Funcionalidad antibacteriana y antioxidante de extractos hidroalcohólicos de Phellinus merrillii

Antibacterial and antioxidant functionality of hydroalcoholic extracts from Phellinus merrillii

Juan Manuel Leyva, Julio Jesumar Pérez-Carlón, Gustavo Adolfo González-Aguilar, Martín Esqueda, Jesús Fernando Ayala-Zavala*

Coordinación de Tecnología de Alimentos de Origen Vegetal, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Carretera a la Victoria km. 0.6. Apartado Postal 1735. Hermosillo (83000), Sonora, México.

* Autor para correspondencia:
J. Fernando Ayala-Zavala: jayala@ciad.mx

Recibido 18 de octubre 2012;
Aceptado 22 de mayo 2013.

Abstract

Recently the food, pharmacy and cosmetic industries have focused on the search for natural compounds with antimicrobial and antioxidant properties, commonly these compounds are obtained from plants. Nowadays, macroscopic fungus are being considered for the extraction these compounds. For this reason, the objective of the present work was to evaluate the antibacterial and antioxidant capacity of fractionated methanolic extracts (polar and non-polar) from Phellinus merrillii. The non-fractionated methanolic extract showed the highest content of phenolics (913.91 mg gallic acid equivalents/g, mgGAE/g), flavonoids (563.83 mg quercetin equivalents/g, mgQE/g), the lowest efficient concentration to inactivate the 50% of the free radical DPPH (0.1767 g/L), and the highest inhibition percent against Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica Choleraesuis and Listeria monocytogenes. Followed by the non-polar fraction with values 254.50 mgGAE/g, 179.44 mgQE/g and 0.7238 g/L, and the polar fraction 254.50 mgGAE/g, 163.98 mgQE/g and 1.1767 g/L. Moreover, the antibacterial activity correlated positively with the total phenolic, flavonoid content and antioxidant activity for all the extracts. Therefore, P. merrillii could be a source of antibacterial and antioxidant extracts.

Key words: Basidiomycetes, natural products, total phenolics, free radicals, antibiotic.

Resumen

En los últimos años las industrias de alimentos, farmacéutica y cosmética se han enfocado en la búsqueda de compuestos naturales con propiedades antimicrobianas y antioxidantes, los cuales se obtienen principalmente de plantas. Sin embargo, recientemente los hongos han sido considerados foco de estudio para la extracción de estos compuestos. Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad antibacteriana y antioxidante de extractos metanólicos fraccionados (polar y no polar) del hongo Phellinus merrillii. El extracto metanólico sin fraccionar presentó el mayor contenido de fenoles (913.91 mg de equivalentes de ácido gálico/g, mgEAG/g), flavonoides totales (563.83 mg de equivalentes de quercetina/g, mgEQ/g), la concentración eficiente más baja para inhibir el 50% del radical libre DPPH (0.1767 g/L) y el mayor porcentaje de inhibición contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica Choleraesuis y Listeria monocytogenes. Seguido de la fracción no polar con valores de 254.50 mgEAG/g, 179.44 mgEQ/g y 0.7238 g/L, y la fracción polar 254.50 mgEAG/g, 163.98 mgEQ/g y 1.1767 g/L. Adicionalmente, la inhibición bacteriana correlacionó positivamente con el contenido de fenoles, flavonoides y actividad antioxidante para todos los extractos. Por ello, el hongo P. merrillii podría ser una fuente de extractos con propiedad antibacteriana y antioxidante.

Palabras clave: Basidiomycetes, productos naturales, fenoles totales, radicales libres, antibiótico.

Introducción

La actividad antimicrobiana y antioxidante de una gran variedad de compuestos fenólicos de origen natural a partir de diferentes plantas han sido estudiados en detalle (Rodriguez-Vaquero et al., 2010). Estos compuestos desempeñan un papel importante en la protección contra agentes patógenos, reacciones de oxidación y pueden retrasar el crecimiento de microorganismos. Los compuestos fenólicos presentes en plantas como el ácido gálico y ácido elágico presentan capacidad para inhibir el crecimiento de hongos y bacterias (Zambuchini et al., 2008). Por otro lado, el uso de extractos de hongos como antioxidantes se está volviendo cada vez más popular (Mau et al., 2002).

Estudios recientes se han centrado en hongos de la división Basidiomycota, debido a la amplia gama de compuestos biológicamente activos que han sido aislados a partir de éstos (Muszynska et al., 2011; Balakumar et al., 2011). En especial los hongos del género Phellinus, son conocidos por su uso en la medicina tradicional de la cultura China (Muszynska et al., 2011). Los cuerpos fructíferos de estos hongos representan una fuente importante de fenoles, flavonoides, vitaminas y alcaloides con capacidad antioxidante y antibacteriana (Balakumar et al., 2011). Adicionalmente se ha considerado el cultivo sumergido de estos hongos para la obtención de extractos ricos en compuestos fenólicos (Jung et al., 2008). El potencial biotecnológico de estos hongos se refleja en el reciente aumento del número de patentes de sus aplicaciones como fuente de antioxidantes y antimicrobianos en farmacia y cosmética. Se patentó el uso del compuesto Phellinsina aislado de extractos de Phellinus sp. para uso en la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares, inhibiendo la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL), proponiendo su uso médico y alimentario (Kim et al., 2010). Otra de las patentes publicadas es la generación de extractos inmunomoduladores a partir de cultivos sumergidos de una mezcla de hongos, de los cuales resaltan Phellinus pini y Phellinus linteus (Kristiansen, 2006). Adicionalmente se ha patentado el efecto antimicrobiano y antioxidante de extractos de distintos hongos (P. linteus) y plantas con la finalidad de tratar el acné y fotoenvejecimiento (Maloney y Barger, 2010). Una aplicación en la industria alimentaria se refleja en la patente que plantea la adicción de extractos de micelio de distintos hongos dentro de estos P. linteus, para la formulación de una bebida tipo café con potencial antioxidante, el cual fue probado sobre líneas celulares de cáncer (Hammond et al., 2010).

Estudios previos sobre diferentes especies de Phellinus mostraron alta actividad antioxidante en sus extractos metanólicos, destacando el hongo Phellinus merrillii (Murr.) Ryv. (Ayala-Zavala et al., 2012a). Dicho extracto presentó el mayor contenido de fenoles y flavonoides totales, así como un menor EC₅₀ para la inactivación del radical libre DPPH, comparado con extractos de los hongos Phellinus badius (Cooke) G. Cunn, Phellinus fastuosus (Lév.) Ryv. y Phellinus grenadensis (Murr.) Ryv. La actividad antioxidante y antibacteriana de extractos naturales depende del disolvente usado para la extracción (Yang et al., 2009). Algunos procedimientos para la extracción de estos compuestos implican el uso de grasas y aceites, disolventes orgánicos, soluciones alcalinas y dióxido de carbono supercrítico (Pokorny y Korczak, 2001). Los disolventes alcohólicos han sido comúnmente empleados para extraer compuestos fenólicos de fuentes naturales; éstos dan un alto rendimiento del extracto total aunque no son altamente selectivos para compuestos fenólicos. Particularmente mezclas de alcoholes/agua han mostrado ser más eficientes en la extracción de compuestos fenólicos que el disolvente individual (Yilmaz y Toledo, 2006). Diferentes estudios muestran que el contenido de fenoles en los extractos varía con la polaridad de los disolventes. Por ejemplo, metanol absoluto es regularmente utilizado para la extracción de polifenoles del té (Yao et al., 2006), mientras que la fracción con acetona al 50% resultó ser más eficiente que el agua para la extracción de compuestos fenólicos del trigo (Zhou y Yu, 2004). En este contexto es importante optimizar el proceso de extracción que permita obtener el mayor potencial antibacteriano y antioxidante de extractos de hongos. Debido a ésto, se propone evaluar el efecto de diferentes fracciones polares y no polares de extractos metanólicos del hongo P. merrillii sobre sus propiedades antibacterianas y antioxidantes.

Materiales y métodos

Preparación de extractos

Especímenes de hongos Phellinus fueron colectados en el municipio de Álamos, Sonora y secados a 60 °C por 3 días, la identificación taxonómica de P. merrillii se realizó de acuerdo a los métodos de Gilbertson y Ryvarden (1986). Se realizaron cortes en los tejidos del himenio del cuerpo fructífero de los hongos, los cuales fueron identificados en base a sus características macro y microscópicas. El ejemplar de Phellinus merrillii se conserva en la colección de macromicetos del Centro de Estudios Superiores del Estado de Sonora (CESUES 10330). Muestras de P. merrillii (10 g) se colocaron en recipientes conteniendo 100 mL de metanol:agua (7:3), macerándose en oscuridad por 10 días. Después de este tiempo, el extracto se filtró y el metanol del filtrado fue retirado usando un evaporador rotatorio a presión reducida y temperatura de 45 °C. La fracción acuosa se liofilizó, obteniendo el extracto seco con un rendimiento del 15 %, el cual se sometió a una hidrólisis alcalina con NaOH 4 M por 4 h en ausencia de luz. Después se realizó una hidrólisis ácida con HCl 4 M hasta alcanzar un pH de 2, en este punto se obtiene el extracto denominado metanólico. En la siguiente etapa el extracto hidrolizado se sometió a separación de fases mediante lavados con acetato de etilo, obteniendo dos fracciones: una fracción polar y una fracción no-polar (Oboh y Rocha, 2007). En total se obtuvieron 3 extractos: extracto metanólico, fracción polar y fracción no polar, a los cuales, se les evaluó la capacidad antioxidante y antibacteriana.

Contenido de fenoles totales

Los fenoles totales se determinaron de acuerdo al método de Folin-Ciocalteau propuesto por Singleton y Rossi (1965). La absorbancia fue determinada en un espectrofotómetro UV-Visible (Varian Cary 50 Bio) a una longitud de onda de 765 nm. Esta técnica se aplicó a cada una de las muestras por triplicado, la concentración de fenoles se calcula con base a la curva de calibración y se expresó como mg equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto (mgEAG/g).

Contenido de flavonoides totales

La determinación de flavonoides totales se realizó por el método descrito por Zhishen et al. (1999). La absorbancia de las muestras fue evaluada a una longuitud de onda de 415 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Visible (Varian Cary 50 Bio), ésto se realizó para cada uno de los extractos preparados anteriormente y por triplicado. La absorbancia de cada muestra se comparó con una curva estándar de quercetina. Los resultados se expresaron como mg equivalentes de quercetina por gramo de extracto (mgEQ/g).

Capacidad antioxidante DPPH

La capacidad de los extractos de P. merrillii para inhibirr al radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) fue calculada de acuerdo al método propuesto por González-Aguilar et al. (2007). La inhibición del radical se observó mediante la disminución de la absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro UV-Visible (Varian Cary 50 Bio). Los resultados se expresaron como EC₅₀ que es la concentración eficiente de los extractos para inhibir al 50% la actividad del radical DPPH.

Capacidad antibacteriana

Se evaluó la capacidad antibacteriana de los diferentes extractos contra las cepas patógenas de Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Choleraesuis (ATCC 7001), Listeria monocytogenes (ATCC 7644), Escherichia coli O157:H7 (ATCC 43890) y Staphylococcus aureus (ATCC 6538). Como inóculo se utilizaron tubos con caldo soya tripticasa con un crecimiento de 1x10⁵ UFC/mL para cada bacteria. Se agregó 1 mL de cada inóculo en tubos con caldo Muller Hinton (1 mL) y 2 concentraciones de cada extracto (4.2 mg/mL y 2.1 mg/mL) y se incubó por 24 h. Posteriormente se procedió a realizar un conteo en placa por estriado en agar Müller Hinton tomando una alícuota (1 μL), y se incubó por 24 h a 37 °C. La inhibición bacteriana se calculó comparando las UFC de un control contra cada tratamiento y se expresó como porcentaje de inhibición.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza (P = 0.05) con un diseño completamente al azar, donde se evaluó el efecto de los factores: extracto metanólico, fracción polar y fracción no polar, sobre las variables de respuesta: fenoles totales, flavonoides totales, EC₅₀ (DPPH), y % de inhibición de las bacterias, el análisis de medias se realizó por la prueba de Tukey-Kramer. Se realizaron correlaciones de Pearson (P= 0.05) del contenido de fenoles, flavonoides totales y capacidad antioxidante de cada cepa evaluada, esto se llevó a cabo en el paquete estadístico NCSS versión 2007.

El contenido de fenoles totales obtenido de los distintos extractos de P. merrillii se muestra en la Figura 1a, en la cual podemos observar la diferencia significativa (P = 0.05) del contenido de fenoles encontrada entre el extracto metanólico y las fracciones polar y no polar (913.91, 257.89 y 254.50 mgEAG/g, respectivamente), siendo el extracto metanólico tres veces mayor que las fracciones polar y no polar, entre las cuales no se encontraron diferencias significativas (P>0.05).

Los resultados obtenidos en flavonoides (Figura 1b) muestran la misma tendencia observada para el caso de los fenoles. Encontrando diferencia significativa entre extractos (P= 0.05), siendo el extracto metanólico el de mayor contenido con 563.84 mgEQ/g, mientras que la fracción polar y no polar presentaron valores de 163.99 y 179 mgEQ/g, respectivamente, siendo estas últimas estadísticamente iguales. El contenido de estos compuestos podría otorgar a los extractos evaluados un alto potencial antioxidante, el cual se cree pudiera estar relacionado a su vez con la actividad antibacteriana.

El extracto metanólico presentó el valor menor para inhibir el 50% del radical estable DPPH de EC₅₀ (0.1767 g/L), seguido de la fracción no polar (0.7238 g/L) y por último, la fracción polar (1.1776 g/L) (Figura 1c), encontrando diferencia significativa entre los extractos (P = 0.05). Lo que confirma la tendencia manifestada en la evaluación de los compuestos bioactivos (fenoles y flavonoides totales).

Trabajos previos indican que los procedimientos y los disolventes de extracción afectan el contenido de fenoles y flavonoides en extractos de Phellinus spp. Los extractos metanólicos obtenidos de P. gilvus, P. rimosus y P. badius presentaron un contenido de fenoles totales de 49.30, 46.50 y 44.76 mgEAG/g, respectivamente, y flavonoides totales 30.58, 28.04 y 26.48 mgEQ/g, respectivamente; sin embargo, estos no fueron sometidos a hidrólisis ni separación de fases como en el presente estudio (Ayala-Zavala et al., 2012b). Comparando con un estudio similar donde se realizaron extractos metanólicos de P. merrillii, P. fastuosus, P. grenadensis y P. badius (Ayala-Zavala et al., 2012a), los cuales fueron hidrolizados y separados por polaridad en fracciones, se encontró que el organismo con mayor contenido de fenoles y flavonoides fue P. merrillii (873.66 mgEAG/g y 291.71 mgEQ/g, respectivamente). Se observó que las fracciones no polares presentaron el mayor contenido de dichos compuestos, incluso mayores a los resultados obtenidos en el presente estudio de la fracción no polar. Esta variación se puede atribuir a los diferentes factores bióticos y abióticos que se involucran en el hábitat de los hongos (Zhu et al., 2011). Haciendo una comparación entre el contenido de fenoles y flavonoides de las fracciones polar y no polar del trabajo previo con P. merrillii y el presente estudio, se observa que la separación de fases puede causar una disminución del contenido fenólico en el extracto metanólico. El proceso de extracción de compuestos fenólicos a partir de Xerula furfuracea, Schizophyllum commune, Polyporus tenuiculus, Hygrocybe conica y Pleurotus florida, presentó un mayor rendimiento al utilizar metanol como disolvente que éter de petróleo (Wong y Chye, 2009). En ese mismo estudio los extractos de H. conica presentaron contenidos de fenoles totales de 42.21 y 28.23 mgEAG/g, usando metanol y éter de petróleo, respectivamente.

Estudios previos muestran una relación directa entre el contenido de compuestos fenólicos y la capacidad antioxidante de extractos de Phellinus spp. Extractos metanólicos de P. gilvus presentaron un EC₅₀ de 9 g/L, seguido por los extractos de P. rimosus y P. badius con 10 y 13 g/L, respectivamente; siendo alto el EC₅₀ de P. gilvus comparado con los obtenidos en el presente estudio (Ayala-Zavala et al., 2012b). El extracto no polar de P. badius mostró la concentración más alta, seguido por su fracción polar, la fracción polar de P. grenadensis, polar de P. merrilli, polar de P. fastuosus, no polar de P. grenadensis, no polar de P. fastuosus y no polar de P. merrillii (6.00, 3.42, 2.22, 2.14, 1.89, 1.31, 0.88, 0.45 g/L, respectivamente) (Ayala-Zavala et al., 2012a). El extracto de éter de petróleo de la especie P. florida presentó una EC₅₀ de 1.87 g/L (Wong y Chye, 2009), la cual es mayor al valor obtenido en este estudio para el extracto metanólico de P. merrillii.

El potencial antibacteriano de los extractos de P. merrillii se evaluó contra cepas Gram (+) (L. monocytogenes y S. aureus) y Gram (-) (S. Choleraesuis y E. coli O157:H7). Se observaron diferencias (P = 0.05) entre extractos y concentraciones, la concentración de 4.2 mg/mL de cada uno de los distintos extractos presentó un 100% de inhibición contra todas las bacterias expuestas. No obstante, para la concentración de 2.1 mg/mL se observaron diferentes porcentajes de inhibición según la cepa evaluada; el extracto metanólico fue el más efectivo contra S. aureus, E. coli, L. monocytogenes y S. Choleraesuis, con valores de 63.14, 61, 38 y 35 %, respectivamente. Los extractos polar y no polar presentaron la misma tendencia, contra S. aureus (53.86 y 42 %), seguido de E. coli (36 y 48 %) y S. Choleraesuis (35 y 38 %) y L. monocytogenes (22 y 25 %o), respectivamente. En este contexto se observa que el extracto metanólico fue el más efectivo contra S. aureus.

Extractos acuosos de P. gilvus fueron evaluados como antimicrobianos contra distintas cepas Gram positivas como S. aureus, Staphylococcus epidermis, Bacillus subtillis, Lactobacillus plantarum, y como Gran negativas E. coli, Salmonella typhimurium y Klepsiella pneumonia, presentando únicamente inhibición contra las cepas de L. plantarum, E. coli y K. pneumonia con concentraciones mínimas inhibitorias de 45, 360 y 90 mg/L, respectivamente (Sittiwet y Puangpronpitag, 2008), a diferencia de lo encontrado en nuestro estudio donde los extractos de P. merrillii presentaron actividad antibacteriana contra cepas gran positivas y gram negativas. En otro estudio se evaluaron extractos metanólicos de 22 plantas medicinales a las cuales se les determino la concetración minima de inhibición (CMI) contra E. coli, S. typhimurium, Salmonella typhi, Shigella sonnei y Helicobacter pylori obteniendo CMIs hasta de 20 mg/mL (Sakunpak y Panichayupakaranant, 2012), mientras que en nuestro estudio se pudo observar que con una concentración de 4.2 mg/mL no hubo crecimiento bacteriana. Con ello observamos el potencial de los extractos obtenidos en este trabajo comparado con la literatura en el cual se observa un alto contenido de compuestos fenólicos con actividad antibacteriana.

Se correlacionó el contenido de fenoles, flavonoides y EC₅₀ contra la actividad antibacteriana de los extractos, resultando coeficentes de correlación de person (r) de 0.89 (P=0.0013), 0.7457 (P=0.0211), 0.7087 (P=0.0015) y 0.8853 (P=0.0326), para la inhibición de L. monocytogenes, S. aureus, S. Choleraesuis y E. coli O157:H7, respectivamente. El contenido de flavonoides totales correlacionó con valores de R=0.8816 (P=0.0017), 0.7598 (P=0.0175), 0.6926 (P=0.0031) y 0.8584 (P=0.0387), para la inhibición de L. monocytogenes, S. aureus, S. Choleraesuis y E. coli O157:H7, respectivamente. De la misma manera la actividad antioxidante (EC₅₀) se correlacionó con valores de R=0.8562 (P=0.0032), 0.4554 (P=0.2180), 0.989 (P=0.0001) y 0.8039 (P=0.0090), para la inhibición de L. monocytogenes, S. aureus, S. Choleraesuis y E. coli O157:H7, respectivamente. Las correlaciones obtenidas en este estudio representan favorablemente la relación entre el contenido y la actividad antioxidante de los extractos de P. merrillii contra su actividad antibacteriana.

Los extractos obtenidos del hongo basidiomiceto P. merrillii (extracto metanólico, fracción polar y fracción no polar) presentaron un alto contenido de compuestos bioactivos como fenoles y flavonoides, siendo mayoritario para el extracto metanólico, seguido por las fracciones. Esta tendencia se manifestó sobre la capacidad antioxidante y la capacidad antibacteriana contra cepas enteropatógenas. Por lo tanto, se propone el método de extracción metanólica como un método eficaz en la generación de extractos antioxidantes y antibacterianos a partir de P. merrillii.

Literatura citada

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