Fertilización nitrogenada en el crecimiento, contenido de compuestos fenólicos y actividad antioxidante de albahaca

Nitrogen ferilization effects on growth, phenolic copounds contet, and antioxidant activity of Brasil

Francisco-Javier Yépez-Hernández¹, Ronald Ferrera-Cerrato¹, Alejandro Alarcón¹*, Julián Delgadillo-Martínez¹, Ma. Remedios Mendoza-López² y Óscar García-Barradas²

¹ Área de Microbiología, Postgrado de Edafología, Colegio de Postgraduados. Km 36.5 Carr. México-Texcoco. 56230, Montecillo, Texcoco de Mora, Estado de México. * Autor para correspondencia (aalarconcp@gmail.com).

Recibido: 17 de Junio del 2014.
Aceptado: 4 de Noviembre del 2015.

Resumen

Este trabajo evaluó el efecto de seis concentraciones de nitrógeno (N) (0, 12.5, 25, 50, 75 y 100 %) en el crecimiento y respuestas fisiológicas de albahaca (Ocimum basilicum L.) cultivada en condiciones de invernadero. Las concentraciones de N fueron aplicadas con la solución nutritiva Long-Ashton que contiene 160.25 μg N mL^-1 (100 % N). A los 120 d, se evaluó la altura del tallo (ALT), longitud de raíz (LR), número de hojas (NH), peso seco total (Pstot), área foliar (AF), contenido de compuestos fenólicos solubles totales (CFT), y la actividad antioxidante total (AOX) en hojas. No se observaron diferencias significativas por efecto de la concentración de N en ALT, LR, NH, Pstot y CFT. La aplicación de 100 % N produjo el valor más bajo (424.8 μg g^-1) de CFT en comparación con el control (0 % N) que obtuvo 826.9 μg g^-1. AF y AOX presentaron diferencias significativas (α = 0.05); las plantas con 75 % N mostraron mayor AF (538 cm²) con respecto al control (297 cm²). La mayor AOX se obtuvo en el tratamiento sin N (5.9 mM g^-1), y la menor con 100 % N (3.1 mM g^-1). La deficiencia de N no afectó el crecimiento vegetal, pero aumentó el CFT y la AOX, lo que conviene considerar para mejorar sus propiedades nutraceúticas.

Palabras clave: Ocimum basilicum, planta medicinal, deficiencia de N, fenólicos, antioxidantes.

Abstract

Key words: Ocimum basilicum, medicinal plants, nitrogen deficiency, phenolics, antioxidants.

INTRODUCCIÓN

Albahaca (Ocimum basilicum L.) es una planta herbácea representada por al menos 50 variedades que se caracterizan por su aroma originado por compuestos volátiles (Carovic-Stanko et al., 2011; Duke, 1987; Sánchez-Verdugo y Lucero-Flores, 2012). La albahaca se emplea principalmente como un producto culinario, pero además tiene propiedades medicinales (Briskin, 2000). Los compuestos activos de esta planta tienen propiedades insecticidas, nematicidas, fungicidas y antimicrobianas; así mismo, se usa como base de fragancias, champús, lociones, licores y aperitivos (Mendiola-Ubillos y Martín-Montalbán, 2009; Smirnova et al., 2012). Estas propiedades hacen de la albahaca un cultivo con alta demanda; por ello la producen países como Francia, Hungría, Egipto, entre otros, y destacan la Unión Europea, Canadá y Estados Unidos como los principales exportadores (Martínez-Gordillo et al., 2013; Sánchez-Verdugo y Lucero-Flores, 2012).

Las plantas medicinales producen compuestos activos que provocan alguna actividad farmacológica en los organismos vivos, entre los que se incluyen los terpenos, alcaloides y compuestos fenólicos que poseen propiedades antioxidantes (Kwee y Niemeyer, 2011; Muñoz, 2002). Los principales ácidos fenólicos que contiene la albahaca son rosmarínico, chicórico, caftárico y cafeico (Kwee y Niemeyer, 2011; Lee y Scagel, 2009; Toussaint et al., 2007), cuyos contenidos en el tejido vegetal pueden variar por muchos factores, y algunos están involucrados como respuesta ante factores de estrés tanto bióticos como abióticos (Scagel y Lee, 2012). La principal ruta metabólica para la síntesis de compuestos fenólicos en plantas es la del ácido shikímico, la cual inicia con la fenilalanina (Taiz y Zeiger, 2002).

Los ácidos rosmarínico, chicórico y en menor concentración caftárico y cafeico, son utilizados en diferentes tratamientos para mejorar la salud humana, para prevenir la obesidad, enfermedades cardiacas, cáncer de colon, desórdenes gastrointestinales, y también para reducir la diabetes (Ignat et al., 2011).

El ácido rosmarínico se utiliza como agente anti-inflamatorio debido a que presenta características analgésicas y antipiréticas, y en el tratamiento de la artritis y lesiones de músculos, ligamentos y tendones para evitar el dolor y la inflamación (Kim et al., 2010). El ácido chicórico es inhibidor de la integrasa del VIH-I, y ayuda en la moderación del estrés crónico y la depresión (Lee y Scagel, 2009). Además, los compuestos fenólicos totales (CFT) tienen propiedades antioxidantes que son parte importante de los procesos no enzimáticos de defensa contra el estrés oxidativo causado por la formación de especies reactivas de oxígeno (Gill y Tuteja, 2010; Ignat et al., 2011; Zulfugarov et al., 2011).

Los CFT han sido muy investigados en los últimos años debido al poder antioxidante que presentan (Sroka y Cisowski, 2003), por su habilidad de disminuir el estrés oxidativo mediante la donación de electrones y átomos de hidrógeno, y de quelatar iones como el hierro y cobre (Agati et al., 2012). Algunos de estos compuestos poseen propiedades terapéuticas y preventivas de ciertas enfermedades crónico-degenerativas, por lo que se les ha acuñado la denominación de nutracéuticos o alimentos funcionales (Berdowska et al., 2013; Briskin, 2000; Impa et al., 2012).

Dentro del área farmacéutica, uno de los objetivos ha sido mejorar el rendimiento de los principios activos presentes en las plantas. Además de usar técnicas moleculares, se ha optado por metodologías más económicas debido a la alta demanda de sus compuestos benéficos (Nascimento y Fett-Neto, 2010). Con el fin de aumentar la concentración de los compuestos fenólicos, las plantas medicinales han sido expuestas a factores bióticos como la infección de microorganismos (Asensio et al., 2012), y factores abióticos como el déficit hídrico, alcalinidad, alta radiación, deficiencia nutrimental, alta luminosidad y humedad de suelos o del sustrato (De la Rosa et al., 2011; Moreno-Rodríguez et al., 2014; Rajashekar et al., 2012).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se emplearon semillas comerciales de albahaca variedad Hoja Grande (Rancho Los Molinos®), las cuales fueron desinfectadas con una solución de NaClO a 2 % v/v durante 3 min y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril, para eliminar posibles patógenos presentes en la superficie de la semilla. La germinación de las semillas se hizo en papel filtro húmedo en cajas de Petri a 25 °C durante 72 h. Las plántulas obtenidas se trasplantaron en macetas de plástico (dos por maceta) que contenían 500 g de sustrato compuesto de una mezcla de turba-perlita-vermiculita (1:1:1, p/p) esterilizada a 121 °C por 3 h durante 3 d.

Las plantas se regaron con solución nutritiva Long-Ash-ton completa durante las primeras cuatro semanas (Hewitt, 1966), cuya composición general en (g L^-1) es: 80.8 KNO₃; 73.6 MgSO₄-7H₂O; 188.8 Ca(NO₃)₂-4H₂O; 36.8 NaH₂PO₄-H₂O; 1.69 MnSO4-H₂O; 0.25 CuSO₄-5H₂O; 0.29 ZnSO₄-7H₂O; 3.10 H₃BO₃; 5.90 NaCl; 0.088 (NH₄)₆Mo₇O₂₄-4H₂O; 4.9 FeC₆H₅O₇; y 4.9 H₃C₆H₅O₇-H₂O. Este experimento se llevó a cabo en condiciones de invernadero del 10 de agosto de 2012 al 23 de diciembre del 2012, a una temperatura promedio de 20.4 °C y humedad relativa promedio de 34.4 %, según registros obtenidos con un dispositivo HOBO® TEMP/RH 1000 Series (Spectrum Technologies, USA).

Aplicación de fertilización nitrogenada

A partir de la cuarta semana después del trasplante y hasta la cosecha (4 meses), las plantas se regaron con la solución nutritiva Long-Ashton (Hewitt, 1966) preparada con diferentes dosis de nitrógeno. La solución testigo tuvo una concentración óptima de 160.25 μg de N mL^-1 (100 % N), y a partir de ésta se prepararon las diferentes diluciones: 75, 50, 25, 12.5 y 0 % N. Cada tratamiento consistió de cinco repeticiones (n = 5) que fueron distribuidas en un diseño experimental completamente al azar.

Cosecha, evaluación del crecimiento y análisis nutrimental

Cuatro meses (120 d) después de la aplicación de los tratamientos de nitrógeno, se evaluó el crecimiento de las cinco plantas en cada tratamiento, con las variables altura del tallo (cm), longitud de raíz (cm), número de hojas, pesos secos de tallo, hojas, raíz y total. El área foliar se determinó con un medidor de área foliar (LICOR LI-3100®, USA). Además, en el tejido foliar se cuantificó el nitrógeno total por el método semi-microKjeldahl (Bremner, 1965) y el fósforo total (Hanson, 1950), los cuales se expresaron en porcentaje y como contenido total en follaje.

La determinación de los compuestos fenólicos solubles totales (CFT) se llevó a cabo por el método de Folin-Ciocalteau (Folin y Ciocalteau, 1927; Lester et al., 2012; Singleton y Rossi, 1965) y la actividad antioxidante total (AOX) por el método de reducción de DPPH (Brand-Williams et al., 1995). Para la extracción, de cada planta por tratamiento (n = 5), se pesaron de 0.150 a 0.200 g de tejido foliar macerado con 3 mL de metanol a 80 %. El extracto se centrifugó a 19,940 x g por 15 min, y las muestras se almacenaron en refrigeración a 4 °C hasta su análisis.

Para la determinación de los CFT se tomaron alícuotas de 30 |L de los extractos y se colocaron por duplicado en microplacas de 96 pozos. A continuación, se aplicaron 150 μL del reactivo de Folin-Ciocalteau y 90 μL de Na₂CO₃ 1 N. El volumen final por pozo fue de 270 μL. Posteriormente, se procedió a incubar la placa por 30 min y se leyó la absorbancia a 725 nm. Los resultados se expresaron en μg de ácido clorogénico por gramo tejido fresco (μg g^-1). La determinación de la actividad antioxidante (AOX) se realizó por el método de reducción de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo), con 15 μL de los extractos obtenidos colocados en microplacas de 96 pozos por duplicado, a los que se adicionaron 270 μL de una solución de DPPH, y se tomó la absorbancia inicial a 515 nm; después de 15 min de incubación a temperatura ambiente, se tomó nuevamente la absorbancia a 515 nm. Los resultados se expresaron en mM de Trolox por gramo de tejido fresco (mM g^-1).

Análisis estadísticos

Los datos obtenidos del experimento fueron sometidos a un análisis de varianza y a una prueba de comparación de medias de t de Student (a = 0.05) mediante el programa SAS para Windows (SAS Institute, 2002).

RESULTADOS

Crecimiento y estado nutrimental

La fertilización nitrogenada no causó diferencias significativas en la altura del tallo, longitud de raíz, ni en el peso seco de las plantas (Cuadros 1 y 2). En contraste, el número de hojas aumentó significativamente (P ≤ 0.001) conforme la dosis de nitrógeno incrementó; el tratamiento con 100 % N registró mayor número de hojas (49.6) por planta, mientras que el tratamiento con 0 % N presentó menor número con 25 hojas (Cuadro 1). De manera similar, el área foliar presentó diferencias significativas (P ≤ 0.001) por efecto de la dosis de nitrógeno; el tratamiento con 75 % N presentó el valor más alto (453.9 cm³), mientras que los tratamientos con 0, 12.5 y 25 % N obtuvieron los valores más bajos. El tratamiento con 75 % N mostró 44.7 % más área foliar que el tratamiento con 0 % N.

El porciento de nitrógeno total y el contenido total de nitrógeno foliar presentaron diferencias significativas entre tratamientos (P ≤ 0.001). Los tratamientos con 50, 75 y 100 % de N presentaron los valores más elevados de nitrógeno total en comparación con el tratamiento de 12.5 % de N que presentó el promedio más bajo (Figura 1A). Así mismo, el tratamiento con 75 % de N presentó el mayor contenido de nitrógeno foliar con 0.033 mg g^-1, mientras que los tratamientos con 0, 12.5 y 25 % de N presentaron los valores más bajos, y el tratamiento con 12.5 % de N mostró el valor más bajo con 0.016 mg g^-1 (Figura 1B).

Compuestos fenólicos y actividad antioxidante total en albahaca

Los CFT en hojas tendió a incrementar conforme la concentración de N disminuyó en la solución nutritiva; sin embargo, las diferencias entre los tratamientos no fueron significativas de acuerdo al análisis estadístico. El valor más alto se obtuvo en el tratamiento de 0 % de N con 826.93 μg g^-1, mientras que con la aplicación de 75 y 100 % de N el CFT fue de 426.7 μg g^-1, en promedio (Figura 1E). La AOX disminuyó significativamente conforme incrementó la concentración de N (P ≤ 0.001). La mayor actividad antioxidante se reportó en los tratamientos 0 y 12.5 % N (5.94 y 5.37 mM g^-1, respectivamente), mientras que los tratamientos con 100 y 75 % de N mostraron la menor actividad (2.6 mM g^-1) (Figura 1F).

DISCUSIÓN

Crecimiento y estado nutrimental

El nitrógeno es fundamental en las plantas para la síntesis de ácidos nucleicos, proteínas, porfirinas de la clorofila y algunos citocromos necesarios para la fotosíntesis y la respiración (Alcántar-González y Trejo-Téllez, 2009; Azcón-Bieto y Talón, 2008; Salisbury y Ross, 1994). Los niveles óptimos de nitrógeno tienden a promover una rápida división y elongación celular, por lo cual era de esperarse que el crecimiento de albahaca resultara limitado por una baja disponibilidad de nitrógeno (Alcántar-González y Trejo-Téllez, 2009; Giorgio et al. 2009).

Matsumoto et al. (2013) y Frabboni et al. (2011) reportaron que la aplicación de una mayor dosis de N resultó en incrementos en la biomasa y altura de O. basilicum crecida en condiciones de campo, aunque los efectos benéficos de la aplicación de N fueron reducidos por altas dosis de potasio. Lo anterior resalta la interacción del N y el K en el crecimiento y desarrollo vegetal, aunque en este estudio no se contempló esta posible interacción nutrimental. La ausencia de diferencias en el crecimiento vegetal y bioma-sa generada por efecto de distintas dosis de nitrógeno en albahaca, sugiere que el desarrollo de esta especie vegetal es independiente a la cantidad de nitrógeno aplicado, como se ha discutido por Martínez-Carrasco et al. (2005) y (Millard, 2006).

González-García et al. (2009) observaron que la albahaca incrementa su altura en cultivo hidropónico con aplicación de solución nutritiva con una relación de amonio/nitrato 20:80. En contraste, Sifola y Barbieri (2006) demostraron que la fertilización de tres cultivos de albahaca crecidos en campo con distintas concentraciones de nitrógeno (0, 100 y 300 kg N ha^-1) no produjo cambios significativos en la altura. Así mismo, Carrasco et al. (2007) indicaron que la altura de albahaca no presentó diferencias significativas por efecto de la conductividad eléctrica de la solución nutritiva. En el presente experimento las soluciones nutritivas aplicadas registraron pH de 5.5 a 5.6 y CE promedio de 52.1 μS cm^-1, por lo que no fueron factores que hayan afectado el crecimiento. Lo anterior permite inferir que la altura de albahaca es independiente a la cantidad de nitrógeno aplicado.

La longitud de raíz mostró valores semejantes entre tratamientos, lo cual indica que el alargamiento del sistema radical también es independiente de las dosis de nitrógeno. Es importante recalcar que existieron fuentes alternas de nitrógeno, ya que la turba del sustrato utilizado puede contener cerca de 1 % de N (Resh 2006); dicho N pudo haber sido tomado por la planta en los tratamientos con limitada fertilización nitrogenada, como sugirieron Dayegamiye e Isfan (1991). No se encontraron reportes para albahaca acerca del desarrollo radical bajo estrés de nitrógeno para fortalecer esta discusión. Sin embargo, algunos reportes indican que la aplicación de nitrógeno no afectó la longitud de la raíz en trigo (Triticum aestivum) o berenjena (Solanum melongena) (Rasmussen et al., 2015; Zhang et al., 2014).

La aplicación de 100 % N produjo mayor número de hojas y las plantas con 75 % N presentaron mayor área foliar con respecto a los tratamientos con 0, 12.5 y 25 % N. Tarchoune et al. (2010) mostraron que la albahaca registra en promedio 90 hojas y 1893 cm² de área foliar durante su desarrollo en cultivo hidropónico. Por su parte, Sifola y Barbieri (2006) mostraron que al incrementar la dosis de nitrógeno, el número de hojas de albahaca también aumentó. La presente investigación demuestra que el área foliar y el número de hojas incrementaron al aplicar mayor concentración de nitrógeno.

Sifola y Barbieri (2006) reportaron que no existen diferencias significativas en el contenido de nitrógeno foliar al fertilizar un cultivo de albahaca en condiciones de campo con 0 y 100 kg N ha^-1; sin embargo, la aplicación de 300 kg N ha^-1 aumentó el contenido de nitrógeno foliar. Los resultados de estos autores son similares a los encontrados en la presente investigación, donde la acumulación de nitrógeno fue mayor al aplicar mayor cantidad de este nutrimento.

Compuestos fenólicos y actividad antioxidante total en albahaca

Kwee y Niemeyer (2011) indican que los CFT son dependientes de la variedad de albahaca; por ejemplo, la variedad Spice tiene mayor contenido de estos compuestos (17.6 mg g^-1) en comparación con la variedad Sweet Dani Lemon (3.5 mg g^-1). Por su parte, Scagel y Lee (2012) reportaron que las variedades Cinnamon, Sweet Dani, Siam Queen y Red Rubin en albahaca poseen concentraciones de estos compuestos de 7.1, 5.6, 8.0 y 5.9 mg g^-1, respectivamente.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo (826.9 μg^-1, valor máximo) están por debajo de los valores reportados por los autores arriba mencionados. Al respecto, es conveniente considerar que el análisis de CFT por el método de Folin-Ciocalteau sufre de interferencia por sustancias como el ácido ascórbico, ácidos orgánicos, azúcares, aminas aromáticas, dióxido de azufre, ácidos orgánicos, hierro, además de los flavonoides, las antocianinas y los taninos (Prior et al. 2005; Ignat et al., 2011). Sin embargo, la mejor explicación es que las concentraciones de estos compuestos dependen en alto grado de las condiciones ambientales y de la etapa fenológica de la planta. Las evaluaciones hechas para este experimento se realizaron antes de la floración, cuando la planta estaba madura. Según Witzell et al. (2003), conforme una planta madura su reserva de compuestos fenólicos disminuye, como consecuencia de su incorporación en la pared celular del tallo en forma de lignina.

La aplicación de concentraciones de N mayores a 0.1 mM o 0.5 mM, resultó en menor contenido de compuestos fenólicos (ácido rosmarínico y cafeico) y menor actividad antioxidante, respectivamente, en dos cultivares de O. basilicum (Nguyen y Neimeyer, 2008). Además, Nguyen et al. (2010) reportaron que la AOX y el CFT de tres variedades de albahaca disminuyeron con la fertilización de 1.0 mM de K, en comparación con la aplicación de 2.0 mM de K, en magnitudes que dependieron de la variedad; este efecto también ha sido discutido por Kwee y Niemeyer (2011). Lo anterior indica que los valores determinados en el presente estudio son similares a los reportados en otras investigaciones; y de manera específica, la aplicación de 100 % de N resultó en menor actividad antioxidante (3.12 mM g^-1).

La AOX aquí determinada considera la actividad de compuestos enzimáticos y no enzimáticos extraídos del tejido foliar. El estudio de los compuestos enzimáticos o no enzimáticos con actividad antioxidante en plantas aromáticas o medicinales ha cobrado importancia por sus propiedades farmacéuticas, ya que contribuyen a reducir daños causado por radicales libres (Berdowska et al., 2013; Carol y Dolan, 2006; Foyer y Noctor, 2009; Garg y Manchanda, 2009; Gulçin et al., 2007; Impa et al., 2012; Sergent et al., 2012; Sharma y Bhat, 2009; Sharma et al., 2012).

En general, la aplicación de diversas dosis de nitrógeno en la solución nutritiva de Long Asthon, no afectó el crecimiento, desarrollo y nutrición de la planta de albahaca. Sin embargo, las dosis mayores a 25 % N disminuyeron el CFT y la AOX de esta especie vegetal. Lo anterior podría considerarse en sistemas de producción de O. basilicum, para favorecer sus propiedades nutraceúticas.

La fertilización nitrogenada no afectó el crecimiento de albahaca, pero alteró negativamente al contenido de compuestos fenólicos totales (CFT) y a la actividad antioxidante (AOX). La aplicación de dosis mayores a 25 % N disminuyó la acumulación de CFT y la AOX, de modo que para producir mayores cantidades de CFT y de AOX en plantas de albahaca, se propone usar dosis bajas de nitrógeno.

Agradecimientos

Esta investigación formó parte del proyecto SEP-CONACYT-130262. FJYH agradece el apoyo a CONACYT durante sus estudios de maestría. Los autores agradecen la revisión y comentarios de dos revisores anónimos que fortalecieron el presente manuscrito.

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