Trapping of Phytophthora cinnamomi in oak forests with two ornamental species and induction of sporulation
Alejandra Almaraz-Sánchez*; Dionicio Alvarado-Rosales; Luz de L. Saavedra-Romero
Programa de Fitopatología, Colegio de Postgraduados. km 36.5, Carretera México-Texcoco. C. P. 56230. Montecillo, Texcoco, Estado de México. Correo-e: alejandraas@colpos.mx (*Autor para correspondencia).
Recibido: 02 de septiembre de 2011
Aceptado: 28 de agosto de 2012
Resumen
La mortalidad del encino se ha acentuado recientemente en varios estados del país. La etiología en muchos casos se desconoce. Los bosques de encino están siendo afectados por la "enfermedad de la tinta" (Phytophthora cinnamomi Rands.) en los estados de Colima, Jalisco y Guerrero. La enfermedad causada por P. cinnamomi es de gran importancia; sin embargo, el aislamiento y la esporulación del patógeno representan una gran dificultad. Debido a lo anterior, los objetivos del presente estudio fueron a) evaluar la eficiencia de dos plantas trampa, Camellia japonica y Rhododendron indicum (L.) Sweet utilizando una suspensión de suelo y b) inducir la esporulación del patógeno. Para ello, discos de tejido foliar (6 mm) de las especies trampa fueron embebidos en una suspensión de suelo por 24 y 48 h para luego ser sembrados en medio selectivo PARPH. La especie R. indicum presentó una mayor efectividad de captura de 64.10 % comparada con 6.83 % de C. japonica. Los mejores resultados de esporulación se obtuvieron con una mezcla de agua-suelo (350 mL-200 g).
Palabras clave: Suelo, encino, camelia, azalea, esporangios.
Abstract
Oak mortality has increased in recent years in several Mexican states. The etiology in many cases is unknown. In the states of Colima, Jalisco and Guerrero, where the cause is known, the oak forests are being affected by the "ink disease" (Phytophthora cinnamomi Rand). The presenting symptoms of diseased trees are: chlorosis, necrosis, wilting, cankers with dark exudates on the bark of the trunk and dieback. Given the impact of the disease and the difficulty of isolating the pathogen from cortical tissue and inducing sporulation in it, this study aimed to (i) evaluate the efficiency of two trap plants, Camellia japonica and Rhododendron indicum (L). Sweet, using a soil suspension and (ii) induce sporulation of the pathogen. To this end, 6 mm discs containing leaf tissue of the trap species were embedded in a soil suspension for 24 and 48 h before being plated in PARPH selective medium. The species R. indicum showed higher capture effectiveness, 64.10 %, compared with 6.83 % for C. japonica. For sporulation, a water-soil mixture (350 mL-200 g) gave the best results.
Keywords: Soil, oak, camellia, azalea, sporangia.
Introducción
]]> Los encinos son una de las especies forestales más abundantes en México. De acuerdo con Zavala (1989, 1998) existen 140 especies del género Quercus distribuidas en bosques templados, tropicales caducifolios y subcaducifolios. También las especies de Quercus son un componente vital y característico del bosque mesófilo de montaña (Rzedowski, 1981). El encino no sólo desempeña un papel importante en la estructura del bosque sino que también tiene un valor comercial por su madera, además, de su uso como planta ornamental y para la recreación humana (Rzedowski, 1981). La presencia de los encinares es necesaria para preservar el equilibrio ecológico de las cuencas, ya que contribuye principalmente en la recarga de mantos acuíferos, sirve como refugio para la fauna silvestre y evita la erosión.A nivel mundial, el patógeno Phytophthora cinnamomi Rands tiene una gran capacidad destructiva y un rango amplio de hospedantes causando enormes daños en bosques naturales, plantas ornamentales y frutales (Domsch, 1980). Desafortunadamente, a partir de 1987, una muerte severa de encinos se comenzó a observar en el estado de Colima (ejido Arrayanal), la cual fue atribuida al patógeno P. cinnamomi 13 años después (Tainter, O'brien, Hernández, Orozco, & Rebolledo, 2000) y más tarde confirmada en dicha localidad y en los estados de Jalisco y Guerrero (Alvarado-Rosales et al., 2007; Alvarado-Rosales, Saavedra-Romero, & Almaraz-Sánchez, 2008).
P. cinnamomi es un patógeno del suelo causante de pudriciones radicales que en el siglo pasado devastó 200,000 ha de vegetación natural en Australia destruyendo más de 400 especies hospedantes (Malajczuk, 1979). En México, dicho patógeno ha sido la causa de grandes daños en áreas productoras de aguacate como en Atlixco, Puebla, donde el cultivo ha desaparecido en grandes regiones (Téliz, 2000). El uso de productos químicos, variedades resistentes y prácticas culturales son algunos de los métodos de control que se han empleado para mitigar el efecto del hongo; sin embargo, éste se ha restringido por razones económicas y ecológicas (Agrios, 2005).
En varias partes del mundo las especies de Phytophthora no son reconocidas como agentes causales de muchas enfermedades, siendo atribuidas a otros microorganismos aislados fácilmente en medios de cultivo (Tsao, 1983). Existen técnicas para facilitar el aislamiento de Phytophthora a partir de tejido enfermo y del suelo, utilizando medios de cultivo adicionados con antibióticos y químicos como medio 3P (Eckert & Tsao, 1962) y rifampicina PCNB-himexazol PARPH (pimaricina, ampicilina, rifampicina, PCNB e himexazol) (Erwin & Ribeiro, 1996; Alvarado-Rosales et al., 2007). Algunas técnicas especiales de aislamiento, como el uso de cebos biológicos y medios selectivos han permitido aislar al patógeno (Tsao, 1983; Zentmeyer, 1980). Varias técnicas de trampeo se han empleado debido a la dificultad que representa el aislamiento directo de Phytophthora, las cuales se pueden agrupar en tres categorías generales: a) inserción de suelo o tejido infectado en heridas realizadas en frutos frescos (aguacate y pera, entre otros); b) siembra de semillas, plántulas o trozos de raíz y c) trampeo por flotación, donde se utilizan baños de incubación en distintas proporciones de agua y suelo. Éste es quizás el método utilizado más ampliamente y el de mayor efectividad para aislar muchas especies de Phytophthora.
El éxito de la técnica de trampeo depende de la susceptibilidad de la especie utilizada como cebo y de las condiciones de incubación. En los viveros de México existen varias especies ornamentales, las cuales no se han evaluado para la captura de patógenos del suelo. Por ello, los objetivos del presente trabajo fueron evaluar la eficiencia de captura y aislamiento de P. cinnamomi del suelo por medio de dos ornamentales como Camellia japonica (camelia) y Rhododendron indicum (azalea) e implementar una forma sencilla para inducir la esporulación del patógeno. El trabajo se realizó considerando la falta de estudios de este tipo y con el fin de proporcionar una herramienta con mayor facilidad para determinar la presencia de P. cinnamomi.
Materiales y métodos
Colecta de muestras de suelo
La colecta se realizó en tres sitios: El Arrayanal, Colima; Reserva de la Biosfera, Jalisco; y Tecoanapa, Guerrero. En estos lugares, la enfermedad de la tinta ocasionada por P. cinnamomi se ha detectado recientemente. Las muestras se tomaron de árboles que mostraban diferentes niveles de muerte regresiva, marchitez, clorosis, defoliación prematura y presencia de cancros con exudado color oscuro en la corteza. En cada sitio se seleccionaron parcelas de muestreo de 0.1 ha y en cada una se tomaron cinco muestras compuestas de 1 kg de suelo que incluían algunas raíces. Las muestras se colectaron a una profundidad de 5 a 15 cm (Alvarado-Rosales et al., 2008) en bolsas de polietileno. El muestreo se realizó en agosto de 2004 a septiembre de 2005 colectándose 172 muestras en total; 134 en Colima, 11 en Jalisco y 27 en Guerrero.
Plantas trampa
]]> Las especies ornamentales utilizadas para la captura y aislamiento de P. cinnamomi fueron C. japonica y R. indicum. Las plantas se obtuvieron de los viveros circundantes a Texcoco y Xochimilco.Trampeo de P. cinnamomi
El trampeo de P. cinnamomi se hizo en contenedores plásticos (uno por cada muestra de suelo), en los cuales se agregaron 200 g de suelo + 350 mL de agua destilada. La mezcla resultante se homogeneizó con ayuda de una espátula. En cada contenedor se colocaron 30 discos de camelia (6 mm de diámetro) y 30 triángulos de azalea (5 mm por lado), sumando un total de 60 unidades, las cuales se mantuvieron a temperatura ambiente (20-25 °C) (Figura 1A). Después de 24 h se extrajeron 10 discos de camelia y 10 triángulos de azalea, los cuales se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron en sanitas estériles. Finalmente, se sembraron las 20 unidades en cada caja Petri con medio selectivo PARPH (Figura 1B). Este proceso se repitió 24 horas después. Las cajas se colocaron en oscuridad y a temperatura ambiente para promover el crecimiento del patógeno. Una vez que en los discos y triángulos se observó el crecimiento, se revisaron al microscopio y se realizó el conteo final de aquéllos que contenían micelio de P. cinnamomi. Las unidades con el patógeno de interés se transfirieron a medio de cultivo PARPH y posteriormente a PDA para purificar la colonia.
Identificación de P. cinnamomi
De las colonias purificadas se hicieron montajes permanentes con glicerol al 50 %, acidificado con HCl (12 N), para su observación al microscopio compuesto (Figura 1D). La identificación morfológica se hizo con base en las claves de Waterhouse (1963) y Erwin y Ribeiro (1996).
Producción de esporangios
La esporulación de las colonias purificadas se indujo con una mezcla de agua estéril-suelo no esterilizado en una proporción 1000 mL:100 g. La mezcla fue centrifugada durante 20 min a 5,000 rpm y la solución obtenida se filtró con una manta de cielo. En cajas Petri se agregaron 10 mL de la solución, posteriormente, se colocaron 20 discos de 0.5 cm del cultivo de la colonia pura de P. cinnamomi. Por cada muestra se tuvieron cinco repeticiones. Las cajas fueron incubadas a temperatura ambiente por siete días durante los cuales se formaron los esporangios. La identificación de los esporangios se hizo con las claves de Waterhouse (1963) y Erwin y Ribeiro (1996).
Resultados y discusión
Se obtuvieron 83 aislamientos del hongo P. cinnamomi se obtuvieron de las 172 muestras procesadas de suelo-raíz. Los discos y triángulos foliares de las dos ornamentales atraparon a P. cinnamomi, 24 y 48 h después de estar embebidas en la suspensión de suelo (Cuadro 1). Los resultados de la captura de P. cinnamomi en las muestras compuestas de suelo (agosto 2004 a septiembre 2005) manifiestan que 64.10 % de los triángulos de Rhododendron y 6.83 % de los discos de Camellia tuvieron crecimiento típico del patógeno. Esto indica que R. indicum es más eficaz que C. japónica.
]]> La presencia de P. cinnamomi en medio de cultivo PDA se confirmó por el micelio cenocítico toruloso, esporangios no papilados y crecimiento de la colonia tipo cameliforme. El uso de medio selectivo PARPH contribuyó con un porcentaje mayor de captura de P. cinnamomi, aunque existen otros medios selectivos que se emplean en el aislamiento de hongo como Agar Corn Meal, PDA y Agar V-8 (Tsao, 1983; Zentmyer, 1980). Las colonias desarrolladas en PARPH fueron blancas y el micelio presentó un crecimiento coraloide (Figura 1C). En medio PDA, las colonias presentaron micelio con crecimiento en forma de camelia, el cual es típico de la especie (Figura 1D). Con ayuda del microscopio se observó un micelio cenocítico con protuberancias tipo coraloide, ramificado y con la presencia de abundantes clamidosporas terminales (Figura 1E), lo cual concuerda con lo reportado por Erwin y Ribeiro (1996).La presencia de esporangios de P. cinnamomi sólo se manifiesta en medio líquido con soluciones de extracto de suelo partiendo de cultivos del hongo en PDA. En este trabajo, los esporangios se formaron a los siete días, los cuales se observaron al microscopio estereoscópico y se verificó que pertenecieran a P. cinnamomi. Para ello, se midió el largo y ancho de 100 esporangios de cada sitio de muestreo. El tamaño promedio de los esporangios provenientes de las muestras de Guerrero fue de 48.24 x 31.47 μm, y de las muestras de Colima y Jalisco fue de 50.10 x 33.61 μm concordando con los valores reportados por Erwin y Ribeiro (1996) para esta especie.
Conclusiones
Los resultados del presente estudio indican que R. indicum fue más eficiente debido a que con ésta se obtuvo un mayor número de aislamientos en la captura de P. cinnamomi del suelo que con C. japonica. La obtención de esporangios se logró a los siete días, el cual es un indicador importante para la identificación y comparación de las especies de Phytophthora. El hongo P. cinnamomi se ha identificado como agente causal de la muerte de árboles de encino. La metodología empleada en este trabajo facilita el aislamiento de P. cinnamomi utilizando las especies ornamentales que están disponibles en los viveros de México.
Referencias
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