Especies de peces con potencial como bioindicadoras de genotoxicidad en el lago "La Alberca", Michoacán, México

Potential fish species as genotoxicity biomarkers at lake "La Alberca", Michoacan, Mexico

Olivia Torres-Bugarín¹, José Luis Zavala-Aguirre², Paulina Gómez-Rubio¹, Héctor René Buelna-Osben³, Guillermo Zúñiga-González⁴ y Manuel García-Ulloa Gómez⁵

¹ Departamento de Investigación, Programa Internacional de Facultad de Medicina,Universidad Autónoma de Guadalajara. Av. Acueducto esquina Montevideo. Col. Lomas del Valle. 3ra sección. CP 44100 tel (33)3648-8383, ext 3152. E-mail: oliviatorres@hotmail.com

³ Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Michoacán, Instituto Politécnico Nacional. Becario de COFAA-IPN.

⁴ Laboratorio de Mutagénesis, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, Instituto Mexicano del Seguro Social.

⁵ Departamento de Acuacultura, Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Guadalajara.

Recibido: 25 de octubre de 2005
Aceptado: 10 de octubre de 2006

Resumen

Se evaluó la presencia espontánea de micronúcleos en sangre periférica de 10 especies de peces que habitan el lago "La Alberca", Michoacán (México), para proponerlas como posibles bioindicadoras de agentes genotóxicos. Se colectaron muestras de sangre periférica de 56 organismos de 10 especies diferentes las cuales se analizaron con microscopía de fluorescencia (100X) para registrar: la cantidad de eritrocitos micronucleados (EMN) espontáneos en 10,000 eritrocitos, la proporción de eritrocitos policromáticos (EPC) en 1,000 eritrocitos y la relación citoplasma-núcleo (RC/N) de los eritrocitos. Las especies muestreadas fueron: Xenotoca melanosoma (3.7±1.6 EMN, 29.5±15 EPC, 1.7:1 RC/N), Oreochromis aureus (2.0±1.0 EMN, 21.0±14 EPC, 2.6:1 RC/N), Chirostoma consocium (1.5±0.7 EMN, 19.8±14 EPC, 1.4:1 RC/N), Chirostoma lucius (1.2±1.3 EMN, 34.2±19 EPC, 1.8:1 RC/N), Lepomis macrochirus (1.2±1.6 EMN, 10.3±19 EPC, 2.2:1 RC/N), Alloophorus robustus (1.0±1.5 EMN, 31.1±23 EPC, 1.9:1 RC/N), Zoogoneticus quitzeoensis (0.8±1.2 EMN, 23.8±6.3 EPC, 1.6:1 RC/N), Chapalichthys encaustus (0.7±1.0 EMN, 44.6±28 EPC, 1.9:1 RC/N), Poeciliopsis infans (0.7±0.8 EMN, 12.4±4.4 EPC, 1.8:1 RC/N) y Goodea atripinnis (0.6±1.1 EMN, 11.7±5.7 EPC, 1.7:1 RC/N). Por el número de EMN espontáneos y la RC/N que se encontró en Xenotoca melanosoma y Oreochromis aureus se sugiere que estas especies son potenciales indicadoras biológicas de agentes genotóxicos.

Abstract

The presence of spontaneous micronuclei in peripheral blood erythrocytes from 10 fish species in Lake "La Alberca", Michoacan (Mexico), was evaluated as a possible biological indicator of genotoxic agents. The peripheral blood samples from each of 56 fishes were analyzed by fluorescence microscopy (100X) to determine frequency of micronucleated erythrocytes (EMN) in 10,000 cells, and polychromatic erythrocytes in 1,000 cells (EPC). The cytoplasm-nucleus ratio in erythrocytes (RC/N) also was calculated. The sampled species and their Results were: Xenotoca melanosoma (3.7±1.6 EMN, 29.5±15 EPC, 1.7:1 RC/N), Oreochromis aureus (2.0±1.0 EMN, 21.0±14 EPC, 2.6:1 RC/N), Chirostoma consocium (1.5±0.7 EMN, 19.8±14 EPC, 1.4:1 RC/N), Chirostoma lucius (1.2±1.3 EMN, 34.2±19 EPC, 1.8:1 RC/N), Lepomis macrochirus (1.2±1.6 EMN, 10.3±19 EPC, 2.2:1 RC/N), Alloophorus robustus (1.0±1.5 EMN, 31.1±23 EPC, 1.9:1 RC/N), Zoogoneticus quitzeoensis (0.8±1.2 EMN, 23.8±6.3 EPC, 1.6:1 RC/N), Chapalichthys encaustus (0.7±1.0 EMN, 44.6±28 EPC, 1.9:1 RC/N), Poeciliopsis infans (0.7±0.8 EMN, 12.4±4.4 EPC, 1.8:1 RC/N) and Goodea atripinnis (0.6±1.1 EMN, 11.7±5.7 EPC, 1.7:1 RC/N). The frequency of spontaneous EMN found in Xenotoca melanosoma and Oreochromis aureus suggests that these species can be considered as potential biological indicators of genotoxic agents.

Key words: Micronuclei, fish, biomonitors, genotoxic, lake of Michoacán.

Introducción

El lago conocido como "La Alberca", se encuentra ubicado en la Ciénega de Chapala en la zona geotérmica de Los Negritos, en el extremo Este del rift Citala a 15 Km al Noreste de la ciudad de Jiquilpan, Michoacán (Zárate del Valle & Simoneit, 2005). Tiene balance hidrológico positivo a lo largo del ciclo anual debido a varios manantiales localizados en su parte central cuyos flujos superan al conjunto de los egresos (Buelna-Osben, 2002); este constante vertimiento de agua es usado como fuente de abasto para canales de riego de la zona; es un embalse de importancia económica y ecológica ya que se desarrollan diversas actividades en su entorno como son la agricultura, ganadería, pesca y recreación. Presenta características de interés favorables para futuros estudios representativos del Lago de Chapala ya que hasta antes de 1907 formó parte de éste, fecha en que se construyó el bordo Jamay-La Palma; ésto trajo como consecuencia la reducción del área lacustre (Sandoval, 1981), el aislamiento de la contaminación transportada por el río Lerma y la preservación de ictiofauna similar (Buelna-Osben, 2002). Además se encuentra presente en éste Lago la familia Goodeidae, endémica del territorio Mexicano y especialmente de la cuenca Lerma-Chapala (Álvarez del Villar, 1970).

La contaminación de los cuerpos de agua continentales constituye un serio problema que afecta las actividades productivas poniendo en riesgo la cantidad y calidad del agua que se destina, inclusive, para el servicio urbano. Existen muchas sustancias que diariamente son liberadas a los embalses o cauces de agua modificando las condiciones a los organismos que los habitan. Un ejemplo de lo anterior puede ilustrarse con la situación que enfrenta la cuenca Lerma-Chapala, donde los registros en varias estaciones de muestreo, presentan concentraciones de Cd, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb y Zn que superan los niveles de tolerancia de organismos bénticos y los modelos de predicción indican tendencias hacia su incremento (Hansen & van Afferden, 2001). De los cuatro primeros metales de la lista anterior, además del As y Se, se tiene documentado el potencial efecto micronucleogénico (Al-Sabti & Metcalfe, 1995, Nepomuceno et al., 1997, Báez-Ramírez et al., 2004, Zhu et al., 2004, Porto et al., 2005). Por otra parte, se han detectado gran cantidad de otros contaminantes originados por diversas fuentes como: la producción de desechos agropecuarios, empresas de servicios como la hotelería y restaurantes, desechos de procesadoras de alimentos y bebidas alcohólicas, industrias farmacéuticas, electromecánicas, metalúrgicas, petroquímicas, producción y uso de todo tipo de plaguicidas (Hansen & van Afferden, 2001), entre ellos el 12.6 % de plaguicidas organofosforados y organoclorados están catalogados como extremadamente tóxicos o altamente tóxicos (Ramos-Espinosa & López-Hernández, 2006). Situaciones similares en todo el mundo han promovido que la investigación relacionada con la toxicología acuática se haya incrementado notablemente (Al-Sabti & Metcalfe, 1995; Grisolia & Stargling, 2001; Andrade et al., 2004).

El monitoreo de la contaminación del agua por análisis directo de los agentes químicos requiere de gran precisión y del conocimiento del contaminante que se desea verificar; además, su evaluación está limitada por la sensibilidad y especificidad del método utilizado (Rodríguez-Ariza et al.,1992). La prueba de micronúcleos (MN) detecta el efecto de agentes mutagénicos sobre los cromosomas mediante la identificación de fragmentos acéntricos y/o cromosomas rezagados que al quedar fuera del núcleo forman tales estructuras. La técnica permite detectar tanto agentes clastogénicos (que rompen cromosomas) como aneuploidogénicos (que afectan el huso mitótico) (Schmid, 1975). Originalmente, la prueba de MN fue desarrollada en eritrocitos de medula ósea de ratones pero, posteriormente se modificó para ser aplicada a diversas especies y tejidos (Torres-Bugarín et al., 2003; Zúñiga-González et al., 2003a; Zamora-Perez, 2004; Zamora-Perez et al., 2004). La identificación de MN en eritrocitos de sangre periférica de mamíferos, aves, reptiles y anfibios depende básicamente de la eficiencia del sistema responsable de eliminar los eritrocitos anómalos y/o viejos (sistema reticuloendotelial): a mayor eficiencia menor posibilidad de observar EMN independientemente de si el organismo esta expuesto a agentes genotóxicos o no; esto ha sido ampliamente documentado con el objetivo de seleccionar las especies con mayor sensibilidad, que posteriormente, puedan ser utilizadas como indicadores o monitores biológicos en presencia de agentes tóxicos al genoma o genotóxicos (Zúñiga-González et al., 2000; Zúñiga-González et al., 2003b).

Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue el de evaluar el posible potencial de algunas especies de peces que habitan en el lago "La Alberca", para ser utilizados como monitores biológicos, mediante la prueba de MN.

Materiales y métodos

Material biológico. Los muestreos se realizaron a mediados de febrero de 2005 en el lago "La Alberca", ubicado en el municipio de Villamar, Michoacán, con un chinchorro playero de 20 m de largo X 3.5 m de ancho y una luz de malla de 0.5 cm. Las especies colectadas pertenecen a 5 familias diferentes: 1) Goodeidae: Goodea atripinnis (Jordan), Alloophorus robustus (Bean), Chapalichthys encaustus (Jordan y Snyder), Zoogoneticus quitzeoensis (Bean) y Xenotoca variata (Bean); 2) Atherinidae: Chirostoma lucius (Boulenger) y Chirostoma consocium (Jordan y Hubs); 3) Poecilidae: Poeciliopsis infans (Woolman); 4) Ciclidae: Oreochromis aureus (Steindachner) (introducida) y 5) Centrarchidae Lepomis macrochirus (Rafinesque) (introducida). Las especies fueron identificadas de acuerdo con Álvarez del Villar (1970) y Trewavas (1983). Las edades de los organismos muestreados se estimaron mediante las tallas y su respectiva ubicación en tablas de frecuencia de longitud, para cada especie (Buelna-Osben, 2002).

La obtención de las muestras se efectuó siguiendo las consideraciones bioéticas para peces, de acuerdo con los requerimientos institucionales y gubernamentales de México e instituciones de salud de los Estados Unidos de Norte América (Poole & Robinson, 1994, SAGARPA, 2001).

Las muestras de sangre se tomaron en campo mediante un corte en la base de la aleta caudal (Hooftman & de Raat, 1982), se realizó el frotis sobre portaobjetos limpios y desengrasados (previamente codificados) y se dejaron secar al aire para posteriormente fijarlas con etanol al 80% durante 10 minutos. La tinción de las laminillas se realizó en el Laboratorio de Mutagénesis del Centro de Investigación Biomédica de Occidente (CIBO), usando el colorante naranja de acridina, específico para ácidos nucleicos (Zamora-Perez, 2004; Zamora-Perez et al., 2004). La tinción de naranja de acridina permite la identificación de los MN ya que se colorean de amarillo brillante al igual que el núcleo, contrastándose del resto del citoplasma; por su parte los contenidos de RNA toman color rojo lo cual facilita diferenciación entre los eritrocitos inmaduros (policromáticos EPC) y los maduros (normocromáticos ENC) (Hayashi et al., 1998). Las laminillas fueron analizadas con microscopía de fluorescencia con objetivo 100X (Marca Carl Zeiss Axiostar® con lámpara de fluorescencia HBO 50 y fuente de poder mbq, con el objetivo A-Plan®) en el Laboratorio de Hidrobiología y Acuicultura de la Escuela de Biología, de la Universidad Autónoma de Guadalajara (UAG).

De cada especie, se determinó la frecuencia de eritrocitos micronucleados (EMN) espontáneos en 10,000 eritrocitos, la proporción de eritrocitos policromáticos (EPC) en 1,000 eritrocitos y la relación citoplasma-núcleo (RC/N) de los eritrocitos (Zúñiga-González et al., 1996; Zúñiga-González et al., 2000; Zúñiga-González et al., 2001). Para la evaluación de los EMN se consideraron los criterios propuestos por Grisolia (2002): los MN deben ser alrededor de un tercio más pequeños que el núcleo, no deben tocar al núcleo, no ser refractarios y presentar el mismo color e intensidad que el núcleo.

Análisis estadísticos. Se verificaron supuestos de normalidad y homoscedasticidad para los datos de EMN, EPC y RC/N entre las especies colectadas. En el caso de los datos correspondientes a los EMN fueron transformados [ln (dato + 1)] para poder ser analizados mediante la prueba de ANOVA. No fue posible la normalización de los datos de EPC y RC/N, de ahí que se aplicó prueba de Kruskal-Wallis y las diferencias entre medianas se establecieron con el procedimiento de Conover (1980) para la identificación de grupos homogéneos. Se utilizó el programa computacional Statgraphics^TM Plus, ver. 5.0 (Statistical Graphics Corp., USA) para realizar el análisis de los datos, con un nivel de significancia de p=0.05.

En la tabla 1 se observa que se colectaron 56 organismos de 10 especies diferentes y se describe el tamaño de muestra de cada una de las especies, la longitud patrón de los organismos muestreados, así como valores individuales y promedios (± desviación estándar) de EMN espontáneos en 10,000 eritrocitos totales, la cantidad de EPC en 1,000 eritrocitos y la RC/N.

Los valores de EMN fluctuaron significativamente (p = 0.01) desde 0.6 ± 1.1 para Goodea atripinnis, hasta 3.7 ± 1.6 obtenido para Xenotoca melanosoma. Las frecuencias de EMN del resto de las especies fueron relativamente bajas, de tal forma que en cinco de ellas se obtuvo un valor promedio de 1.4 y en las últimas tres de 0.7.

En los valores de EPC de los peces muestreados también se detectaron diferencias estadísticamente significativas (p = 0.01), siendo Chapalychthys encaustus la especie que mostró el mayor número (44.6±28), sin embargo mediante las comparaciones múltiples se evidenció que Xenotoca melanosoma (29.5±15) y Oreochromis aurus (21±14) pertenecen al grupo donde se presentó la mayor cantidad de EPC.

Con respecto a RC/N la diferencia significativa fue de p = 0.02; la especie Oreochromis aureus registró la mayor proporción (2.6:1) y Xenotoca melanosoma (1.7:1) se localizó dentro de grupo con RC/N intermedia.

En relación a la edad de los organismos, se infirió mediante la longitud de los peces, que todos eran adultos (Buelna-Osben, 2002). No fue posible la identificación del sexo.

Discusión

La presente investigación fue de carácter exploratorio porque el tamaño de muestra por especie fue dependiente de la abundancia natural de los organismos. Trabajos descriptivos similares al presente (Zúñiga et al., 1996; Zúñiga et al., 2000) utilizan tamaños de muestra que oscilan entre 1 y 15 organismos para las especies estudiadas. Rodríguez-Cea et al., (2003) emplearon de 5 a 8 organismos por tratamiento para la inducción de MN en peces y para el análisis estadístico emplearon la prueba de Kruskal Wallis. Lo anterior sustenta que los procedimientos estadísticos y tamaños de muestra usados en el presente estudio son válidos.

Los resultados individuales de EMN espontáneos mostraron gran variabilidad dentro de cada especie (Tabla 1), fenómeno que ha sido observado en la mayoría de las especies tanto en mamíferos (Zúñiga-González et al., 2001), aves, reptiles (Zúñiga-González et al., 2000) e incluso también en peces (Hayashi et al., 1998); por tal motivo, la obtención de valores de desviación estándar con magnitudes incluso superiores a los de la media conducen al uso de procedimientos estadísticos no paramétricos (Minissi et al., 1996; Grisolia, 2002; Andrade et al., 2004; Porto et al., 2005).

En este trabajo el promedio de EMN espontáneos de Oreochromis aureus fue de 2.0 ±1.0, en 10,000, igual al descrito en Oreochromis niloticus, especie que al ser expuesta a genotóxicos la frecuencia de EMN se incremento hasta 38 EMN en 10,0000 células (Palhares & Grisolia, 2002); si bien es cierto que son especies diferentes, es posible obtener híbridos de ambas (Schlechtriem et al., 2004), por lo que se infiere pudieran mostrar respuesta similar a genotóxicos. Por tanto, esta información sustenta que Oreochromis aureus también pueda ser considerada como indicador de agentes genotóxicos, no obstante lo que Al-Sabati & Metcalfe (1995) refieren: que aunque sea posible utilizar especies con registros de EMN menores a los recomendados, su respuesta al efecto de genotóxicos puede verse reducida dificultando su evaluación. Por esto es muy importante verificar la respuesta de Oreochromis aureus a genotóxicos ya que es una especie de amplia distribución a nivel mundial.

Los EPC, son considerados como herramientas muy útiles en la evaluación de EMN ya que un EPC es un eritrocito joven que contiene RNA y que en aproximadamente 24 horas alcanza su madurez volviéndose normocromático; la observación de EPCMN (eritrocitos policromáticos micronucleados) se deberá a que previo al momento del estudio hubieron alteraciones ya sea en el huso mitótico o en cromosomas debido a causas naturales o a la exposición a genotóxicos (Zúñiga-González et al., 1996), cabe señalar que en los organismos muestreados no se contaron.

Aunque la mayor cantidad de EPC la presentó Chapalychthys encaustus (44.6 ± 28.0), la frecuencia de EPC en las dos especies propuestas (21 ± 14 y 29.5 ± 15, para Xenotoca melanosoma y Oreochromis aureus, respectivamente) es adecuada para estudios con genotóxicos de acuerdo con lo descrito por Zúñiga-González et al., (1996).

Las proporciones medias observadas de RC/N en todas las especies permiten la diferenciación del núcleo y MN dentro del citoplasma celular (Grisolia, 2002), sin embargo, en Oreochromis aureus y Lepomis macrochirus los valores fueron mayores a 2:1 lo que facilita la identificación de MN.

Buelna-Osben (2002) después de analizar y caracterizar la fisicoquímica del lago La Alberca con base en criterios limnológicos (Wetzel, 1981) apunta que éstas aguas no sufren de contaminación orgánica; lo anterior se explica debido a que no se vierten aguas negras ni escurrimientos agrícolas; también sugiere que el lago pudiera ser declarado como una zona de reserva ya que el inventario de ictiofauna coincide con el de Chapala. La presencia de otro tipo de contaminantes como metales pesados, pesticidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc requieren de métodos analíticos y equipos especializados por lo que señalar que el lago se encuentra libre de contaminantes requiere del complemento de un enfoque analítico químico y pruebas con bioindicadores. El presente estudio aporta una evidencia más de la ausente o baja contaminación del lago ya que en las 10 especies analizadas se obtuvieron bajas cuentas de EMN. De haber existido concentraciones altas de agentes genotóxicos micronucleogénicos, se esperaría haber encontrado valores de EMN mayores a las observadas, en al menos una especie. Lo anterior, per se, también es evidencia de que los valores de MN descritos para las especies podría tratarse de los valores basales, lo que deberá verificarse mediante evaluación de MN después de mantenimiento en cuarentena. El conocimiento del valor basal de las especies muestreadas es sumamente importante para realizar futuros estudios de evaluación de agentes genotóxicos en la cuenca Lerma-Chapala, ya que éstos son la referencia que permitiría categorizar zonas con diferente grado de contaminación.

Se concluye que la especie Xenotoca melanosoma es candidata a ser evaluada como posible biomonitor de agentes genotóxicos por ser una especie endémica, de fácil captura ya que presentó el valor más alto de EMN espontáneos (3.7±1.6), buena RC/N (1.7:1) y cantidad excelente de EPC (29.5±15); una segunda opción es la especie introducida Oreochromis aureus de distribución mundial y de fácil captura. Se recomienda la realización de experimentos con estas especies en presencia de agentes genotóxicos conocidos para corroborar la posibilidad de ser usados como indicadores biológicos.

Agradecimientos

Dr. Francisco Martínez Sandoval, Director de Programa Internacional de la Facultad de Medicina UAG y al Dr. Tetsuya Ogura Fujii del Departamento de Química del Instituto de Ciencias Exactas y Terrestres de la UAG por el apoyo general y financiero.

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