Identificación de Enterobacterias Causantes de Pudriciones Blandas en Cucúrbita pepo L. en Veracruz, México

Identification of Enterobacteria causal agents of soft rots in Cucurbita pepo L. in Veracruz, Mexico

Mauricio Luna–Rodríguez¹, Alicia Toledo–González², y Lourdes Georgina Iglesias–Andreu³

¹ Universidad Veracrazana (UV), Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, Médicos No. 5, Xalapa, Veracruz, México CP 91010. Correspondencia: mluna@uv.mx

² UV, Facultad de Biología, Circuito Gonzalo Aguirre Beltrán s/n, Zona Universitaria, Xalapa, Veracruz, México CP 91000.

Recibido: Julio 24, 2007
Aceptado: Noviembre 16, 2007

Resumen

Se identificaron dos especies de Pectobacterium causantes de pudriciones blandas en Cucurbita pepo y su variabilidad de respuesta a pruebas bioquímicas. Se determinó que los aislamientos correspondieron a P. chrysanthemi y P. carotovorum subsp. carotovorum, sin embargo no hubo una concordancia precisa con los descriptores comúnmente usados para la identificación de las especies de este género. El análisis factorial de correspondencias mostró que la variabilidad en los resultados para las pruebas bioquímicas evaluadas, ordenó a los aislamientos en cuatro grupos: dos afines a P. chrysanthemi y dos a P. carotovorum subsp. carotovorum. Las variables de mayor contribución a la formación de los grupos fueron producción de ácido a partir de lactosa, sensibilidad a eritromicina (15 μg/disco), utilización de ceto–metil glucosido y producción de sustancias reductoras a partir de sacarosa.

Palabras clave: Pectobacterium, variabilidad fenotípica, pruebas bioquímicas, bacteria fitopatógena, calabacita.

Abstract

Key words: Pectobacterium, phenotypic variability, biochemical tests, phytopathogenic bacteria, zucchini.

Las bacterias del grupo entérico forman un conjunto heterogéneo de microorganismos que comprende importantes patógenos en humanos, como Salmonella spp. y Escherichia coli Migula (Castellani y Chalmers). También, algunas especies de este grupo causan enfermedades en vegetales con pérdidas en la producción de frutales, ornamentales y hortalizas, entre otros. El género Pectobacterium, antes conocido como Erwinia, es representativo de este grupo y comprende especies que ocasionan pudriciones blandas por la degradación enzimática de la pectina estructural de la pared celular vegetal (Shevchik y Hugouvieux–Cotte–Pattat, 2003). Algunas como Pectobacterium carotovorum (Jones) Waldee, [Sin. Erwinia carotovora (Jones) Bergey], constituyen un taxón complejo que incluye razas con un amplio rango de características génicas, fenotípicas, bioquímicas y de hospederos, y en consecuencia de su distribución (Yap et al., 2004); por lo que la heterogeneidad de las especies del grupo ha contribuido a que aún no se cuente con descriptores satisfactorios de subespecies o patovares (Schaad et al., 2001). Sin embargo, para propósitos de identificación de las subespecies de P. carotovorum, algunos estudios han generado un criterio fenotípico confiable que diferencia dos o más subespecies (Gardan et al., 2003). En consecuencia de los casos donde los resultados de pruebas para identificar aislamientos locales, no se apegan en su totalidad a la información documental empleada para la identificación, se considera que está abierta la oportunidad de indagar acerca de la variación de características génicas, fenotípicas, bioquímicas, entre otras, con el propósito de encontrar diferencias que contribuyan a ampliar el conocimiento de este grupo. El propósito de este trabajo fue identificar la especie o subespecie de Pectobacterium causante de pudriciones blandas en Cucurbita pepo L. de cultivos locales, y determinar la variabilidad de respuesta a pruebas bioquímicas ordinariamente usadas para la identificación.

Los aislamientos bacterianos se obtuvieron de tallos de plantas de C. pepo, comúnmente conocida como calabacita italiana, con daño evidente de pudriciones blandas de olor fétido, procedentes de un sembradío en La Tinaja, Veracruz, México. El tejido fue lavado superficialmente con agua destilada estéril y desinfestado por inmersión en solución de hipoclorito de sodio comercial (2% v/v) durante 1 a 2 min, seguido de cuatro enjuagues con agua destilada estéril. Se eliminaron las zonas vegetales con daño avanzado y se utilizó tejido periférico de la zona lesionada. Se seccionaron segmentos de tallos de 15 plantas en cortes menores a 1 cm², mismos que se homogenizaron en un mortero de porcelana con 1 mL de agua destilada. El agua y los morteros se esterilizaron previamente a 121°C/15 min/15 psi en un autoclave convencional (Felisa FE–387). Parte de esta solución fue estriada en cajas Petri con medio extracto de levadura–dextrosa–carbonato de calcio (YDC) e incubadas a 27°C ± 2°C hasta la formación de crecimiento bacteriano evidente. De cada caja se seleccionaron dos colonias por cada tipo colonial desarrollado y se estriaron en medio de cultivo nuevo, descartando las colonias con crecimiento rápido a las 24 h. Este procedimiento se repitió las veces necesarias con la finalidad de obtener cultivos puros, evaluando la morfología y agrupación celular mediante técnicas convencionales de tinción (Schaad et al., 2001) y de observación microscópica. Para comprobar su patogenicidad, cada aislamiento bacteriano fue inoculado en plantas de 8 a 10 días de germinación de C. pepo, en relación de cuatro plantas por aislamiento, siguiendo la metodología de Schaad et al. (2001). Una vez determinada la morfología y comprobada la patogenicidad, se procedió a determinar que los aislamientos presentaran un gram negativo y que tuvieran la capacidad de metabolizar la glucosa. Se seleccionaron diez aislamientos a los que se les aplicaron pruebas básicas de reacción bioquímica para el género Pectobacterium (oxidasa, catalasa, reducción de nitratos, β–galactosidasa, ureasa, ácido sulfhídrico y utilización de glucosa, glicerol y sacarosa), así como pruebas complementarias para la identificación de especies (Gardan et al., 2003; Schaad et al., 2001). Para corroborar y complementar algunas pruebas, se utilizó el sistema API–20 (Biomeriux); y particularmente los medios LIA (BD Bioxon), TSI (BD Bioxon) y SIM (BD Bioxon) para observar la capacidad de producir ácido sulfhídrico. Los datos se procesaron mediante el análisis factorial de correspondencias, que permite clasificar a los diferentes aislamientos y las variables sobre un mismo plano y posibilita la observación directa de sus relaciones (Estrada–Martínez et al., 1997). Se emplearon datos codificados (positivo:1; negativo:2; no determinado:3 y variable:4) para los descriptores de P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Waldee emend., Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings, P. carotovorum subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings, P. carotovorum subsp. odoriferum (Gallois, Samson, Ageron y Grimont ) Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings, P. carotovorum subsp. betavascularum (Thomson, Hildebrand y Schroth) Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings, Pectobacterium carotovorum subsp. wasabiae (Goto y Matsumoto) Hauben, Moore, Vauterin, Steenackeers, Mergaert, Verdonck y Swings, P. chrysanthemi (Burkholder, McFadden y Dimock) Brenner, Steigerwalt, Miklos y Fanning emend. Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings y P. cacticida (Alcorn, Orum Steigerwalt, Foster, Fogleman y Brenner) Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings y los datos generados a partir de las pruebas bioquímicas de los aislamientos en estudio. El procesamiento de los datos se realizó empleando el programa STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc.).

Se obtuvieron colonias de color blanquecino a crema, brillantes, no mucoides, con elevación central en medio YDC; constituidas de células en forma de bacilos cortos, individuales, gram negativas, de flagelación perítrica y no esporuladas. Todos los aislamientos bacterianos examinados mostraron una respuesta negativa en las pruebas de oxidasa, ornitina descarboxilasa, ureasa y producción de ácido a partir de adonitol. Por el contrario, las pruebas de fermentación y oxidación de la glucosa (anaerobiosis facultativa), reducción de nitratos, producción de las enzimas catalasa, β–galactosidasa, triptofano desaminasa dieron resultados positivos. Además mostraron capacidad de utilizar glicerol, ramnosa, manosa, glucosa y sacarosa como fuentes de carbono. Contrastando con lo esperado, el aislamiento 7 no produjo ácido sulfhídrico. Los diez aislamientos en estudio formaron excavaciones en medio Cristal Violeta Polipectato (CVP) por la degradación de pectatos, además de que produjeron pudriciones severas y de olor fuerte en las papas y en la totalidad de las plantas de C. pepo inoculadas, lo que condujo, conjuntamente con los resultados de las pruebas anteriormente referidas, a señalar que se trataba de bacterias del género Pectobacterium, según Schaad et al. (2001). El análisis factorial de correspondencias aplicado a los resultados de las pruebas bioquímica básicas y complementarias que mostraron variabilidad, reveló que los dos primeros ejes extrajeron el 64.2% de la variación detectada, lo que contribuyó a que se pudieran clasificar a los aislamientos en cuatro grupos (A, B, C y D) (Fig. 1). Adicionalmente, el análisis reveló que las principales variables que contribuyeron a la formación de los grupos fueron fermentación de la lactosa, sensibilidad a la eritromicina (15 μg/disco), utilización de ceto–metil glucosido y producción de sustancias reductoras a partir de sacarosa (Cuadro 1). Aunque no se logró establecer una relación estricta de los diez aislamientos con las especies de Pectobacterium al considerar los descriptores indicados por Schaad et al. (2001), el grupo D (aislamiento 7) y particularmente el grupo A (aislamientos 1, 2, 5, 6, 8 y 10), mostraron afinidad fenotípica con la especie P. chrysanthemi (Fig. 1), como consecuencia de presentar sensibilidad a la eritromicina (15 μg/disco). Es claro porqué ésta ha sido considerada como una de las pruebas con mayor valor diagnóstico para la diferenciación de P. chrysanthemi del resto de las especies del género (Clark y Moyer, 1988; García, 2000), aunque P. cypripedii (Hori) Brenner, Steigerwalt, Miklos y Fanning emend. Hauben, Moore, Vauterin, Steenackers, Mergaert, Verdonck y Swings también es positiva para esta prueba, sin embargo esta especie usualmente es reportada como agente patogénico para orquídeas del género Cypripedium spp. (Hauben et al., 2005). El grupo D (aislamiento 7) presentó la misma respuesta a la eritromicina que el grupo A, no obstante se clasificó como grupo separado debido a que no produjo ácido sulfhídrico. Al respecto, se encontró que fue LIA, el medio adecuado para el análisis de la producción de ácido sulfhídrico a partir del quinto día, dado que en los medios TSI y SIM únicamente el aislamiento 10 resultó positivo para esta prueba. Es conveniente indicar que en los descriptores para el grupo de Pectobacterium, según Schaad et al. (2001), esta prueba no se reporta que sea variable; no obstante, de acuerdo con estos resultados, el medio y el tiempo de incubación, constituyen factores importantes para su determinación. Los grupos B (aislamientos 3 y 9) y C (aislamiento 4) mostraron ser afines a P. carotovorum subsp carotovorum (Fig. 1). Particularmente para el grupo B, el hecho de haber dado resultados positivos para la prueba de sustancias reductoras a partir de la sacarosa contribuyó a que su afinidad con la especie no se estrechara. Cabe mencionar que los resultados mostrados por estos aislamientos para esta prueba fueron débiles, en comparación con el resto de los aislamientos examinados; sin embargo, para los fines de este estudio se consideró la prueba como positiva. De forma adicional y contraviniendo lo esperado, los aislamientos de ambos grupos produjeron indol, razón por la que mostró una tendencia de similitud con P. chrysanthemi. Resultados similares fueron reportados para esta prueba en la tercera parte de las razas de P. carotovorum subsp. carotovorum estudiadas por Seo et al. (2002) y por Yap et al. (2004). Como lo indica Schaad et al. (2001), la heterogeneidad que caracteriza a las especies de Pectobacterium ha contribuido a que no se cuente con descriptores satisfactorios de subespecies o patovares. Lo anterior se refleja en los resultados obtenidos, donde a pesar del tamaño de la muestra, se evidencia la falta de una concordancia precisa de los aislamientos estudiados con los descriptores referidos por el autor para las especies de este género. Estudios de variación de la respuesta a pruebas bioquímicas contribuyen al conocimiento de la variación genética que se presenta en especies de bacterias entéricas fitopatógenas locales, como un primer paso para un estudio detallado de respuesta en diferentes hospederos y más aún, un análisis filogenético basado en técnicas actuales que establezcan las relaciones entre variantes de este tipo de microorganismo con el objetivo de contribuir en la taxonomía del grupo.

CONCLUSIONES

Enterobacterias fenotípicamente afines a P. chrysanthemi y P. carotovorum subsp. carotovorum son causantes asociados de pudriciones blandas en Cucurbita pepo en la localidad de La Tinaja, Veracruz, México. Existen diferencias de respuesta a pruebas bioquímicas entre aislamientos afines de Pectobacterium. La producción de ácido a partir de lactosa, sensibilidad a eritromicina (15 μg/disco), utilización de ceto–metil glucosido y la producción de sustancias reductoras a partir de sacarosa, son las pruebas que más contribuyen a la clasificación de la variación en los aislamientos.

LITERATURA CITADA

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