Proteínas de estrés en Lemna gibba (Lemnaceae) expuesta al boro

Stress proteins in Lemna gibba (Lemnaceae) exposed to boron

Mayra Sánchez Villavicencio,² Humberto González Márquez¹ y María Guadalupe Miranda Arce²

¹ Departamento de Ciencias de la Salud. División de Ciencias Biológicas y de la Salud (CBS). Universidad Autónoma Metropolitana (UAM)-Iztapalapa. Av. San Rafael Atlixco No.186 Col. Vicentina, Iztapalapa, D. F. 09340. México

Recibido: 31 de mayo del 2011.
Aceptado: 27 de julio del 2012.

RESUMEN

Lemna gibba Linneo, es una planta vascular acuática que vive en ambientes de agua dulce. Esta planta ha sido recomendada para estudios de contaminación debido a su crecimiento exponencial, a su pequeño tamaño que la hace de fácil manejo en el laboratorio, así como por su resistencia a la exposición de contaminantes. El boro es un micronutriente esencial para las plantas, sin embargo, en concentraciones elevadas puede limitar su crecimiento y alterar su metabolismo. El presente estudio describe los patrones electroforéticos monodimensionales y bidimensionales de las proteínas solubles totales de L. gibba en ausencia y presencia de boro en forma de H₃BO₃, en concentraciones de 0 a 500 ppm. Los resultados indicaron diferencias en la expresión proteínica de L. gibba dependiendo de la concentración de exposición al boro. Las técnicas utilizadas se modificaron para L. gibba, debido a que éstas eran específicas para plantas de brócoli y pueden ser empleadas como pruebas complementarias en el monitoreo ambiental.

Palabras clave: Boro, estrés, Lemna gibba, proteínas.

ABSTRACT

Key words: Boron, Lemna gibba, proteins, stress.

INTRODUCCION

Las proteínas producidas por estrés han cobrado gran importancia como biomarcadores ambientales, ya que ellas tienen ciertas ventajas sobre métodos analíticos que se utilizan para calcular niveles de contaminación que afectan a poblaciones de organismos expuestos. Los métodos analíticos requieren más tiempo de trabajo y en general son más costosos, además de no poder predecir eficientemente el daño causado en casos agudos de toxicidad en concentraciones altas de un contaminante. Estas pruebas tienen un grado de sensibilidad más bajo en comparación con otros biomarcadores, ya que no se obtienen respuestas en exposiciones crónicas en dosis más bajas (Johan, 2000). El uso de biomarcadores moleculares permite una detección más temprana que con los biomarcadores tradicionales (patología tisular, fallas reproductivas, mortalidad en masa o pérdida de la diversidad de especies). Esta nueva aproximación al monitoreo puede integrarse a las ya tradicionales pruebas físicas, biológicas y químicas para una mejor detección y manejo de cambios ambientales. Los biomarcadores proveen evidencia de los organismos que han sido expuestos, ó afectados por agentes xenobióticos, mostrando cambios bioquímicos, histológicos, morfológicos y fisiológicos en todo el organismo y se han complementado para reconocer cambios a nivel celular y molecular con biomarcadores de ácidos nucleicos y proteínas (Ryan & Hightower, 1996). Los cambios en la fisiología tanto subcelular como celular y de los organismos completos se relacionan directamente con los agentes estresantes que los inducen y se han clasificado en: respuestas adaptativas, que prevén el daño, respuestas de daño subletal y respuestas de daño letal (Ryan & Hightower, 1996). Las respuestas adaptativas y de daño subletal se pueden evaluar a través de biomarcadores de efecto y biomarcadores de exposición (Sanders, 1990). Los biomarcadores de efecto forman parte de las respuestas que previenen el daño celular mediante mecanismos de desintoxicación y revelan las lesiones subletales que se originan por la incapacidad de las defensas. Los biomarcadores de exposición valoran las dosis a las que se trata a los organismos. Por último, las respuestas letales implican efectos de necrosis o de apoptosis, cuando los mecanismos de protección y corrección fallan o bien son rebasados (Ryan & Hightower, 1996). La propuesta de utilizar proteínas de estrés como biomarcadores ambientales ha recibido atención recientemente, ya que los biomarcadores pueden utilizarse como medidas en cualquier nivel de organización, así como en poblaciones expuestas a contaminantes en su ambiente natural o bien en cultivos celulares y tejidos vegetales o animales experimentalmente expuestos a estrés físico o químico (Fossi & Leonzio, 1994) Estas medidas proporcionan un índice más sensible de exposición a efectos adversos subletales producidos por químicos tóxicos o bien a una exposición prolongada de algún químico fitotóxico, como es el caso del boro. En niveles altos de organización biológica (tejidos, órganos, o bien el organismo en general), las proteínas de estrés influyen en cambios en el metabolismo, en su fisiología, morfología, histología e inmunología. A nivel molecular y niveles subcelulares de organización, hay primordialmente cambios en ácidos nucleicos (Sanders, 1990; Huggett et al., 1992). La selección apropiada de biomarcadores así como el estudio de la reparación de daño causado por tóxicos en ambientes naturales pueden generar información valiosa para la conservación de distintos ecosistemas. Entre los biomarcadores ambientales se destacan las proteínas de estrés ya que cumplen con las características que permiten realizar estudios específicos en organismos expuestos directamente a gran número de contaminantes. Las proteínas de estrés forman parte de la respuesta celular de protección, su síntesis es inducida por la presencia de un gran número de químicos y se encuentran presentes desde bacterias hasta plantas y animales superiores. Bajo condiciones normales, la mayoría de las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular (sHsps) no son detectables en tejidos vegetales, pero se producen rápidamente como respuesta a un choque térmico lo que indica una situación de estrés (Sun et al., 2002). Todo esto depende de la temperatura y la duración del periodo de estrés (Howarth, 1990, 1994). Después de este periodo las sHsps se estabilizan llegando a tener una vida media de 30-50 h, lo que sugiere que tienen un papel importante en la recuperación (Chen et al., 1990; DeRocher & Vierling, 1994; Waters et al., 1995, 1996). Hasta este estudio no se encontraron antecedentes de proteínas de estrés con relación al boro.

El boro (B) es un micronutriente esencial para las plantas, necesario para la división celular, la síntesis de la pared celular, la translocación de azúcares, la síntesis proteínica y también para las funciones de las membranas (Pilbeam & Kirkby, 1983; Marshner, 1995; Blevins & Lukaszweski, 1998). Sin embargo, en concentraciones elevadas puede limitar su crecimiento y alterar su metabolismo general debido a que el nivel mínimo de boro que satisface el requerimiento esencial del mismo no está muy alejado de su umbral de toxicidad (Gupta et al., 1985; Larsen, 1988; Camacho et al., 2003). La fitotoxicidad asociada al boro puede manifestarse por exposiciones a suelos con elevados contenidos de sales de borato, a una fertilización excesiva con minerales de boro, a irrigación con agua de alta concentración de boro y a la reutilización de líquidos residuales provenientes de industrias que utilizan boratos para sus productos. La absorción del boro está asociada al pH (el óptimo es de 7), al contenido de materia orgánica, al intercambio iónico, a la humedad, la temperatura y la textura del suelo. Todos estos factores establecen un equilibrio entre el boro absorbido y el boro en disolución (Bundschuh, 1992). Una de las fuentes principales de boro es el agua de irrigación. El boro aplicado a través de esta fuente tarda un tiempo considerable en alcanzar el equilibrio, por lo que durante los primeros años de irrigación, la concentración de boro en agua y suelo es relativamente baja (Larsen, 1988; Martínez et al., 1999). Los síntomas de toxicidad al boro en plantas se manifiestan con una clorosis, seguida por necrosis en los bordes de las hojas. Por lo tanto, el análisis foliar es utilizado para el diagnóstico de fitotoxicidad. Se ha reportado que el máximo de boro tolerado por algunos cultivos es de hasta 100 ppm (Nable et al., 1997; Mass, 1984; ATSDR, 1992).

Las plantas vasculares acuáticas también llamadas macrófitas han sido utilizadas para remover distintos compuestos tóxicos del agua, como son el Cd, As, Hg, Cu, Cr, Pb (Culley & Epps, 1973; Rodgers et al., 1978; Chigbo et al., 1982; Charpentier et al., 1987; Benda & Kouba, 1991). Entre estas plantas destacan las pertenecientes a la familia Lemnaceae por ser de fácil cosecha ya que llegan a medir de 1.5 a 2.5 cm y crecen la mayoría de las especies sólo sobre la superficie del agua (Landolt, 1987).

En la familia botánica antes mencionada se ubica Lemna gibba Linnaeus, que ha resultado ser un excelente modelo experimental debido a que su manejo es fácil, se encuentra ampliamente distribuida en México, es de alta productividad, tolerante a condiciones naturales adversas, fácil cosecha y tiene un ciclo de vida corto; es una planta utilizada muy frecuentemente para pruebas de toxicidad en el monitoreo de ecosistemas acuáticos, y ha llegado a ser considerada un bioindicador (Wang, 1990).

El objetivo del presente estudio fue caracterizar las proteínas de estrés que L. gibba expresa en respuesta a la presencia de boro, a nivel de bioensayo en laboratorio, adaptando las técnicas para: proteínas solubles, perfil proteínico monodimensional y bidimensional y auto-radiografía de geles bidimensionales para proteínas marcadas radioactivamente.

Material biológico. Los ejemplares de Lemna gibba se colectaron en el Canal Nacional en Xochimilco (Barrio Caltongo, D.F.) Las plantas se lavaron con agua corriente para ser liberadas de desechos. Se enjuagaron con agua destilada, y con cloro al 0.05% y se cultivaron axénicamente en medio Hoagland 1:20, en un período de aclimatación de una semana en el invernadero de la UAM-I, con un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, una intensidad de luz de 210 µE/m²/s y con temperatura controlada entre 25-29 °C. Posteriormente las plantas se cultivaron en vasos de precipitados de 600 ml en donde se colocó medio nutritivo antes mencionado con las concentraciones 0, 300, 400 ppm de boro (H₃BO₃) a pH 7. Para el perfil proteínico monodimensional solamente se usó las concentración de 500 ppm debido a que en las anteriores concentraciones no se evidenció respuesta. Se agregaron 6 g de planta a cada vaso. Para el marcaje radiactivo se usaron cajas de Petri con 5 ml de medio nutritivo con las diferentes concentraciones de B, agregando 2 g de planta a cada caja. Todos los bioensayos se hicieron por triplicado en las mismas condiciones de luz y temperatura señaladas anteriormente.

Extracción de las proteínas del tejido vegetal. Para cada muestra se tomó 1g de tejido fresco perfectamente libre de agua, que fue sumergido de 3 a 5 min en nitrógeno líquido y mantenido en congelación a -70 °C. Posteriormente las muestras se maceraron en un mortero con nitrógeno líquido hasta lograr un polvo fino, y en el mismo recipiente la muestra se homogeneizó con Tris-HCl 50 mM, a pH 8.0 en presencia de inhibidores de proteasas (Sigma catálogo P-9599 082k4061). Los ácidos nucleicos se precipitaron con sulfato de protamina 1mg/ml a 4 °C en agitación (López & Palton, 1991). El extracto se aclaró mediante centrifugaciones a 12,000 g durante 10 min. El sobrenadante se almacenó a -70 °C en alícuotas de 1 ml.

Las proteínas se cuantificaron por el método de Bradford (1976).

Precipitación de las proteínas y preparación de la muestra. Se tomaron 250-500 µl de extracto de proteínas de L. gibba (35 µg/µl de proteína). Se precipitó con 4 volúmenes de acetona fría y se dejó reposar durante 15 min a 4 °C. El precipitado se centrifugó a 13,000 g durante 10 min a 4 ºC. Se desechó el sobrenadante, el botón resultante se enjuagó con acetona al 70% hasta lograr un botón claro. Se calentó a 100 ºC con 40-50 µl de amortiguador de muestra (SDS 2% p/v, glicerol 19% p/v, 2-mercaptoetanol 5% v/v, azul de bromofenol al 0.01% p/v en Tris-HCl 62.4 mM pH 6.8) durante 2 min antes de colocarse en los geles de poliacrilamida (López & Palton, 1991).

Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. El gel de separación se preparó al 13%. Se mezclaron 5 ml de acrilamida al 30%, 2.34 ml de agua desionizada, 2.5 ml de buffer Tris-HCl 1.5 M a pH 8.8. Se agregaron 100 µl de SDS al 10%, 50 µl de APS al 10% p/v y 5 µl de TEMED. La cámara electroforética previamente preparada con separadores de 0.75 mm, se llenó con la mezcla anteriormente mencionada. Se añadieron tres gotas de isobutanol y se dejo polimerizar durante 1 h.

El gel de compactación se preparó al 4% con 1.33 ml de acrilamida al 30% p/v, 6.1 ml de agua desionizada, 2.5 ml de amortiguador Tris-HCl 0.5 M pH 6.8, y se desgasificó durante 15 min. Se agregaron 100 µl de SDS al 10%, 50 µl de APS al 10% y 10 µl de TEMED. Los geles monodimensionales se fijaron en una solución de ácido acético al 10% v/v, etanol al 40% v/v y agua desionizada durante 1 h y se tiñeron con azul de Coomassie durante 1 a 1.5 h. Se decoloraron con ácido acético al 10% v/v. En la electroforesis monodimensional se depositaron 35 g de proteína por carril en geles al 13%. Después de la tinción y digitalización de los geles se compararon los distintos patrones obtenidos de las proteínas solubles totales de L. gibba en presencia de boro (Laemmli, 1970).

Cabe señalar que para esta determinación se agregó una concentración de 500 ppm de boro. Las mediciones se realizaron a las 2, 4, 8, 24, y 48 h de iniciado el bioensayo.

Electroforesis bidimensional en gel poliacrilamida. Para la electroforesis se siguió el método de O'Farrell, 1975; O'Farrell et al., 1977para la cual la muestra se diluyó a una concentración de 2 mg de proteína por ml con buffer de muestra urea 9 M, 0.5% p/v. CHAPS, 10 mM DTT, 0.2% v/v de anfolitas y 0.001% p/v azul de bromofenol. La primera dimensión se realizó con bandas de gra-diente de pH inmovilizado de 4-7 en una cámara Protean IEF (BioRad) según las instrucciones del fabricante. La banda focalizada se equilibró con amortiguador de muestra SDS-PAGE adicionado con urea 6 M durante 10 minutos. La banda se colocó sobre un gel de acrilamida al 13% para separar las proteínas durante tres fases de isoelectroenfoque según el manual, que van desde 200-20,000 V.

La segunda dimensión de la electroforesis se corrió en geles de acrilamida al 13% según Laemmli, 1970 y se revelaron mediante tinción de plata.

Análisis de electroferogramas. Los geles se secaron, digitalizaron y analizaron mediante el programa para geles monodimensionales (Quantity-One). Se determinó además la masa molecular y la densidad relativa, mediante comparación con estándares de Sigma 96269.

Marcaje radioactivo Las muestras de 0 y 300 ppm con sus duplicados se marcaron in vivo con [³⁵S] metionina (30 kBq/ml; Amersham) a las 2 y 8 h. El pulso tuvo una duración de 2 h (Ferreira et al., 1996). Una vez que se cumplió el tiempo del pulso las muestras fueron lavadas con medio Hoagland y procesadas mediante la técnica de extracción de proteínas arriba mencionada. Del homogenizado se tomaron alícuotas de 20 µl y se mezclaron con 5 ml de líquido de centelleo. Del extracto claro se tomaron alícuotas de 94 µl y se precipitaron con TCA al 10% p/v. Del sobrenadante resultante se tomaron 20 µl y se mezclaron con 5 ml de líquido de centelleo. Todas las muestras se leyeron en un contador de centelleo. Se obtuvieron los cpm totales/mg de proteínas solubles totales para todas las muestras. A partir de estos resultados se realizaron las electroforesis monodimensionales y bidimensionales de cada muestra. Antes de secar los geles se remojaron en una solución de ácido acetilsalicílico al 5 M durante 20 min para detectar quimioluminiscencia.

Las autoradiografías de los geles secos se realizaron usando dos métodos con el fin de obtener el mejor resultado.

En el primero los geles secos se analizaron en un digitalizador de imágenes Phospor Imaging Systems Myer (GS-525/GS505), en donde los geles se expusieron durante 4 días. Las imágenes de los geles secos se obtuvieron del digitalizador laser que forma parte del Imaging Systems Myer. En el segundo método los geles se expusieron a una película Kodak X-Omat a -70 °C durante 15 días (Pérez et al., 1990).

RESULTADOS

Extracción de proteínas del tejido vegetal. La extracción de proteínas se realizó mediante una modificación de la técnica pro-puesta por López y Palton (1991). La concentración promedio de proteínas obtenida de los extractos de L. gibba fue de 2.68 ± 0.12 mg de proteína/g de peso fresco de planta. No se presentaron diferencias significativas en el contenido de proteínas extraídas entre los tratamientos y el control.

Separación de proteínas en electroforesis monodimensional en presencia de SDS (PAGE-SDS). A las 2 h de exposición al boro no se observaron cambios importantes en el patrón electroforético de L. gibba, con excepción de una banda de 97 kDa en 300 ppm (Fig. 1a). A las 4 h de exposición se observó el incremento de tres bandas, de 45, 50 y 55 kDa en las concentraciones de 300 y 500 ppm; en la concentración de 400 ppm el incremento de estas bandas fue menor (Fig. 1b). Otro cambio importante se observó a las 8 h en las concentraciones de 300 y 400 ppm, en donde se sobre-expresó una banda de 58 kDa, de 21 kDa y otra banda de 80 kDa (Fig. 1c).

Con 300 y 400 ppm de boro y 24 y 48 h de exposición, se observó que incrementaron su densidad relativa las bandas de 14, 21, 45, 55 y 80 kDa (Fig. 1d). La banda de 14 kDa se observó únicamente en la concentración de 300 ppm (Fig. 1e). Las bandas de 14 y 21 kDa que se manifiestaron en las concentraciones de 300 y 400 ppm podrían tratarse de las sHsps (proteínas de choque término de bajo peso molecular). Las bandas de 45-55 podrían corresponder a la Hsp (proteína de choque térmico) 60. Finalmente la de 80 kDa podría ser una Hsp 70.

En la Tabla 1 se presentan los pesos moleculares en kDa de cada condición, así como sus puntos isoeléctricos (P. I.) En el control se encontró mayor número de proteínas entre los 28 y 31 kDa con un intervalo de P. I. entre 5 y 6. Para la concentración de 300 ppm se presentaron proteínas desde 14 hasta 80 kDa con un intervalo de P.I. de 5 a 6.6. En la concentración de 400 ppm se presentó un gran número de proteínas que abarcaron puntos isoeléctricos desde 4.5 hasta 6.6. Las proteínas que se presentaron en cada P. I. fueron considerados como importantes debido a la ausencia o presencia de éstas en las distintas concentraciones de B.

Marcaje y autoradiografía. Se observó un aumento en la síntesis de proteínas a las 3 h de exposición al boro, mientras que a las 9 h de exposición, la síntesis disminuyó en los grupos experimentales con respecto al control (Fig. 3a-b). Aparentemente existe una síntesis de nuevas proteínas por presencia de boro al inicio del tratamiento, sin embargo, se presentaron muchas proteínas marcadas (Fig. 3b), lo que al compararse con el patrón electroforético de L. gibba en las mismas condiciones pero sin marca radioactiva, mostró gran similitud en la síntesis de proteínas (Fig. 3a), indicando así que muy probablemente no existe una marca selectiva. Como se observa en la Figura 3a-b, se sobreexpresaron proteínas de 55 kDa en ambas condiciones.

La Figura 4 muestra la incorporación específica de [³⁵S]metionina (cuentas totales por minuto entre los mg de proteínas solubles totales) para cada condición, observándose mayor incorporación en el tratamiento de 300 ppm al inicio y a las 9 horas de exposición al boro, con respecto al control.

DISCUSIÓN

Las pectinas son polisacáridos y sus moléculas forman la matriz en donde las microfibrillas de celulosa se encuentran embebidas y se unen de manera adyacente a las paredes celulares. Debido a sus cargas negativas, las pectinas atrapan moléculas de agua dando como resultado una consistencia de gel que puede ser muy fluida o muy rígida, dependiendo de las propiedades físicas y químicas de las moléculas de las pectinas que estén presentes (Becker et al., 2000).

L. gibba es una planta útil en la remoción de contaminantes que se acumulan en el agua. El conocer las proteínas que expresa en situaciones de exposición a elementos tóxicos, podría ser una prueba complementaría para el monitoreo ambiental. No hay una técnica totalmente adecuada para la extracción de las proteínas del tejido de L. gibba, por otro lado las referencias más actualizadas no reportan la técnica de manera específica (Oughman & Howarth, 1988).

La técnica se adaptó a los recursos y las necesidades del trabajo siguiendo la propuesta por López y Palton (1991), en donde se analizan patrones bidimensionales en un complejo de mezclas proteínicas en plantas de brócoli. Una vez modificada y adaptada la técnica, se obtuvieron extractos libres de ADN y pectinas que permitieron comparar distintos patrones electroforéticos de L. gibba, en diferentes condiciones mediante geles monodimensionales y bidimensionales.

Electroforesis monodimensional de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS). Una respuesta interesante en L. gibba ante la presencia del boro fue que repetidas veces presentó la expresión de las mismas proteínas cuando fue expuesta a 300 ppm, lo cual indica que su nivel de tolerancia a la presencia de boro es alto.

Marcaje y autorradiografía de proteínas recién sintetizadas. Se ha observado que 1 h de marcaje de [³⁵S] metionina no es suficiente para producir la síntesis de polipéptidos de novo (Ferreira et al., 1996), por lo que en las condiciones experimentales de este bioensayo la marca fue de 2 h y se observaron cambios en el patrón general de proteínas, sin embargo, la cantidad de proteínas marcadas no fue muy selectiva en el tiempo analizado. Aunque en las tres primeras horas de exposición al boro, se observó una mayor síntesis de proteínas en los tratamientos que en el control, a las nueve horas de exposición cuando finalizó el tiempo de marcaje, la tendencia en la síntesis de proteínas, tanto de los controles como de los tratamientos, fue muy similar (Fig. 3b).

Las técnicas de extracción de proteínas fueron modificadas para adecuarlas a la planta acuática L. gibba con buenos resultados. Dado que hubo expresión de proteínas al exponer a L. gibba a un elemento en concentraciones de toxicidad, estas pueden ser consideradas como herramientas adicionales en estudios de monitoreo ambiental.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Hidrobiól. Lauraceli Romero Ortíz por la ayuda en la edición del manuscrito.

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