Isolation and characterization of culturable bacteria from tropical coastal waters*

Aislamiento y caracterización de bacterias cultivables de aguas costeras tropicales

C–W Lee¹*, A Y–F Ng¹, K Narayanan², E U–H Sim³, C–C Ng¹

¹ Institute of Biological Sciences, University of Malaya, 50603 Kuala Lumpur, Malaysia. * E–mail: lee@um.edu.my

² Department of Genetics and Genomic Sciences, Mount Sinai School of Medicine, New York, USA. Present address: School of Science, Monash University, Sunway Campus, Selangor, Malaysia.

Recibido en enero de 2009.
Aceptado en abril de 2009.

Abstract

In this study we isolated and characterized some culturable bacteria from tropical coastal waters of Peninsular Malaysia. We obtained between 0.23 and 1.85 x 10³ cfu mL^–1 in the Zobell 2216E medium, and cultured 0.04% to 0.12% of total bacterial counts. Different bacterial strains were then selected by 16S rDNA RFLP using four restriction enzymes (Ddel, Hhal, Rsal, and Sau3AI), of which Hhal gave the most RFLP patterns. A total of 54 unique strains were obtained and these were identified by their 16S rDNA gene sequence. These bacterial strains could be divided into five classes: 38 strains of γ–Proteobacteria (61.1%); 3 strains of α–Proteobacteria (5.5%); 2 strains of the Cytophaga–Flavobacterium–Bacteroides group (3.7%); 3 strains of high GC, Gram–positive bacteria (5.5%); and 13 strains of low GC, Gram–positive bacteria (24.1%). These isolates have good potential for further biotechnological studies since about 56% of the isolates exhibited amylase activity, whereas 36% and 18% of the isolates had protease and lipase, respectively. Most (>70%) of the isolates also produced poly–B–hydroxybutyrate.

Key words: 16S rDNA RFLP, marine bacteria, South China Sea, Straits of Malacca, ZoBell 2216E.

Resumen

Palabras clave: 16S rDNA RFLP, bacterias marinas, Estrecho de Malaca, Mar de la China Meridional, ZoBell 2216E.

Introducción

En el mar abierto existen 12 x 10²⁸ células procariotas (Whitman et al. 1998), lo que representa un gran capital natural de diversidad tanto genética como fisiológica. Antes de la década de los años noventa, la diversidad bacteriana se evaluaba mediante pruebas fenotípicas y la taxonomía numérica de los aislados cultivados en medios microbiológicos (Fry 2000); sin embargo, sólo de 0.001% a 0.1% de las bacterias marinas han sido cultivadas (Oren 2004) y aún se desconoce la mayor parte de la comunidad microbiana. En las últimas dos décadas el análisis de las bacterias en el medio ambiente ha cambiado de técnicas que dependen del cultivo a técnicas que no dependen de éste como la identificación molecular basada en el gen 16S rDNA (e.g., Yeon et al. 2005) y la metagenómica (Theron y Cloete 2000). Las técnicas independientes del cultivo han permitido entender la fisiología de bacterias no cultivables como Ferroplasma tipo II y Leptospirillum grupo II en las descargas de aguas ácidas de minas (Tyson et al. 2004).

No obstante, los métodos cultivo–dependendientes siguen siendo relevantes. El cultivo de bacterias permite la caracterización fenotípica necesaria para llenar la brecha de información entre la función y la identidad obtenida por técnicas moleculares (Martínez–Murcia et al. 2005). Las bacterias cultivables también dan puntos de referencia fijos en las bases de datos de taxonomía molecular que son útiles inclusive para las técnicas independientes de los cultivos (Spiegelman et al. 2005). A pesar de que un enfoque cultivo–dependiente no refleja la diversidad bacteriana total (Oren 2004), aún faltan por conocer muchos microorganismos cultivables (Pinhassi et al. 1997, Suzuki et al. 1997). El utilizar diferentes medios y nuevas técnicas de aislamiento ha permitido obtener nuevos aislados (Connon y Giovannoni 2002, Goltekar et al. 2006). Además, el aislamiento y el cultivo de bacterias del medio ambiente sigue resultando más económico y fácil que las técnicas independientes de cultivos.

Malasia Peninsular (o Malasia Occidental) se localiza en la Plataforma de Sunda, rodeada por el Estrecho de Malaca y el Mar de la China Meridional. A pesar de ser aguas ricas en biodiversidad marina (Callum et al. 2002), existe poco conocimiento de su diversidad microbiana. La literatura sobre las bacterias marinas de estas aguas se limita a estudios microbiológicos de aguas marinas impactadas por descargas termales (Lee 2003), aguas insulares (Bong y Lee 2005) y simbiontes coralinos (Kalimutho et al. 2007); sin embargo, la identificación de estos aislados bacterianos se ha basado en pruebas bioquímicas y muchos no han sido identificados aún.

Este trabajo es un estudio piloto para determinar la diversidad bacteriana de estas aguas costeras. De manera preliminar se aislaron y cultivaron cepas de bacterias marinas de las aguas costeras de Malasia Peninsular. Se seleccionaron aislados para su posterior análisis mediante polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) del gen 16S rDNA y se identificaron por su secuencia 16S rDNA. A fin de determinar su potencial biotecnológico, se caracterizaron los aislados seleccionados según su producción de enzimas extracelulares y de poli–β–hidroxibutirato (PHB). Todas las secuencias obtenidas fueron depositadas en el Gen–Bank con números de acceso EF491975 a EF492033.

Materiales y métodos

Se realizaron mediciones in situ de temperatura y salinidad con un salinómetro (YSI–30, EUA). Se recolectaron alrededor de 100 mL de agua de mar entre 15 y 20 cm bajo la superficie con botellas estériles para el aislamiento bacteriano. Las muestras para el conteo total de bacterias se preservaron en glutaraldehído (1% de concentración final). Para los análisis químicos se recolectaron alrededor de 2 L de agua. Las muestras se almacenaron en hielo y se procesaron en menos de 3 h después del muestreo.

Para el análisis de nutrientes, el agua de mar se filtró a través de filtros Whatman GF/F prequemados (500°C por 3 h), y el filtrado se mantuvo en congelación (–20°C). Se midieron nutrientes inorgánicos disueltos (nitrato [NO3], amonio [NH4], fosfato [PO4] y silicato [SiO4]) de acuerdo con Parsons et al. (1984). El coeficiente de variación para el análisis de NH₄, PO₄ y SiO₄ fue <5%, y para el análisis de NO₃, <10%. Los sólidos suspendidos totales fueron medidos como el incremento en peso en los filtros GF/F después de secarse. La clorofila a se extrajo con acetona helada al 90% y se determinó en un espectrofotómetro (Parsons et al. 1984).

La abundancia bacteriana se determinó mediante el método de conteo directo bajo un microscopio de epifluorescencia (Olympus BX60, Japón) con un casete de filtro U–MWU (excitación, 330–385 nm; espejo dicroico, 400 nm; barrera, 420 nm). Las muestras se pasaron por un filtro negro de membrana Isopore de 0.2 de tamaño de poro, y luego se tiñieron con 4'6–diamidino–2–fenilindol (DAPI, concentración final de 1 µg mL^–1) por 10 min. Se observaron un mínimo de 15 campos microscópicos o 300 células. A fin de excluir las bacterias fotótrofas de nuestros conteos, también se observó cada campo bajo un casete de filtro U–MWG (excitación, 510–550 nm; espejo dicroico, 570 nm; barrera, 590 nm) para la autofluorescencia de la clorofila a.

Las bacterias cultivables se aislaron mediante la técnica de esparcido en superficie empleando el medio de cultivo Zobell 2216E (peptona 0.5%, extracto de levadura 0.1%, FePO₄ 0.01%, preparado en agua de mar) (ZoBell 1946), y se incubaron a 25–30°C durante varios días. Se contaron las unidades formadoras de colonias (ufc), y las colonias con diferente morfología se purificaron aún más para la extracción del ADN. Para tal extracción, las bacterias Gram negativas fueron disueltas químicamente usando dodecilsulfato de sodio y lisozima, mientras que las bacterias Gram positivas fueron disueltas mediante un paso adicional de congelación y descongelación (Ausubel et al. 2002). Se utilizó el método de extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitación con etanol frío. El ADN fue resuspendido en amortiguador Tris–EDTA (TE, pH 8.0) y almacenado a –20°C. Para todas las cepas aisladas se utilizó un par de iniciadores universales para la amplificación del gen 16S rDNA: el iniciador delantero, 27F (5'–AGAGTTTGATCMTGGCTCAG–3'), y el iniciador opuesto, 1525R (5'– AAGGAGGTGWTCCARCC–3'). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) se realizó en una mezcla de reacción de 15 mL que contenía 10x de amortiguador para PCR, 1.5 mM de MgCl2, 0.4 µM de cada iniciador, 3 mL de cadena de ADN (aproximadamente 200 ng µL^–1), 0.2 mM de dNTPs y 0.5 U de polimerasa Taq (Finnzymes DyNAzyme^TM II, Finlandia). La amplificación por PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94°C por 2 min; 35 ciclos de desnaturalización por 30 s a 94°C, alineamiento por 40 s a 55°C, extensión por 90 s a 72°C; y una extensión final a 72°C por 7 min. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación QIAquick^® (QIAGEN, Alemania).

Para RFLP, se emplearon las endonucleasas de restricción DdeI, HhaI, RsaI y Sau3AI (Roche, Alemania) para digerir el amplicón 16S rDNA por separado, para posteriormente resolverse en un gel de agarosa al 2.0% a 3.8 V cm^–1. Se analizaron los patrones de restricción usando la paquetería AlphaEaseFC^TM (Alpha Innotech Corp., EUA), y se seleccionaron las cepas que mostraban diferentes patrones de RFLP para su secuenciación en Macrogen (Corea del Sur). La secuencia de nucleótidos de las muestras se sometió tanto al programa de búsqueda Advanced BLASTn (Altschul et al. 1990) del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, EUA) como al Proyecto de Base de Datos Ribosomal II (RDP–II) (Cole et al. 2005) para la identificación de las bacterias más cercanamente relacionadas.

Asimismo, se evaluó la posición taxonómica de los aislados bacterianos mediante un árbol filogenético. Primero se alinearon las secuencias usando MUSCLE 3.6 (Edgar 2004), corrigiendo manualmente cualquier desalineación. Se construyó un árbol filogenético (neighbour–joining tree; Saitou y Nei 1987) a partir de una matriz de distancias genéticas entre pares calculada con el algoritmo de Jukes–Cantor (Jukes y Cantor 1969) usando la paquetería Bosque para análisis filogenéticos (Ramírez–Flandes y Ulloa 2008). También se realizaron análisis tipo bootstrap de 1000 réplicas para evaluar la estabilidad relativa de las ramas.

Para determinar el potencial de los aislados bacterianos para la biotecnología, éstos se examinaron para determinar la presencia de las enzimas extracelulares amilasa, proteasa y lipasa (Leifson 1963, Austin 1982). También se determinó la producción de PHB de acuerdo con Ostle y Holt (1982).

Resultados

En la tabla 1 se muestran las variables fisicoquímicas medidas en las estaciones de muestreo. La temperatura del agua de mar osciló entre 28.7°C y 30.0°C, lo cual es típico para aguas tropicales. La salinidad varió de 24 a 31 y, en general, fue más variable en los estuarios (Klang y estación 1 de Kuantan), probablemente debido a las descargas episódicas de agua dulce fluvial. Tanto los nutrientes inorgánicos disueltos como la concentración de clorofila a resultaron mayores en los estuarios y más altos en Klang. El nivel medio de sólidos suspendidos totales fue notablemente mayor en las estaciones del Estrecho de Malaca (>280 mg L^–1) que en las del Mar de la China Meridional (<50 mg L^–1).

Las ufc mL^–1 medidas fueron de 0.23 a 1.85 x 10³ y menores en la estación 2 de Kuantan (fig. 2). Los conteos bacterianos totales variaron de 1.04 a 3.29 x 10⁶ cél mL^–1 y no reflejan las mediciones de ufc. El porcentaje de cultivabilidad resultó diferente para los diferentes sitios. En Puerto Dickson se cultivó un promedio de 0.12% de las bacterias totales, mientras que en Klang se cultivó un promedio de 0.06%. La razón de bacterias cultivables a bacterias totales fue menor en las dos estaciones de Kuantan (<0.05%).

En este estudio se seleccionó un total de 91 cepas de bacterias marinas con diferentes características coloniales y se purificaron para la extracción de ADN. La amplificación por PCR del gen 16S rDNA produjo una sola banda de aproximadamente 1500 bp, digiriéndose posteriormente los amplicones purificados para RFLP. De las cuatro enzimas de restricción empleadas, DdeI y Sau3AI se cortaron con menor frecuencia, dando sólo 20 y 19 patrones, mientras que HhaI y RsaI produjeron 59 y 58 patrones, respectivamente.

Algunas de las cepas bacterianas presentaron patrones de restricción idénticos para las cuatro enzimas, por lo que se seleccionó una muestra representativa. En total, 59 cepas mostraron patrones de RFLP distintos. En la tabla 2 se indican los fragmentos obtenidos después de la digestión con HhaI y RsaI. Estas dos enzimas de restricción diferenciaron casi todas las 59 cepas con excepción de los aislados LGP (Staphylococcus cohnii) y LGT (S. pasteuri), los cuales requirieron de una digestión adicional con DdeI (datos no mostrados).

Las 59 cepas se identificaron con base en el análisis de la secuencia parcial (~700 bp) de sus genes 16S rDNA a sus parientes más cercanos (tabla 2). Este análisis arrojó sólo 54 cepas singulares, ya que cinco de ellas (LGAA2, PD1B, PD1E, PKL y PKP) fueron idénticas a Pseudoalteromonas spongiae y dos (PD1F y KK9) fueron idénticas a Alteromonas sp. AS30. Las 54 cepas distintas resultaron >96% idénticas a las secuencias dentro de las dos bases de datos usadas (NCBI y RDP–II). Las cepas (n, %) aisladas en el presente estudio pertenecen a las siguientes cinco clases: 1. α–Proteobacterias (Stappia sp. [1, 1.9%], Ruegeria sp. [1, 1.9%], Erythrobacter sp. [1, 1.9%]); 2. γ–Proteobacterias (Pseudoalteromonas sp. [9, 16.7%], Alteromonas sp. [7, 13.0%], Shewanella sp. [3, 5.6%], Microbulbifer sp. [2, 3.7%], Vibrio sp. [5, 9.3%], Marinobacter sp. [1, 1.9%], Photobacterium sp. [1, 1.9%], Pantoea sp. [1, 1.9%], Pseudomonas sp. [1, 1.9%], Acinetobacter sp. [1, 1.9%], Halomonas sp. [1, 1.9%], Salinimonas sp. [1, 1.9%]); 3. Bacterias del grupo Cytophaga–Flavobacter–Bacteroides (CFB) (Tenacibaculum sp. [1, 1.9%], Cytophaga sp. [1, 1.9%]); 4. Bacterias Gram positivas con alto contenido de GC (Micrococcus sp. [2, 3.7%], Brevibacterium sp. [1, 1.9%]); y 5. Bacterias Gram positivas con bajo contenido de GC (Staphylococcus sp. [3, 5.6%], Bacillus sp. [10, 19.0%]).

En la tabla 3 se presentan los resultados de la producción de enzimas extracelulares (i.e., lipasa, amilasa y proteasa). La amilasa resultó la más prevalente, encontrándose en 56% (n = 28) de los aislados examinados, mientras que sólo 36% (n = 18) y 18% (n = 9) de éstos mostraron actividad proteasa y lipasa, respectivamente. La presencia de amilasa es común en los géneros Bacillus, Pseudoalteromonas y Vibrio. La proteasa se encontró en la mayoría de las especies de Micrococcus, Pseudoalteromonas y Shewanella, mientras que la lipasa sólo se observó en algunas especies de Staphylococcus y Vibrio. En contraste, la producción de PHB se observó en la mayoría de los aislados examinados (>70%, n = 26) (tabla 4).

Discusión

Las cuatro estaciones de muestreo presentaron condiciones fisicoquímicas diferentes, con un mayor nivel de eutroficación en Klang. Esto concuerda con Lee y Bong (2008), quienes registraron altas tasas de productividad primaria y bacteriana en Klang en comparación con otras estaciones. Los niveles de sólidos suspendidos totales también fueron altos en las estaciones del Estrecho de Malaca, lo cual frecuentemente se atribuye al desmonte de terrenos para la construcción, la minería, la agricultura, la industria forestal y operaciones de dragado (Lee y Bong 2006). Las ufc y los conteos bacterianos obtenidos en este estudio estuvieron dentro del intervalo registrado anteriormente para las aguas de Malasia: 100–2500 ufc mL^–1 (Lee 2003) y 0.1–97.5 x 10⁶ cél mL^–1 (Lee y Bong 2008). La razón de bacterias cultivables a bacterias totales fue de 0.04% a 0.12%, lo que resulta similar a otros reportes (e.g., Lee et al. 1999, Radjasa et al. 2001); sin embargo, las ufc no se correlacionaron con los conteos bacterianos (P > 0.50).

En vista de que el medio de cultivo principal empleado en este estudio fue ZoBell 2216E preparado con agua de mar, el cual también contiene peptona y extracto de levadura, los aislados obtenidos fueron bacterias aeróbicas, heterotróficas, halofílicas o halotolerantes. De las 54 cepas aisladas distintas, solamente 13 (24%) fueron bacterias halofílicas estrictas y no crecieron en medios sin sal (datos no mostrados). La proximidad de las estaciones de muestreo a la costa podría haber influenciado la presencia de bacterias halotolerantes o halofílicas facultativas. Estas bacterias terrestres, tales como Bacillus subtilis, son generalmente transportadas al mar por el viento, agua, animales, etc.

La selección de las cepas singulares se realizó mediante RFLP del gen 16S rDNA. Las cuatro enzimas de restricción empleadas produjeron un promedio de dos a cinco fragmentos. Los patrones más claros se obtuvieron con HhaI, mientras que DdeI, RsaI y Sau3AI presentaron "bandas dobles" (Urakawa et al. 1999). La enzima HhaI también presentó mayor variabilidad de RFLP, y permitió tipificar casi todas las cepas aisladas. A pesar de obtener diferentes RFLP para las cepas LGAA2, PD1B, PD1E, PKL y PKP, la secuencia parcial del gen 16S rDNA indicó que eran idénticos a Pseudoalteromonas spongiae, con un valor de similitud de 99–100%. La secuenciación completa del gen 16S rDNA (~1500 bp) para estas cepas también confirmó su similitud. La divergencia entre especies (Urakawa et al. 1999, Jensen et al. 2002) probablemente causó la inconsistencia de uno o dos patrones de restricción. Tal divergencia también se observó para las cepas KK9 y PD1F, las cuales presentaron diferentes RFLP de 16S rDNA pero fueron identificadas con un valor de similitud de 99% con Alteromonas sp. AS30 a partir de sus secuencias completas de este gen. Aunque se ha registrado la divergencia entre especies para la familia Vibrionaceae (Urakawa et al. 1999), nuestros resultados muestran que también sucedió para P. spongiae y Alteromonas sp. AS30.

En el presente trabajo predominantemente se aislaron bacterias Gram negativas. El árbol filogenético (fig. 3) indicó que todas las cepas menos una presentaron afiliación filogenética. La clase más prevalente fue las γ–proteobacterias con 61% (n = 33) de las cepas aisladas y nueve cepas de la familia Pseudoalteromonadaceae. Los otros miembros pertenecían a las α–proteobacterias y al grupo CFB. La cepa MT3 no cayó dentro de alguna de estas tres clases; a pesar de presentar una similitud de 97% con su pariente más cercano (Halomonas sp. B–1083), se requiere de mayor investigación para confirmar su identidad. El árbol filogenético para las bacterias Gram positivas (fig. 4) mostró que todas las cepas se encontraban claramente dentro de la clase con alto contenido de GC o la clase con bajo contenido de GC, siendo Bacillus sp. el grupo dominante.

Se encontraron dos posibles especies nuevas, las cepas PKV y MR3, las cuales presentaron valores de similitud bajos (96%) contra Microbulbifer sp. JAMB–A3 y Vibrio sp. NAP4, respectivamente. No se obtuvieron bacterias pertenecientes a las β–proteobacterias. El cultivo de los miembros de este grupo mediante métodos convencionales no es común (e.g., Pinhassi et al. 1997, Lee et al. 1999, Yeon et al. 2005), y Shigematsu et al. (2007) solamente obtuvieron miembros de las β–proteobacterias con técnicas especializadas (i.e., cultivo en líquido basado en microplacas).

Las bacterias marinas aisladas en este estudio fueron examinadas para detectar enzimas extracelulares. Tales bacterias habitan ambientes particulares (i.e., con bajas concentraciones de nutrientes, alta salinidad [contenidos elevados de cloro y bromo], etc.), y sus enzimas extracelulares tienen un buen potencial biotecnológico. En nuestro estudio fueron comunes la amilasa y la proteasa. Esto concuerda con ZoBell y Upham (1944), quienes registraron a las bacterias marinas como un grupo de microbios con alta actividad proteolítica. Entre los aislados examinados, el género Pseudoalteromonas frecuentemente presentó actividad amilasa y proteasa, mientras que las cepas de Vibrio mostraron la presencia de las tres enzimas estudiadas. Ya se ha mostrado que Pseudoalteromonas tiene el potencial para producir agentes extracelulares biológicamente activos, incluyendo las proteasas (Holmstrõm y Kjelleberg 1999). Nuestros resultados también muestran que las bacterias marinas podrían ser una fuente potencial de PHB, ya que fue común su producción. El PHB es un fuerte candidato como plástico degradable o "verde", pero su utilización actual se ve limitada por sus altos costos de producción (Lee 1996).

Nuestro estudio mostró que a pesar de cultivar sólo una fracción pequeña de las bacterias en el mar, fue posible obtener 54 aislados singulares de las aguas de la Plataforma de Sunda. El método de cultivo sigue siendo relevante aunque en futuras investigaciones se tendrá que incorporar mayor variación en cuanto a los medios de cultivo, condiciones de incubación y técnicas de aislamiento (Connon y Giovannoni 2002, Goltekar et al. 2006, Shigematsu et al. 2007). Este trabajo mostró que la enzima de restricción Hhal produjo más patrones de RFLP del gen 16S rDNA, y fue suficiente para tipificar casi todas las bacterias marinas aisladas. Los aislados bacterianos obtenidos muestran un buen potencial para mayor investigación biotecnológica.

Este estudio recibió apoyo financiero del Comité Regional para Asia Sudoriental de START (SARCS) (94/01/CW y 95/ 01/CW), la Universidad de Malaya (FP013/2004B) y la Dirección Nacional de Oceanografía de Malasia (eScience 04–01–03–SF0194). Agradecemos a PP Ang su asistencia técnica y a los revisores anónimos sus comentarios constructivos.

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Notas

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Traducido al español por Christine Harris.