Evaluación del efecto estrogénico por filtros UV en el pez sargento Abudefduf saxatilis
Evaluation of the estrogenic effects of UV filters on the sergeant major damselfish, Abudefduf saxatilis
Mélina Soto, Gabriela Rodríguez-Fuentes*
Unidad de Química Sisal, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Colón 503 F X 62 y Reforma Colonia Centro, Mérida, 97000, Yucatán, México.
]]> * Corresponding author. E-mail: grf@unam.mx
Received January 2014,
Accepted September 2014.
Resumen
La oxibenzona, el octil salicilato y el octinoxato son compuestos empleados en una gran variedad de productos como protección contra la exposición a la radiación ultravioleta. En los últimos años ha aumentado la preocupación en cuanto a su seguridad ambiental, ya que estudios han demostrado que tienden a bioacumularse y actuar como xenoendocrinos en organismos acuáticos. A la fecha, no se han realizado estudios sobre su impacto en especies asociadas a arrecifes tropicales. Por ello, el presente trabajo investiga los efectos estrogénicos de tres filtros ultravioleta en el pez sargento, Abudefduf saxatilis. Dada la falta de información genómica disponible para A. saxatilis, una primera parte del estudio consistió en aislar y secuenciar los genes de la vitelogenina (VTG) y β-actina. En una segunda etapa, se estudiaron los efectos estrogénicos de estos tres compuestos evaluando la inducción de la expresión genética y de la síntesis de la VTG en organismos juveniles (<5 cm). Los peces se inyectaron intraperitonealmente con dosis de 5, 25 y 50 μg g-1 peso húmedo de oxibenzona, octil salicilato, octinoxato y una mezcla de ellos en proporciones similares a las empleadas en las lociones comerciales. Aunque se observó un aumento en la producción de fósforo lábil al álcali en todas las muestras tratadas con los filtros UV, el incremento sólo fue estadísticamente significativo en el control positivo (17β-estradiol). El incremento en la expresión relativa del gen fue también estadísticamente significativo únicamente en el control positivo.
Palabras clave: bloqueador solar, Abudefduf saxatilis, vitelogenina.
Abstract
]]> Oxybenzone, octyl salicylate, and octinoxate are compounds used in a variety of products as a protection against exposure to ultraviolet radiation. Concerns have emerged regarding their environmental safety as previous studies have shown that they tend to bioaccumulate and act as potential xenoestrogens in aquatic organisms. To our knowledge no studies have investigated their impact on tropical reef-associated species. Thus, the aim of the present study was to evaluate the estrogenic effects of these three compounds on the abundant, reef-associated sergeant major damselfish, Abudefduf saxatilis. As no genomic information of A. saxatilis was available, the first part of the study was to isolate and to sequence the vitellogenin (VTG) and β-actin genes. In the second part, the potential estrogenicity of the three compounds in juvenile fish (<5 cm) was studied using gene expression and protein synthesis analyses to evaluate the induction of VTG Fish were exposed to doses of 5, 25, and 50 μg g-1 of oxybenzone, octyl salicylate, octinoxate, and to a mixture of them in a similar proportion to the one used in commercial personal care products. An increment in alkali-labile phosphate was observed in all treatments, but it was only statistically significant in the positive control (17β-estradiol). Relative gene expression was only statistically augmented in the positive control.Key words: sunscreen, Abudefduf saxatilis, vitellogenin.
INTRODUCCIÓN
Los problemas dermatológicos debidos a la radiación ultravioleta (UV) han impulsado el desarrollo de compuestos orgánicos capaces de absorber los rayos UV y atenuar los impactos negativos de la exposición al sol. Su espectro de uso se ha diversificado y se pueden encontrar ahora también como aditivos en numerosos productos (Schlumpf et al. 2004).
Los compuestos como la oxibenzona (3-benzofenona, 2-hidroxi-4-metoxifenil benzofenona), el octil salicilato (2-etilhexil salicilato) y el octinoxato (2-etilhexil trans-4-metoxicinamato) son usados en diferentes productos para la protección contra la radiación solar, en particular en las lociones cosméticas bloqueadoras solares (Giokas et al. 2007). Una serie de encuestas realizadas en la zona hotelera de Cancún mostró que estos tres compuestos se encuentran entre los cinco ingredientes activos en las lociones bloqueadoras más usadas por los turistas nacionales, extranjeros y habitantes de la zona (Rodríguez-Fuentes et al. 2010).
El posible impacto endocrino de los filtros UV fue sugerido por primera vez hace un poco más de una década, cuando se registró que la exposición a estos compuestos altera el desarrollo de embriones de ratas (Schlumpf et al.2001). Desde entonces, se han multiplicado los estudios sobre la actividad estrogénica y antitiroidal de ciertos filtros UV (Schlumpf et al. 2004, Giokas et al. 2007, Díaz-Cruz y Barceló 2009). Coronado et al. (2008) registraron una clara respuesta estrogénica en truchas y medaka japonés debida a la exposición a la oxibenzona. Aunque la respuesta se observó a concentraciones mayores que las registradas en el ambiente, hay que tomar en cuenta que estos compuestos son propensos a bioacumularse (Buser et al. 2006, Bachelot et al. 2012).
La vitelogenina (VTG) es un biomarcador molecular comúnmente usado para detectar rápidamente los efectos estrogénicos de compuestos químicos en muestras biológicas (Kime et al. 1999, Rotchell y Ostrander 2003). La VTG es la fosfoglucolipoproteína precursora de la yema de huevo expresada bajo condiciones normales en las hembras maduras de peces, reptiles, anfibios y aves. Bajo contaminación con compuestos xenoendrocrinos, la expresión de la VTG se puede inducir tanto en machos como en organismos juveniles (Kime et al. 1999, Scholz et al. 2004). Se suele usar la expresión del gen de VTG, así como el nivel de proteína inducida, para monitorear las alteraciones endocrinas en estudios de riesgo ambiental (Van der Oost et al. 2003).
Algunos peces como el medaka japonés Oryzias latipes, el pez cebra Danio rerio, la carpita cabezona Pimephales promelas y la trucha arcoiris Oncorhynchus mykiss han sido considerados modelos apreciados para los estudios de las alteraciones endocrinas (Scholz et al. 2004, Kunz et al. 2006, Coronado et al. 2008). Desafortunadamente, a la fecha, no se han estudiado estos efectos en peces arrecifales caribeños, los cuales podrían ser más susceptibles de encontrarse expuestos a filtros UV por la intensa actividad turística.
El pez sargento, Abudefduf saxatilis (Linnaeus 1758), es abundante, de distribución amplia, territorialista, de fácil identificación y omnívoro, y vive en las zonas someras de los arrecifes y lagunas costeras. Los juveniles del pez sargento (<5 cm) se encuentran en zonas someras de las lagunas arrecifales y las charcas intermareales, lo cual facilita su muestreo. Bajo condiciones normales, no presentan expresión de la VTG hasta su madurez sexual (aproximadamente un año, >10 cm) (Robertson 1988). Estas características vuelven al pez sargento un organismo de particular interés en el monitoreo de la contaminación en zonas arrecifales.
]]> En este trabajo se estudió el efecto de tres filtros UV y una mezcla de ellos sobre la síntesis de la vitelogenina en los juveniles de A. saxatilis con la posibilidad de sentar bases en su uso posterior como especie centinela en estudios de eco-toxicología en la zona arrecifal caribeña.
MATERIALES Y MÉTODOS
La captura de los organismos se llevó a cabo bajo el permiso de pesca de fomento No. DG0PA.09749.140909.3161 por parte de la Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación, y con revisión del Instituto Nacional de Pesca y la Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Los juveniles de A. saxatilis fueron capturados usando redes de acuario en las charcas intermareales de punta Brava, Quintana Roo, y fueron trasladados rápidamente a estanques de aclimatación. El diseño experimental del presente bioensayo tomó en consideración las recomendaciones de APHA et al. (2005, sección 8910)
Se capturaron solamente individuos con una longitud total menor que 5 cm y mayor que 2 cm para asegurar su estadio juvenil. Todos los organismos usados en este estudio se aclimataron en ocho estanques de fibra de vidrio de aproximadamente 60 L, con flujo continuo independiente de agua de mar filtrada. Los organismos fueron aclimatados durante tres semanas previas al bioensayo. Durante todo el tiempo de aclimatación, se les alimentó ad libitum dos veces al día con alimento comercial para peces tropicales y nauplios vivos de Artemia salina.
Dado que la expresión del gen de VTG es regulada hormonalmente, para la obtención de la secuencia de VTG, se expusieron peces sargento con 17β-estradiol (E2). Cinco organismos en estanques de 20 L separados fueron expuestos a una concentración de 100 ng L-1 de E2 durante tres días con cambios parciales de agua diariamente. Los parámetros ambientales fueron medidos mediante una sonda multi-parámetro HACH SenslON 5: temperatura, 27.2 ± 0.3 °C; salinidad, 28.2 ± 0.1; oxígeno disuelto, 7.7 ± 0.3 mg L-1; pH, 7.85 ± 0.2. Los organismos se disectaron inmediatamente después del sacrificio para la remoción de su hígado, y las muestras se almacenaron en RNALater a -80 °C.
Para el bioensayo del efecto estrogénico de los filtros UV, los compuestos fueron diluidos en 2.5 mL de etanol grado biología molecular aforando a 10 mL con aceite de maíz (Leaños-Castañeda y Van Der Kraak 2007). La concentración se calculó de manera que el volumen final de inyección fuera de 10 μL por gramo de pez en peso húmedo. Los tratamientos utilizados consistieron en un control positivo (E2 a una dosis de 5 μg g-1); un control negativo de solvente (25% etanol grado biología molecular en aceite de maíz); tres tratamientos con oxibenzona (dosis de 5, 25 y 50 μg g-1); tres tratamientos con octil salicilato (dosis de 5, 25 y 50 μg g-1); tres tratamientos con octinoxato (dosis de 5, 25 y 50 μg g-1); y una mezcla que contenía 5 μg g-1 de oxibenzona + 6 μg g-1 de octil salicilato + 7.5 μg g-1 de octinoxato (proporción que es común en las cremas bloqueadoras solares que se venden comercialmente). Las dosis se seleccionaron con base en estudios preliminares para garantizar la subletalidad del ensayo.
Siete organismos juveniles por tratamiento, con una talla entre 2 y 5 cm, fueron inyectados intraperitonealmente (para garantizar la captación de los compuestos) usando jeringas estériles para insulina de 0.3 mL con aguja corta. La aplicación de los compuestos fue en una inyección única para minimizar el daño por manejo del organismo durante el experimento.
Durante la exposición (96 h), se monitorearon los parámetros ambientales: temperatura del agua, 26.3 ± 0.6 °C; salinidad, 29.3 ± 0.1; pH, 8.1 ± 0.2; y oxígeno disuelto, 8.5 ± 0.5 mg L-1. Inmediatamente después del sacrificio por choque hipotérmico, aproximadamente dos tercios del hígado fueron guardados en glicerol al 20% para un posterior análisis de la proteína y el tercio sobrante fue almacenado en RNALater para la cuantificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Las muestras se guardaron a -80 °C hasta sus respectivos análisis.
Para la extracción de ARN, se utilizó el Sigma GenElute Total RNA Miniprep Kit siguiendo las instrucciones del fabricante. La cuantificación del ARN obtenido se realizó mediante la técnica descrita por Gallagher y Desjardins (2006), y la absorción se midió a 260 nm en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. La retrotranscripción se realizó usando el kit de Invitrogen Superscript III First Strand Synthesis Super Mix siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la obtención de fragmentos de los genes VTG y β-actina, se diseñaron oligonucleótidos a partir de secuencias registradas para peces marinos (tabla 1). Se realizaron las amplificaciones por medio de PCR punto final para los oligonucleótidos diseñados. Las condiciones de amplificación fueron una desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min; seguida de 35 ciclos a 95 °C durante 30 s, a 60 °C durante 30 s y a 72 °C durante 30 s; y una extensión final a 72 °C durante 5 min. Posteriormente, se purificaron los amplicones. La secuenciación se realizó en el Genome Center de la Universidad de California en Riverside. Se realizó un análisis de alineamiento de tipo local (BLAST) de las secuencias en el sitio del NCBI para compararlas con las secuencias disponibles en la base de datos GenBank y buscar la identidad de las mismas.
]]> A partir de las secuencias obtenidas, se diseñaron oligonucleótidos de cuantificación (tabla 1). Los análisis de qPCR fueron realizados en un equipo Applied Biosystems StepOne de 48 pozos. Se usaron los reactivos provistos por el kit Platinum SYBR Green de Invitrogen y se siguieron las recomendaciones del proveedor. La eficacia del método se verificó realizando una serie de diluciones de cADN para cada una de las parejas de oligonucleótidos. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 95 °C durante 30 s, a 60 °C durante 30 s y a 72 °C durante 30 s. La curva de desnaturalización de ADN consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 15 s, seguida de una rampa de 60 a 95 °C con un incremento de 3 °C cada 15 s.Para la cuantificación de la expresión relativa, se empleó el método ΔΔCt. El gen de β-actina se eligió como gen de control interno al verificar que no existía un efecto del tratamiento en su expresión. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los Ct de β-actina entre ninguno de los tratamientos (P >0.05).
La determinación de VTG se realizó mediante el método de fósforo lábil al álcali (ALP, Gagné y Blaise 2000). El método está basado en la precipitación de proteína con una serie de extracciones por solventes. Los fosfatos proteicos son entonces liberados tras una hidrólisis al álcali con NaOH. Los niveles de fosfatos se pueden medir por colorimetría debido a que el complejo azul de fosfomolibdato es formado por la reducción con molibdato y ácido ascórbico.
Los análisis estadísticos de los resultados y sus gráficas se realizaron con el programa Graph Pad Prism v5.0 (Graph Pad Software Inc., San Diego, EUA). Los resultados fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía no para-métrico de Kruskal-Wallis, seguido de un análisis post hoc de Dunn.
RESULTADOS
Dada la falta de información genómica sobre A. saxatilis, el aislamiento de las secuencias parciales de los genes de VTG y β-actina (el gen de referencia) fue un paso primordial para el desarrollo del estudio. El análisis BLAST de la secuencia obtenida para el gen de β-actina dio una máxima identidad del 93% con un valor esperado (valor E) de 2e-64. Las especies con ese porcentaje de identidad para β-actina fueron especies marinas tropicales como los meros Epinephelus merra y E. coioides, el lábrido Dicentrarchus labrax y la damisela Stegastes partitus. La secuencia de VTG dio 76% de máxima identidad contra las otras secuencias disponibles en el GenBank para VTG B. El análisis BLAST reveló similitud con especies marinas como el pargo Pagrus major (valor E de 2e-24 ), la lisa Mugil cephalus (valor E de 9e-23), el atún Thunnus thunnys (valor E de 3e-22) y la lubina Morone saxatilis (valor E de 1e-21). La secuencia parcial del gen de la VTG fue registrada en el GenBank con número de acceso JN178942. Por tener menos de 200 pb, la secuencia de β-actina (183 pb) no se registró.
En lo referente al bioensayo, ninguno de los organismos murió transcurridas las 96 h posteriores a la administración de los compuestos. Se observó un incremento de ALP en todos los tratamientos con filtros UV, pero el incremento sólo fue significativo para el tratamiento con E2 (fig. 1). Con respecto a la expresión relativa del gen de VTG, únicamente el control positivo con E2 presentó una inducción del gen estadísticamente significativa (fig. 2).
DISCUSIÓN
Estudios filogenéticos han demostrado que el grupo de los genes de VTG ha experimentado muchas variaciones a través de duplicaciones y rearreglos (Finn et al. 2009). Este grupo existía desde antes de la separación entre los tetrápodos y los peces hace unos 450 millones de años, y se ha seguido diferenciando hasta el punto de que en los teleósteos se ha descubierto la presencia de varias copias del gen (Finn et al. 2009). A la fecha, se han aislado hasta 20 genes de VTG en la trucha Oncorhynchus mykiss (Buisine et al. 2002), 11 en los lábridos Centrolbrus exoletus y Labrus mixtus, y 8 en el pez cebra Danio rerio (Wang et al. 2005, Finn et al. 2009). El nivel de expresión de estos genes parece depender de la especie, del sexo, de la etapa de desarrollo y hasta del tejido (Tong et al. 2004). En efecto, se han encontrado genes de VTG en tejidos diferentes, aunque con expresiones inferiores, como las gónadas (ovarios y testículos) y los intestinos (Wang et al. 2005, Woods et al. 2009).
Las pocas zonas de conservación en el gen de VTG entre las especies y el número de copias dentro de una misma especie dificultan entonces la obtención de la secuencia del gen cuando se desconoce. En este estudio se logró aislar y secuenciar una porción de un gen de VTG cuya expresión es inducida por E2 en el hígado. El análisis BLAST indicó que se podría tratar de un gen de VTG B por su similitud a otras VTG B registradas. Las VTG se dividen en tres tipos. Se considera que el gen VTG C es el más ancestral, y al ser ortólogo con el de la VTG de gallina, se cree que se separó del gen VTG A tras un evento de duplicación del genoma entero. En los teleósteos, el VTG A se habrá duplicado nuevamente y se formaron dos parálogos, VTG A y VTG B (Finn et al. 2009), los dos involucrados en la vitelogénesis.
Para todos los tratamientos con filtros UV, las expresiones relativas del gen de VTG y las concentraciones de ALP en los hígados de los juveniles de A. saxatilis expuestos no resultaron significativamente diferentes del control negativo. En concordancia a estos resultados, otros autores tampoco han encontrado un incremento en la concentración de VTG o en la expresión del gen en otros peces expuestos a oxibenzona (Kunz et al. 2006, Blüthgen et al. 2012); sin embargo, para el medaka japonés y la trucha se observó una inducción significativa de VTG a 629 y 749 μg L-1, respectivamente (Coronado et al. 2008). Con respecto al octinoxato, Inui et al. (2003) registraron un ligero incremento en la medición de VTG en el plasma del medaka japonés, pero contrario al presente estudio, encontraron un incremento significativo en la expresión del gen.
Las diferencias entre estos estudios pueden estar relacionadas con las dosis y el diseño experimental utilizado, y al tiempo y tipo de exposición. De manera simplificada, la VTG se sintetiza en el hígado por inducción de su gen codificante por elementos de respuesta formados por E2 en los receptores de estrógeno (Clelland y Peng 2009); es una cadena compleja de reacciones. La exposición de los organismos a E2 y los filtros UV en nuestro trabajo fue puntual y duró 96 h; al transcurrir este tiempo, se sacrificaron los organismos. Se midieron dos etapas importantes de esta cadena de reacciones: la inducción de la expresión del gen y la proteína sintetizada. Hay que tomar en cuenta que el esquema de exposición es completamente diferente al que se tiene en una exposición administrada en el agua durante tiempos de exposición más largos. Por ejemplo, en Pimephales promelas expuestos a 2-etil-hexil-4-trimetoxicinamato durante 14 días, Christen et al. 2011 encontraron un aumento en la concentración de la VTG en el plasma; sin embargo, la expresión del gen en diversos órganos no fue significativa. Otros trabajos han observado que existe un desfase entre la síntesis de la proteína y la expresión genética. Hyndman et al. (2010) estudiaron el efecto E2 en la vitelogenesis de machos de P. promelas, variando las dosis de exposición pero también el tiempo. En los tratamientos que no habían recibido una exposición algunos días antes del final del bioensayo no fue posible medir la expresión genética de VTG pero sí el nivel de la proteína en el plasma. Schmid et al. (2002) realizaron un estudio de cinética de la vitelogenesis en machos de P. promelas y descubrieron un efecto de saturación de la producción de mARN seguida de una rápida reducción tres días después de la exposición. Esto parece coincidir con los tiempos requeridos para la síntesis de VTG en diferentes especies de peces registrados por Navas y Segner (2006). Para la trucha O. mykiss, Vaillant et al. (1988) lograron determinar un tiempo de 2 h para la inducción del mARN por Dot Blot y un tiempo de 20 h para la síntesis de la proteína por medio del método radioinmunoensayo (RIA). Se han registrado tiempos de 24 a 96 h mediante el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y ALP (Navas y Segner 2006). Debido a este desfase entre la expresión genética y los niveles de proteína, Scholz et al. (2004) recomiendan la cuantificación de los niveles de proteína por ELISA para estudios duraderos; a exposiciones cortas la detección del mARN puede ser suficiente.
La falta de efecto también puede estar relacionada con diferencias específicas de la especie que pueden estar basadas en diferencias en la biotransformación de los filtros UV. Por ejemplo, se ha registrado que el potencial estrogénico de la oxibenzona se incrementa en sus metabolitos (Molina-Molina et al. 2008). Las diferencias en el metabolismo de los compuestos también están relacionadas con el estadio de desarrollo del organismo. Por ejemplo, existe el registro de la ausencia de transformación de oxibenzona a benzofenona-1 en los embriones de pez cebra, transformación que sí sucede en los adultos y que hace que la actividad estrogénica se vea disminuida (Blüthgen et al. 2012).
La regulación transcripcional de la vitelogenina se debe a la interacción directa de los receptores de estrógenos con los compuestos hormonales y el sistema transcripcional celular. Los receptores de estrógenos son el enlace entre el E2, la expresión genética y la cadena de mecanismos que desembocan en la síntesis de proteína (Brzozowski et al. 1997). Los receptores de estrógenos se encuentran en diferentes tejidos clave del organismo: ovarios, testículos, hígado y cerebro, entre los más estudiados. El reconocimiento de la hormona por el receptor se da por la complementariedad entre la cavidad del ligando y la parte no polar de E2 que adopta una formación de baja energía (Kah 2009). Desafortunadamente, este ligando parece ser poco selectivo y puede relacionarse con una variedad de compuestos xenoestrógenos. El E2 complementa perfectamente a su receptor; sin embargo, los compuestos con capacidad estrogénica no, por lo cual tienden a inducir menores respuestas que el E2 (Lawrence y Hemingway 2003). El efecto estrogénico de los filtros UV estará, por lo tanto, relacionado directamente con su interacción con los receptores de estrógeno. Morohoshi et al. (2005) indicaron que los tres filtros UV utilizados en el presente estudio tienen un potencial de muy leve a nulo en su interacción con los receptores de estrógeno de diversos organismos, lo cual contribuye también a explicar la falta de síntesis de VTG en el pez sargento.
]]> En conclusión, las dosis aplicadas de los filtros UV oxibenzona, octil salicilato y octinoxato en juveniles de pez sargento no produjeron la inducción del gen o la síntesis de VTG en el hígado de juveniles de A. saxatilis. La ausencia en la síntesis de VTG pudiera estar relacionada con características específicas a la especie. Por lo tanto, estudios posteriores deberán estar encaminados a determinar las diferencias que originan que las especies tengan o no una respuesta estrogénica a los filtros UV. Toda esta información ayudará enormemente en los análisis de riesgo ecológico y ambiental de estos productos tan ampliamente utilizados.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos todas las facilidades y ayuda prestadas para la realización de este trabajo a Roberto Iglesias Prieto, Patricia Briones, Enrique Lozano y Fernando Negrete (Instituto de Ciencias del Mar y Limnología Unidad Puerto Morelos); a Karen Luna-Ramírez y Javier García Villalobos (CICY, A.C.); a Alejandra García Gasca (CIAD, A.C.); y a Daniel Schlenk y Ramón Lavado (UC Riverside). Hacemos extensivo nuestro agradecimiento a Elsa Noreña Barroso por su ayuda para la edición de este trabajo.
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