Perfil biológico de hongos anamórficos del sureste de México
Biological profile of anamorfic fungi from southeast Mexico
Manuela Reyes Estebanez 1, Gabriela Heredia Abarca2, María Marcela Gamboa Angulo1 *
1 Unidad de Biotecnología, Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Calle 43 No. 130, Chuburná, Mérida 97200, Yucatán, México.
2 Departamento de Biología de Suelos, Instituto de Ecología A.C., Km. 2.5 carretera antigua Xalapa–Coatepec, Xalapa 91000, Veracruz, México.
]]>* Autor para correspondencia:
mmarcela@cicy.mx
Recibido 11 de agosto 2008
Aceptado 30 de noviembre 2008
Abstract
Leaf litter fungi Beltraniella japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Gliomastix murorum and MR45 were cultured in two liquid mediums, Czapeck–Dox–yeast extract (CDY) and potato dextrose broth (PDB). In each case, mycelium was separated from the broth filter, and both were macerated with EtAcO, producing filtrate fungal extracts (FFE) and mycelium extract (MFE). These were evaluated by the reduction of radical 2, 2–diphenyl–1–picrylhydrazyl (DPPH) assay, and by microdilution antimicrobial test against four pathogenic microorganisms. The results showed high ability to DPPH reduction in FFE of B. japonica, G. murorum, and MR45 in PDB and CDY. The highest antimicrobial activity was detected against S. aureus produced by both Beltraniella strains (200 µg) in PDB and against E. carotovora by MFE of B. japonica in CDY. In both mediums, this strain produced mellein, no other metabolite was identified from the active extracts. The biological profile and initial chromatographic explorations of the active extracts confirm metabolic diversity in our tropical fungi, which could be utilized to improve the production of metabolites useful in pharmacy and agriculture.
Key words: Antimicrobial, antioxidants, tropical fungi, mellein.
]]>Resumen
Los hongos Beltraniella japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Gliomastix murorum y MR45 asociados a hojarasca, se cultivaron en dos medios líquidos, Czapeck–Dox–extracto de levadura (CDL) y caldo de papa dextrosa (CPD). En cada caso, el micelio se separó del filtrado y ambas fases se sometieron a maceración con AcOEt obteniendo los correspondientes extractos fúngicos de filtrado (EFF) y micelio (EFM). Éstos se evaluaron en los ensayos de reducción del radical 2,2–difenil–1 –picrilhidrazilo (DPPH) y el antimicrobiano por microdilución contra cuatro patógenos. Los resultados mostraron una alta capacidad antioxidante en los EFF de B. japonica, G. murorum y MR45, en los medios CPD y CDL. La actividad antimicrobiana más alta se detectó contra S. aureus, producido por las dos cepas de Beltraniella (200 µg) en CPD y contra E. carotovora en el EFM de B. japonica en CDL. En ambos medios, B. japonica produce meleína, no obstante, para las demás cepas activas no se identificaron los componentes. El perfil biológico y las exploraciones preliminares por cromatografía de gases – espectrometría de masas (CG–EM) de los extractos activos confirman la versatilidad metabólica de los hongos del trópico mexicano, los cuales pueden ser susceptibles de manipulación para la producción de metabolitos útiles en farmacia y agricultura.
Palabras clave: Antimicrobianos, antioxidantes, hongos tropicales, meleína.
Introducción
Los hongos son ampliamente reconocidos como una fuente prolífera de metabolitos secundarios con una gran diversidad estructural, a los cuales se les han atribuido diversas propiedades biológicas de gran beneficio para la humanidad. Entre ellos se encuentran la penicilina (Penicillium chrysogenum) y las cefalosporinas (Cephalosporium chrysogenum) antibióticos de amplio espectro utilizadas en medicina humana (Adrio y Demian, 2003); en el campo de la agricultura se encuentra la beauvericina de Beauveria brongniartii (Strasser et al., 2000), las ofiobolinas de Cochliobolus heterostrophus como nematicidas (Anke y Sterner, 2002); y alantrifenona, alantripineno y alantrileunona (Eupenicillium spp.) como insecticidas (Fabio et al., 2005), entre otros.
Los reportes en la literatura, sugieren que la producción de metabolitos secundarios se realiza en la idiofase, que es aquella en la cual el crecimiento activo ha cesado (Calvo et al., 2002; Keller et al., 2005). Por otra parte, la cantidad y variedad de estos se produce en respuesta a factores abióticos (pH, temperatura, disponibilidad de nutrientes, espacio, luz y agua) y bióticos (interacción con bacterias, actinomicetos, hongos, protozoarios, artrópodos, nematodos, etc.) que desvían el curso normal del metabolismo primario (Frisvad et al., 1998; Strohl, 2000; Adrio y Demian, 2003). Esto se refleja en los cultivos in vitro, donde la variación de los nutrientes y las condiciones de incubación son utilizados como una estrategia para inducir o estimular una mayor producción de metabolitos secundarios bioactivos (Casas–López et al., 2004; Keller et al., 2005). En general, la industria farmacéutica, prefiere los cultivos sumergidos, ya que el proceso es más simple, la disponibilidad de nutrientes y la aeración son más homogéneos, las rutas bioquímicas oxidativas se conservan el mayor tiempo posible, además de que el tiempo de crecimiento es menor que en el estado sólido, permitiendo el control de parámetros como pH, temperatura, nutrientes, etc. (Robinson et al., 2001).
En particular, en nuestros laboratorios se han detectado hongos anamórficos de la región sureste de México con promisorio potencial biotecnológico. Entre éstos se seleccionaron a las cepas de Beltraniella japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp., Gliomastix murorum y MR45 por mostrar un amplio espectro de actividad antimicrobiana y/o antioxidante al ser cultivados en el arroz fermentado (Reyes–Estebanez et al., datos no mostrados). Aun cuando éstos géneros han sido aislados en otros sitios, la actividad biológica no ha sido previamente documentada, por lo cual resulta de gran interés continuar estudiando estos hongos. Con estos antecedentes, en el presente estudio se planteó como objetivo evaluar la capacidad metabólica de las cepas seleccionadas para producir principios activos en dos medios líquidos, así como de iniciar la caracterización química de éstos, mediante el análisis por CG–EM.
]]> Materiales y métodos
Cepas fúngicas
Las cepas fúngicas Beltraniella japonica (GH18), B. portoricensis (MR42), Beltraniopsis sp. (GH19), Gliomastix murorum (MR36) y MR45 se obtuvieron del cepario del Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C.
Suspensión de esporas
Las cepas se inocularon en agar–maíz (AM) y se incubaron a 25 °C, con fotoperíodo de 12/12 horas luz/oscuridad, de 7 a 15 días. Cuando la superficie de la caja se cubrió totalmente se adicionaron 5.0 mL de una solución de cloruro de sodio al 0.85 % – tween 20 al 0.05 % (SST) (Gómez–López et al., 2005) y con un portaobjetos estéril se desprendieron las esporas cuidadosamente para obtener la suspensión correspondiente (Höller et al., 2000).
Cultivos líquidos
En matraces Erlenmeyer de 250 mL se depositaron 100 mL de a) caldo papa dextrosa (CPD, Bioxon) y b) Czapek Dox enriquecido con extracto de levadura (CDL), ajustados a pH 5 y 7 con ácido fosfórico, respectivamente. Éstos se inocularon con 1.0 mL de la suspensión de esporas de cada hongo y se mantuvieron a 25 °C, con fotoperíodo de luz/oscuridad de 12/12 horas, con una velocidad de agitación de 150 rpm, durante 20 días. Como blanco se utilizó el medio de cultivo con 1.0 mL de SST, sin inocular. Todos los experimentos se realizaron por triplicado (Trigos et al., 2005).
Al finalizar el período de crecimiento el caldo de cultivo se separó por filtración obteniendo la biomasa micelial y el filtrado. A éste último se le determinó el pH y ambas fases se liofilizaron, reportando la biomasa micelial en peso seco. Posteriormente, los liofilizados se sometieron a extracción con acetato de etilo a temperatura ambiente, por 24 horas, repitiendo el proceso tres veces. El disolvente se eliminó a presión reducida usando un rotavapor (Buchi), con baño de agua a 40 °C (Pittayakhajonwut et al., 2008).
Métodos analíticos
Los análisis por cromatografia de gases – espectrometría de masas (CG–EM) se realizaron en un cromatógrafo Agilent Technologies 6890N inyectando 0.4 µL de muestra a una concentración del 2 %, a una columna HP DB–5MS [(5 % difenil– 95 % dimetil polisiloxano, 30 m largo, 0.32 mm d.i, 0.5 µm espesor de la película), flujo de Helio = 1.2 mL/min, T1 = 140 °C, T2 = 300 °C, gradiente de 8°C/min] acoplado a un detector de masas selectivo Agilent Technologies 5975B. Los componentes se reportaron en minutos por su tiempo de retención (tR) en el CG y por su patrón de fragmentación en el EM, los cuales se compararon con la base de datos NIST 05MS spectra, 2006, software del equipo. El espectro de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1H) se determinó en un espetrometro Bruker – 400 a 400 MHz, usando acetona d6 como disolvente, los desplazamientos químicos se expresaron en ppm.
]]> Reducción del radical 2,2–difenil–1–picrilhidrazilo (DPPH)Los extractos fúngicos se disolvieron en acetona al 1.0 % (100 µg), se aplicaron en cromatofolios de gel de sílice 60F254 y se eluyeron con una mezcla de diclorometano–metanol 9:1 (por duplicado). El disolvente se eliminó por evaporación y las placas se observaron bajo luz ultravioleta de onda corta (UV254) y larga (UV365), marcando las manchas observadas. Uno de los cromatofolios se reveló con ácido fosfomolíbdico y el segundo con una solución de DPPH (2,2–difenil–1–picrilhidrazilo) al 0.2 % disuelto en metanol, el cual permaneció a temperatura ambiente durante 12 horas. Como control positivo se utilizaron 10 µg de Vitamina C al 1.0 % (Redoxón, Lab. La Roche). La aparición de manchas amarillas contra un fondo púrpura indicó la presencia de metabolitos antioxidantes que se reportaron por la referencia frontal (Rf = distancia recorrida por el metabolito en el cromatofolio/distancia recorrida por el disolvente) (Sánchez–Medina et al., 2001).
Microorganismos patogénicos
Las evaluaciones se realizaron contra las bacterias, Staphyloccocus aureus (Gram–positiva, ATCC 6633), Erwinia carotovora (Gram–negativa, ATCC 138), Xanthomonas campestris (Gram–negativa, ATCC 10547) y Candida albicans (ATCC 10231).
Bioensayo antimicrobiano por el método de microdilución
Las bacterias blanco se cultivaron en agar Müeller–Hinton (AMH) por 24 horas. Posteriormente, se transfirieron a caldo Müeller–Hinton (CMH) fresco y se incubaron a 37 °C (S. aureus y C. albicans) y 25 °C (E. carotovora y X. campestris), durante 18 horas. Los cultivos se ajustaron en CMH a una concentración final aproximada de 1 x 108 ufc/mL por comparación visual con el tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (Andrews, 2001).
Los extractos fúngicos se diluyeron en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración final de 16 µg/µL. En la primera fila de la microplaca se adicionaron 190 µL de medio CMH estéril y 10 µL del extracto fúngico (160 µg). Posteriormente, 100 µL de esta mezcla homogénea se transfirieron al siguiente pozo y así sucesivamente hasta el pozo No. 4. Finalmente todos los pozos se inocularon con 100 µL de la suspensión de bacteria blanco (200 µL de volumen final en cada pozo). La concentración final de los extractos fue de 400, 200, 100 y 50 µg/mL; para el DMSO de 2.5,1.25, 0.625, y 0.312 %; y las bacterias a 5 x105 ufc/mL. Las microplacas se mantuvieron en incubación a las mismas condiciones mencionadas anteriormente para los patógenos, por 24 horas. Como control positivo se utilizó amikacina al 1.0 % (µL) para bacterias y para la levadura neomicol (1.0 µg). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB)
Al finalizar el período de incubación, 1.0 µL de la mezcla de cada pozo se inocularon en agar Müeller–Hinton (AMH) y se incubaron a 25 o 37 °C por 24 horas, según el patógeno. La presencia de crecimiento bacteriano indicó un efecto bacteriostático y la ausencia de crecimiento un efecto bactericida (Taylor, 1983).
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)
]]> Una vez transcurrido el tiempo de incubación se adicionaron 50 µL de Cloruro de Trifenil Tetrazolium (TTC) al 1.0 % y se mantuvieron en incubación por 30 minutos. La coloración rojo intensa indicó la presencia de bacterias vivas y aquella concentración que permaneció incolora correspondió a la CMI (Andrews, 2001).Análisis Estadísticos
El porcentaje de biomasa micelial, los extractos orgánicos y el pH, se sometieron a un análisis de varianza utilizando el software SAS, seguido por comparación múltiple de medias (Turkey P= 0.05) (Steel y Torrie, 1986).
Resultados
Rendimientos de biomasa micelial
El análisis estadístico de la biomasa micelial producida en los dos medios de cultivo utilizados mostró que no existen diferencias significativas (ρ< 0.05) para B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. y MR45. Para G. murorum si existe diferencia significativa ya que presentó un incremento micelial del 64 % en el cultivo en CPD (1.06 g/100 mL de medio) respecto al rendimiento micelial en CDL (0.41 g/100 mL de medio).
Rendimiento de los extractos
Los EFM y EFF de los hongos en estudio, con excepción de MR45, mostraron diferencias significativas (P = 0.05) en los dos medios de cultivos empleados. En general, los mayores rendimientos en las extracciones con AcOEt se obtuvieron cuando las cepas se cultivaron en el medio CPD; tanto en los EFM (98 – 1645 mg/L de medio CPD) como en los EFF (52.7 – 1190 mg/ L), con respecto a los correspondientes en CDL.
Reducción del radical DPPH
]]> Los resultados del ensayo de la reducción del DPPH mostraron que las cepas B. japonica, G. murorum y MR45 poseen capacidad para producir metabolitos antioxidantes, en los dos medios de cultivo empleados (Tabla 1). En los tres casos, la actividad antioxidante se observó únicamente en los EFF. Asimismo, el perfil de composición en Rf es altamente variable en cada medio líquido. En CDL, cinco componentes diferentes se detectaron para las cepas B. japonica (Rf = 0.05, 0.12, 0.22, 0.4 y 0.8) y G. murorum (Rf = 0.25, 0.29, 0.35, 0.46, y 0.5). En CPD el componente activo para G. murorum es de mayor polaridad ya que se observan en el punto de aplicación (Rf = 0.012) y para B. japonica 0.12, que coincide con uno de los reportados en CDL. Por otra parte, la cepa MR45 revela la formación de dos componentes activos tanto en CPD (Rf 0.05 y 0.72) como en CDL (Rf 0.21 y 0.72), siendo los de menor polaridad de naturaleza similar en referencia frontal.Actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana se detectó en un total de 11 diferentes extractos obtenidos de las cinco cepas en estudio, cultivadas en dos medios líquidos diferentes (Tabla 1). La más alta actividad antibacteriana (CMI = 200 µg/mL) se detectó en los EFF en el medio CPD de las dos especies de Beltraniella contra S. aureus y en el EFM de B. japonica cultivada en CDL contra E. carotovora. En general, todas las cepas fúngicas evaluadas manifestaron actividad inhibitoria cuando menos contra dos patógenos, en al menos uno de sus extractos. La cepa MR45 mostró un espectro amplio de actividad antimicrobiana ya que fue capaz de inhibir el crecimiento de las tres bacterias blanco, E. carotovora, S. aureus y X. campestris. Por otra parte, los extractos de G. murorum no presentaron actividad antimicrobiana alguna. Entre las cepas patogénicas evaluadas, la más sensible correspondió a E. carotovora la cual se inhibió con los extractos de B. japonica, B. portoricensis, Beltraniopsis sp. y MR45, cuyos principios activos se detectaron cuando se cultivaron en el medio CDL. Otra cepa sensible fue S. aureus, cuyo crecimiento se detuvo ante seis extractos pertenecientes a tres cepas, (B. japonica B. portoricensis y MR45). Contra X. campestris solo se detectaron tres extractos capaces de inhibir su crecimiento, siendo estos el EFM y EFF de Beltraniopsis sp. y el EFF de MR45, obtenidos de CDL. Ninguno de los extractos evaluados mostró capacidad inhibitoria contra la levadura Candida albicans.
La actividad antimicrobiana se detectó principalmente en los extractos obtenidos cuando las cepas se cultivaron en el medio CDL (64 %). Entre éstos, los de B. japonica en CDL y todos los de B. portoricensis presentaron efecto bactericida; y para los extractos de Beltraniopsis sp. y MR45 en CDL el efecto se determinó como bacteriostático. En el medio CPD se registraron únicamente cuatro extractos activos, los EFM y EFF de B. portoricensis y el EFF de MR45 demostraron ser bactericidas; finalmente, el EFF de B. japonica con efecto bacteriostático sobre las bacterias patógeno.
Discusión
Un total de 20 extractos orgánicos se obtuvieron a partir del micelio y filtrado al cultivar los cinco hongos seleccionados en dos medios líquidos, uno definido (CDL) y otro indefinido (CPD). Ambos medios son ampliamente utilizados en el cultivo de hongos anamórficos (Paterson y Bridge, 1994; Vizcaíno et al., 2005), donde las especies seleccionadas crecieron exitosamente. Las evaluaciones antimicrobianas y antioxidantes de los extractos obtenidos tanto del micelio como del filtrado de cultivo demostraron que el 65 % de ellos tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de alguna de las bacterias evaluadas y/o la reducción del radical DPPH. Muy importante es destacar que la actividad estuvo dirigida en un 60 % hacia las bacterias Gram–negativas evaluadas, donde se observó principalmente un efecto bacteriostático (67 %). Para S. aureus la acción se detectó como bactericida en un 83 %.
En cuanto a la actividad antioxidante, las cepas de B. japonica, G. murorum y MR45 mostraron que sus EFF poseen varios metabolitos capaces de reducir el radical DPPH. Particularmente en el medio CDL se detectaron un mayor número de componentes activos, los cuales son excretados hacia el medio de cultivo por las células, ya que no se observan en los extractos miceliales. Las cepas mencionadas confirmaron su potencial antioxidante y en el presente estudio MR45 demostró producir metabolitos activos en los dos medios líquidos evaluados.
En general, únicamente el B. japonica mantuvo un perfil de actividad biológica similar al detectado cuando se cultivó en arroz fermentado (Reyes–Estebanez et al., datos no mostrados). Al analizar por CG–EM los cuatro extractos de este hongo, se observó la producción consistente (EFF y EFM en CDL; EFF en CPD) de un compuesto mayoritario con un tiempo de retención de 7.95 minutos y un ión molecular a m/z 178, el cual se identificó con la base de datos de EM del equipo como meleina. Esto se confirmo por la comparación de sus datos de resonancia magnética nuclear de protones (1.55, 2.95, 4.76, 6.72, y 7.44 ppm) con los reportados en la literatura para este compuesto (Cole et al., 2003). Meleina, también denominado ochracina, es un metabolito aislado de Microsphaeropsis sp., y reportado con actividad antimicrobiana (Höller et al., 1999), pero no antioxidante. Esto concuerda con lo encontrado en nuestro trabajo ya que los tres extractos de B. japonica que contienen meleína demostraron alguna acción antibacteriana. Sin embargo, el EFM en CDL no fue capaz de reducir al DPPH, aún cuando diversos derivados de meleina han sido reportados con actividad antioxidante (Choudhary et al., 2004).
El cuanto G. murorum, al ser cultivado en los dos medios líquidos, perdió sus propiedades antimicrobianas, permaneciendo las antioxidantes en los EFF de CDL y CDP Los CG–EM de EFM y EFF en CDL revelaron dos componentes mayoritarios de tiempo de retención de 9.96 y 18.5 minutos, con su ión molecular a m/z 190 y 320, respectivamente. Sin embargo, éstos no correspondieron a ninguno de los compuestos de la base de datos del equipo, surgiendo la posibilidad de que se trate de estructuras poco comunes o novedosas. No se detectaron componentes en los CG–EM de los extractos en CPD, en la columna utilizada. Lo anterior permite deducir la diferencia del contenido en los extractos cuando en G. murorum se varía el medio de cultivo. Gliomastix es un género que ha sido muy poco explorado en cuanto a su contenido químico y taxonómicamente ha sido relacionado con el género Acremonium. En este aspecto, de una cepa de Acremonium sp., ha sido reportada la acremonina A y su glucósido como metabolitos antioxidantes (Abdel–Lateff et al., 2002).
]]> Los CG–EM del resto de los extractos activos de las cepas en estudio, indicó una alta variabilidad de componentes es sus cromatogramas. La mayor parte de estos no identificados, por lo que resultan de mucho interés para continuar las investigaciones químicas de estas especies.El análisis integral de los resultados indica que en el medio de CDL las cepas en estudio expresan mayor actividad biológica y variabilidad biosintética. Este comportamiento en los hongos ha sido ampliamente documentado en relación a los factores abióticos del medio artificial donde se cultivan (Frisvad et al., 1998; Strohl, 2000; Bode et al., 2002; Adrio y Demian, 2003).
En conclusión, se recomienda continuar el cultivo de estas cepas en el medio líquido de Czapek Dox enriquecido con extracto de levadura, ya que además de las propiedades biológicas y biosintéticas que se detectaron en las cepas estudiadas, resulta más fácil controlar los nutrientes, el pH y la aireación, con el propósito de llegar a optimizar la expresión de los principios activos (Demian, 2006).
Las exploraciones preliminares del comportamiento metabólico de cinco hongos anamórficos pertenecientes a la micoflora del sureste de México, guiaron a confirmar que éstos poseen la capacidad de producir metabolitos secundarios bioactivos aún cuando sean mantenidos en medios de cultivo diferentes. Este trabajo constituye una aportación enfocada hacia la aplicación biotecnológica a futuro de los hongos anamórficos de estas regiones poco exploradas. Estudios de la toxicidad e identificación estructural de los principios activos, así como de identificación taxonómica molecular se encuentran en curso.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Susana De la Rosa–García, Fabiola Escalante y Luis Torres por su valioso apoyo en los CG–EM. Este trabajo fue financiado por la REDEMIC (XII.J.) del CYTED y el CONACyT (Proyecto No. 45794) y se agradece la beca doctoral a M.M.R.E. (84426).
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