parásitos. En las perras en las que no se encontró ningún nódulo macroscópico, se realizó una digestión artificial de la pared gástrica para buscar por microscopía, larvas o parásitos juveniles que no hubieran producido nódulos. Se verificó la especie de un adulto por la amplificación del espaciador interno del DNA ribosomal (ITS2) por la técnica PCR descrita por Martínez-Salazar y León-Regagnon.¹⁰

Exámenes parasitológicos

Identificación de nódulos gástricos in vivo

Para la identificación de nódulos gástricos en los animales infectados, se realizaron estudios por USG abdominal y endoscopía gástrica. Para la USG se depiló la región abdominal en los animales, se aplicó un gel conductor y con un transductor convexo, se realizaron barridos multidireccionales en la búsqueda de nódulos. Para la endoscopía, previo ayuno de 12 horas, los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico, se colocó un abre bocas y se introdujo una extensión (lente) conectada a un equipo de cómputo, los nódulos se detectaron por rastreos de la mucosa gástrica.

Obtención de antígenos

Los antígenos parasitarios se obtuvieron a partir de aproximadamente 250 L3Av de G. binucleatum (Ag-L3Av) y de un gusano adulto (Ag-GA) obtenido de un nódulo gástrico. Los parásitos se lavaron tres veces en solución salina fisiológica estéril con antibióticos (penicilina 10000 UI, estreptomicina 100 µg/ml y anfotericina B 10 µg/ml)** y se maceraron en un mortero en nitrógeno líquido y una mezcla de inhibidores de proteasas (aprotinina 10 µg/ml, leupeptina 10 µg/ml, iodoacetamida 1.8 mg/ml y PMSF 1 mM)*** hasta la obtención de una pasta homogénea sin fragmentos identificables. Posteriormente el macerado se centrifugó por una hora a 4000 g a 4°C y el sobrenadante se filtró con membrana de 0.22 µm y se conservó a -20°C hasta su utilización.¹² La cantidad de proteína total fue determinada por el método de Bradford.¹³

ELISA

Los niveles de anticuerpos séricos contra los Ag-L3Av o Ag-GA se midieron por ELISA y éstos se estandarizaron probando diferentes diluciones de antígeno, suero y conjugado. La concentración óptima fue de 10 µg/ml para ambos antígenos, la dilución del suero fue de 1:320 para el Ag-L3Av y de 1:80 para el Ag-GA y el conjugado con peroxidasa**** fue diluido 1:5000 para ambos antígenos. La lectura de la placa se realizó a 492 nm en un lector de ELISA.**** Cada suero se probó por duplicado y la reacción inespecífica fue eliminada mediante la utilización de pozos adyacentes sin antígeno, en los que la absorbancia obtenida se restó a la obtenida en los pozos con antígeno.¹² Los resultados conseguidos en unidades de densidad óptica (DO) se promediaron y posteriormente se transformaron en valores porcentuales de absorbancia (%Abs) con respecto a un control positivo mediante la siguiente fórmula:

WB

Los antígenos se separaron en geles SDS-PAGE al 10% usando un equipo de electroforesis****** y las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia semiseca† de acuerdo con el método descrito por Magnaval et al.¹⁴ La membrana de nitrocelulosa se cortó en tiras de 4 mm, y fueron incubadas con los sueros de las perras infectadas diluidos 1:10 en una solución de TBS/leche descremada al 5% durante dos horas. Posteriormente, las membranas se lavaron cinco veces con PBS con 0.02% de Tween 20. Las membranas lavadas se incubaron en agitación constante por 2 horas con un anticuerpo anti-IgG canino conjugado con peroxidasa******* a una dilución 1:500. Posteriormente, se lavaron las membranas y se revelaron las bandas con 4-Cloro-Naftol 0.05% en una solución de metanol al 16%, peróxido de hidrógeno al 0.01% y TBS 100 mM a pH 7.5 en cámara oscura.^15,16

Los resultados de la cinética de anticuerpos se analizaron por ANDEVA de una vía para muestras repetidas, utilizando el software Statistica for Windows ver. 7.0. Se utilizó la prueba de Dunnett para hacer las comparaciones entre los promedios de cada muestreo con respecto al momento cero de la infección.

Resultados

En las cuatro perras inoculadas con L3Av de G. binucleatum se detectaron fases del parásito en estómago. Una presentó un nódulo en la pared gástrica con gusanos adultos en el interior, dos presentaron nódulos en la pared gástrica con larvas en su interior, y la otra presentó fases juveniles sin nódulos en la pared gástrica.

La perra con gusanos adultos eliminó huevos del parásito en materia fecal; la eliminación empezó en la semana 22 pi y se mantuvo hasta la semana 36 pi (Figura 1). Durante la semana 30 pi se eliminó la mayor cantidad de huevos (3542 hgh). En la materia fecal de esta misma perra se detectaron 5 hembras adultas sin huevos en útero las semanas 24, 25, 26, 28 y 36 pi.

Los huevos observados eran de color amarillo verdoso a café oscuro, ovalados, con una doble capa transparente, en uno de los extremos presentaban un opérculo y en su interior de uno a dos blastómeros; conforme pasó el tiempo, una vez eliminados, se desarrollaron de 6 a 16 blastómeros, incluso se pudo observar el desarrollo de una larva en su interior. Los huevos midieron de 56-79 × 35-43 µm (Figura 2).

Clínicamente, las perras infectadas mostraron náuseas y vómito durante las dos primeras semanas pi; posteriormente presentaron dolor abdominal a la palpación y postración durante los dos o tres primeros meses pi, después los animales presentaron apatía, disminución en el consumo de agua y alimento, y ligera disminución de peso.

Los niveles promedio de anticuerpos contra Ag-L3Av en estos animales, aumentaron significativamente (P < 0.05) a partir del segundo (100.56 ± 57.79 %Abs) y hasta el quinto mes pi (166.77 ± 54.89 %Abs), con respecto al momento de la infección en el mes cero (17.72 ± 14.90 %Abs). Los niveles de anticuerpos contra Ag-GA no mostraron diferencias estadísticas (P > 0.05) entre los diferentes meses del muestreo.

En geles SDS-PAGE se detectaron 21 bandas proteínicas en los Ag-L3Av y 18 bandas proteínicas en los Ag-GA. Por WB, los sueros de las perras infectadas mostraron un reconocimiento secuencial de Ag-L3Av (Figura 3). En el momento de la infección (mes cero) no reconocieron ningún antígeno, en el primer mes pi, 3 antígenos (28, 32 y 36 kD); en el segundo mes pi, 11 antígenos (19, 24, 28, 32, 36, 43, 52, 57, 82, 99 y 150 kD); en el tercer mes pi, 14 antígenos (17, 19, 21, 24, 28, 32, 36, 43, 52, 57, 66, 82, 99 y 150 kD); en el cuarto y quinto mes pi, 11 antígenos (24, 28, 32, 36, 43, 52, 57, 66, 82, 99 y 150 kD); del sexto al octavo mes pi, 10 antígenos (28, 32, 36, 43, 52, 57, 66, 82, 99 y 150 kD) y el noveno mes pi, sólo 5 antígenos (28, 32, 36, 43 y 52 kD). Con respecto a los Ag-GA, los sueros de todas las perras reconocieron el mes cero, 4 antígenos (36, 99, 150 y 250 kD) y en el primer mes pi, 5 antígenos (36, 99, 130, 150 y 250 kD). Únicamente el suero de la perra con gusanos adultos reconoció el segundo y tercer mes pi, 10 antígenos (28, 30, 36, 40, 52, 66, 99, 130, 150 y 250 kD), y del cuarto al quinto mes pi, 4 (36, 130, 150 y 250 kD).

La USG mostró una masa sólida de forma ovalada de 5.7 × 2.4 cm en la pared del estómago (Figura 4a) y por endoscopia se observó proyección de esta masa hacia el lumen gástrico (Figura 4b).

En la necropsia a la perra que eliminó huevos, se encontró en la curvatura mayor del estómago, un nódulo fibroso de aproximadamente 6 cm de diámetro (Figura 4c) y con una fuerte vascularización. El nódulo presentaba internamente cavernas que tenían comunicación a la cavidad abdominal y al lumen gástrico. Las cavernas contenían una secreción muco-sanguinolenta en donde se encontraron 6 machos adultos y huevos en diferente fase de evolución (inmaduro, embrionado y larvado). El líquido peritoneal era de color rojizo y probablemente fue secretado por el nódulo.

En dos de las perras que no eliminaron huevos en heces, en la pared gástrica de cada una se encontró un nódulo de 1 a 2 cm de diámetro con cinco fases juveniles dentro. De una de las perras que no eliminó huevos y no presentó nódulos gástricos se recuperaron 5 parásitos juveniles durante la digestión artificial de la pared gástrica. Las 4 perras presentaron a la necropsia, atrofia muscular, hepatomegalia, esplecnomegalia, linfangitis mesentérica, pancreatitis, hipertrofia gástrica, gastritis crónica y pequeñas úlceras en la mucosa gástrica (Figura 4d).

Discusión

En el presente estudio, 3 de las 4 perras infectadas desarrollaron fases juveniles del parásito y una desarrolló fases adultas, con eliminación continua de huevos en las heces. El periodo de prepatencia observado en la perra que eliminó huevos en heces fue de 22 semanas y el periodo de patencia de 14 semanas. Se han observado periodos largos de prepatencia en otros espiruloideos como Gnathostoma spinigerum, el cual es de 14 semanas.¹⁸ En las perras que tuvieron gusanos juveniles vivos en nódulos o pared gástrica, probablemente hubieran desarrollado gusanos adultos, de haber permanecido más tiempo en el hospedero; sin embargo, no existe ningún antecedente que pueda explicar por qué el rango de prepatencia es tan amplio en gusanos que pertenecen a la misma especie. Por ejemplo, en Spirocerca lupi el rango de prepatencia es de 3 a 9 meses.¹⁹

Los huevos observados tienen características particulares que les permiten distinguirlos de otros nematodos que eliminen huevos en materia fecal. La presencia de un gran opérculo en un extremo los diferencia fácilmente de huevos que no presentan opérculos como los de Toxocara canis, Toxascaris leonina, Spirocerca lupi y Ancylostoma sp o de huevos con doble opérculo como Trichuris vulpis.²⁰ El diagnóstico coproparasitoscópico demostró ser efectivo para la detección de gusanos adultos en intestino. Sin embargo, este tipo de diagnóstico no fue efectivo durante las primeras 22 semanas de infección en la perra con gusanos adultos, ni en las perras que únicamente presentaron juveniles en pared gástrica, aun cuando en ambos casos había manifestaciones clínicas evidentes.

El cuadro clínico es inespecífico y se puede confundir con otras patologías, como la presencia de cuerpos extraños en el estómago o de nódulos de Spirocerca lupi, que principalmente se localizan en la pared del esófago y ocasionalmente en estómago y tráquea.¹⁹ Estas patologías se han asociado con disminución en el consumo de alimento, vómito, regurgitación y pérdida de peso, lo que también se observó en las perras infectadas con G. binucleatum. La excitabilidad constante que se observó en la perra con gusanos adultos pudo ser producida por la migración errática de alguna larva al cerebro, como se ha demostrado en otras especies de Gnathostoma,^5,6 o también es probable que sea el resultado del dolor abdominal persistente producido por el nódulo.

La USG y la endoscopia mostraron ser eficaces para la detección del nódulo maduro, sobre todo en la USG se evidenció la presencia de las cavernas llenas de líquido; sin embargo, probablemente por el tamaño y la ausencia de cavernas internas, no se pudieron detectar nódulos pequeños o fases juveniles en la pared gástrica. Si bien estas técnicas podrían ser útiles para el diagnóstico diferencial de la gnatostomosis canina con otras patologías, la ausencia de evidencia ultrasonográfica o endoscópica no necesariamente indica la ausencia del parásito. Por lo anterior, el uso de otras pruebas de gabinete más sensibles, como radiología y tomografía axial computarizada, deben ser evaluadas para su posible utilización.

Las perras infectadas presentaban nódulos en la pared gástrica, estas lesiones se han registrado en la mayoría de los hospederos definitivos de las 14 especies de Gnathostoma identificadas en el mundo.^5,6 Se observó que la perra que eliminó huevos en materia fecal también eliminó hembras adultas, y a la necropsia, se encontraron machos incrustados en la pared del nódulo. La razón de estos resultados no es clara, pero probablemente se debió a que las hembras que terminaron de producir huevos agotaron sus reservas metabólicas y murieron. La observación del útero totalmente vacío en las hembras eliminadas y la pérdida de coloración del pseudoceloma parecen confirmar el agotamiento biológico.

Los niveles de anticuerpos contra la fase larvaria del parásito aumentaron significativamente en las perras a partir del segundo mes pi y se mantuvieron elevados hasta el quinto mes pi; sin embargo, los niveles de anticuerpos contra la fase adulta no tuvieron un incremento significativo. Esta diferencia pudo deberse a que la estimulación antigénica de la fase larvaria fue más temprana y más intensa, debido al número de larvas inoculadas a cada animal (alrededor de 50) y a que no todas las perras estuvieron expuestas a los antígenos de la fase adulta, puesto que sólo en una de las perras infectadas se logró recuperar fases adultas del parásito. Además, en ésta, los gusanos adultos estaban parcialmente aislados del sistema inmune por encontrarse dentro del nódulo. Estos resultados son alentadores para el uso de ELISA como prueba de diagnóstico inmunológico que pueda aplicarse de manera masiva a una población canina numerosa; sin embargo, antes de ello se deben resolver dos problemas: es necesario evaluar la especificidad de la prueba mediante ensayos de reacción cruzada con otros helmintos comunes en perros y, obtener el antígeno suficiente para realizar estas pruebas.

El WB demostró un reconocimiento secuencial tanto de Ag-L3Av como de Ag-GA. Los sueros reconocieron 3 antígenos de las larvas el mes 1 pi, el número de antígenos aumentó hasta el tercer mes pi, donde se reconocieron 14 antígenos, a partir de este mes, el número de antígenos reconocidos disminuyó hasta el noveno mes pi, donde se reconocieron sólo 5 antígenos. Este reconocimiento secuencial sugiere que las larvas dentro del hospedero experimentan cambios antigénicos asociados con su estadio o, que exponen diferentes antígenos al sistema inmune del hospedero a través del tiempo, lo que puede estar asociado con mecanismos de inmunoevasión. La disminución de antígenos reconocidos a partir del cuarto mes pi probablemente es el resultado de su disminución en el hospedero, debido a los cambios de estadio larvario del parásito o a su aislamiento parcial dentro de nódulos en pared gástrica. Por otra parte, el reconocimiento permanente de 5 antígenos del parásito (28, 32, 36, 43 y 52 kD), hace suponer que éstos pueden ser buenos candidatos para la estandarización de pruebas de inmunodiagnóstico, en las cuales se detecten antígenos del parásito en cualquier momento de la infección; para confirmarlo se requiere realizar pruebas de reacción cruzada con otros parásitos, para evaluar la especificidad de estos antígenos. En infecciones experimentales con otros helmintos como Toxocara canis, Nippostrongylus brasiliensis y Trichinella spiralis también se ha observado en sus hospederos el reconocimiento secuencial de antígenos.^21-23 Lo anterior sugiere que este fenómeno es importante para la sobrevivencia o permanencia de los nematodos en el hospedero.

Los Ag-GA demostraron una menor especificidad debido a que el suero de las perras antes de ser expuestas al parásito (mes cero pi) reconocieron hasta 4 antígenos, y aunque el número de antígenos reconocidos aumentó a diez en los meses 2 y 3 pi, el número disminuyó durante los meses 4 y 5 pi, quedando otra vez sólo cuatro antígenos. La evidente inespecificidad de estos antígenos los descarta como una opción viable para el inmunodiagnóstico en perros.

En general, se considera que los mejores antígenos de nematodos útiles para el inmunodiagnóstico son los de secreciones y excreciones de larvas. Utilizando antígenos de este tipo, se ha encontrado que los humanos reconocen un antígeno de 120 kD, y los ratones, 3 antígenos de 80, 120 y 208 kD de G. binucleatum.²⁴ En el presente estudio se detectó un mayor número de antígenos; sin embargo, hay que tomar en cuenta que se utilizó un antígeno somático y que el hospedero es diferente; por lo tanto, la migración y comportamiento biológico del parásito también, lo que seguramente repercute en el reconocimiento antigénico.

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Notas

Este trabajo es parte de la tesis doctoral de César Álvarez-Guerrero que obtuvo el grado dentro del Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias de la Producción y de la Salud Animal de la UNAM.

*Drontal Plus® Bayer, Alemania.

**Bolfo® Bayer, Alemania.

***Antibiótico-Antimicótico, In vitro, México.

****Protease inhibitor Cocktail, sigma, Estados Unidos de América.

*****Sheep anti-canine lgG HRP, Serotec, Reino Unido.

******Multiscan, Ascent, Estados Unidos de América.

†Transblot SD Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad, Estados Unidos de América.