Efecto in vitro de la acetamida furánica bromada sobre aislados de Salmonella enterica de aves
In vitro effect of furan acetamide bromide on Salmonella enterica isolates from chickens
Osmaida Estrada Cutiñoa, Ana Carvajalb, Pedro Rubio Nistalb, Lucía Fuentes Jiménezc, Mariano Arean Silveraa, Manuel Almeida Saavedraa, Osvaldo Vallejo Magallanesa, Waldo Ramírez Sáncheza, Ivan Garcia Zaldívara, Vladimir Barrios Gonzálezb
a Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad de Granma. Cuba. oestradac@udg.co.cu. Correspondencia al primer autor.
]]> b Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de León. España.c Instituto Superior Tecnológico del Oriente del Estado de Hidalgo. Apan, Hgo. México.
Recibido el 3 de mayo de 2013.
Aceptado el 26 de noviembre de 2013.
Resumen
Dentro del género Salmonella, la especie Salmonella enterica, subsp enterica es una de las de mayor interés por su efecto patógeno sobre los animales. El trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el efecto in vitro de la acetamida furánica bromada (AFB) sobre Salmonella enterica aviar. La AFB se obtuvo en el Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central de las Villas, Cuba. La actividad antimicrobiana del producto sobre los aislados de Salmonella enterica se determinó por el método de macrodilución en caldo, según el "National Comité for Clinical Laboratory Standards", NCCLS, documento M7-A2. La concentración letal mínima se determinó según NCCLS, documento M26-A, 1999. Las pruebas bioquímicas y serológicas confirmaron la presencia de Salmonella gallinarum en el 100 % de las muestras. Los valores de la mínima concentración inhibitoria (MCI) y mínima concentración bactericida (MCB) de la AFB fueron ambas de 12.5 mg/ml, para las cepas de Salmonella gallinarum y "American Type Culture Collection" de E. coli. Se concluye que la MCI y MCB de la Salmonella enterica frente a la acetamida furánica bromada in vitro fue de 12.5 mg/ml, demostrando la acción bactericida del producto.
Palabras clave: Acetamida, Aves, Bromada, Furánica, Salmonella.
]]> Abstract
Salmonella enterica subsp. enterica is one of the most interesting bacteria because of its pathogenic effect on animals. The objective of the present study was to evaluate the in vitro effect of furan acetamide bromide (FAB) on avian Salmonella enterica. FAB was obtained from the Centro de Bioactivos Químicos of the Universidad Central de las Villas, Cuba. The antimicrobial activity of the product against Salmonella enterica isolates was determined by the broth macrodilution method, according to the Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), document M7-A2. The minimum lethal concentration was determined by NCCLS, document M26-A, 1999. The biochemical and serological tests confirmed the presence of Salmonella gallinarum in 100 % of the samples. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) values of FAB were 12.5 μg/ml for Salmonella gallinarum and American Type Culture Collection (ATCC) of E. coli. It is concluded that MIC and MBC of Salmonella enterica against in vitro effect of furan acetamide bromide was 12.5 μg/ml, demonstrating the antimicrobial activity of the product.
Keywords: Acetamide, Chickens, Bromide, Furan, Salmonella.
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa, contagiosa, de curso agudo o crónico propio de las aves domésticas y silvestres, jóvenes o adultas; el período de incubación es muy variable y oscila entre 2 a 4 días, existiendo dos tipos de salmonelosis: Pullorosis, producida por la Salmonella pullorum, afectando a los animales jóvenes, caracterizada por inapetencia, debilidad a las caídas, plumas erizadas, diarreas de color blancuzco, así como congestión hepática y pulmonar; y la Tifoidea aviar producida por Salmonella gallinarum, con síntomas de diarreas fétidas, de color amarillenta-verdosa, pérdida del apetito, debilidad, aumento de la infertilidad e incubabilidad del huevo y focos necróticos en hígado y corazón además de esplenomegalia, los pulmones se encuentran edematosos y congestionados; en ponedoras los ovarios presentan procesos degenerativos(1).
La prevención o el control de enfermedades infecciosas son de vital importancia en la moderna industria avícola, constituyendo la higiene y el saneamiento los principios básicos para evitar y controlar dichas patologías. Sin embargo, estas medidas por separado, no son suficientes, por lo tanto, es un compromiso contar con un manejo sano incluyendo medidas profilácticas y terapéuticas(2).
Los antibióticos utilizados de forma oportuna, por las vías más convenientes y en dosis terapéuticas, brindan un extraordinario beneficio para los animales y el hombre. No obstante, cada día son más las voces de científicos e investigadores que alertan acerca de los peligros que engendra para la humanidad el uso de dosis inadecuadas de los antibióticos(3).
El Grupo de Química y Medicamentos de la Universidad de Granma, Cuba, hoy convertido en el Centro de Estudios de Química Aplicada (CEQA) ha venido trabajando desde el año 1985 en coordinación con el Centro de Bioactivos Químicos (CBQ) de La Universidad Central de las Villas, en la obtención de productos potencialmente bioactivos, entre los que se destaca la acetamida furánica bromada (AFB), que es una sustancia bioactiva, de forma similar a lo reportado en la patente norteamericana(4) que trata sobre las aplicaciones industriales del 2-(2-bromo-2-nitroetenil)-furano C como potente bactericida y fungicida, con la siguiente composición química:
En correspondencia con estos resultados biológicos tan alentadores, se comenzaron los estudios preliminares de toxicidad de la AFB con vistas a determinar su dosis letal media (DL-50 ) y de acuerdo con el trabajo realizado se obtienen los siguientes valores: a) Dosis letal media DL-50= 1,879 mg/kg de peso vivo usando como vehículo aceite de maní por vía oral en ratones Balb/c. DL-50 igual a 3,000 mg/kg de peso vivo por vía oral utilizando como vehículo goma tragacanto en ratones OF-1.
]]> Con estos resultados y teniendo presente la clasificación comúnmente empleada para referir la toxicidad inicial de una sustancia, se puede plantear que la AFB es muy poco tóxica. Sin embargo aún no se han realizado estudios relacionados con el mecanismo de acción del producto, ni cómo actúa a nivel de la célula. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto in vitro de la Acetamida Furánica Bromada sobre aislados de origen aviar de Salmonella enterica.Se tomaron 50 pollitas de inicio ponedoras, línea L33, de 2 días de edad, pertenecientes a la Empresa avícola de Granma, Cuba, se sacrificaron según las normas de bienestar animal para aves y se procesaron en el Centro de Epizootiología y Diagnóstico Veterinario de la provincia de Holguín.
Los aislados confirmados fueron caracterizados mediante pruebas bioquímicas y sueros específicos frente a los principales serogrupos de Salmonella enterica: D, B, C2 y E, empleando los antisueros comerciales procedentes de los laboratorios Finlay (NC: 38 - 02 - 13, 1991).
La AFB se obtuvo mediante la metodología descrita por Almeida(5), en el Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central de las Villas, Cuba, con un grado de pureza del 97 % y una potencia de 970 μg/mg se preparó una solución a una concentración al 1%.
Se partió de un cultivo puro de Salmonella enterica tipo D a partir de aislados de campo, el cual se sembró en placas de Agar Muller Hinton durante 24 h a 37 °C en aerobiosis. Las colonias, crecidas se resuspendieron en una solución salina isotónica (0.85%) en tubos estériles de vidrio (2 ml) hasta alcanzar la turbidez equivalente al patrón de 0.5 a 1 de la escala McFarland, correspondiendo con una suspensión equivalente de 1 a 2 x 108 ufc/ml-1 para una cepa de control recomendada por el Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI)(5) de E. coli ATCC 25922. Obtenida la concentración bacteriana deseada, se realizó una dilución 1:500 (10 μL/4990 μL) en el caldo Mueller Hilton y se mezcló en vórtex durante 15 seg, alcanzándose una concentración de 1 a 2 x105 ufc/ml. Desde la preparación del inóculo hasta su distribución en los tubos se efectuó en los 15 min siguientes.
Partiendo de la solución madre de AFB se prepararon diluciones dobles seriadas con una concentración inicial elevada de 131,072 μg/ml hasta una concentración final de 512 μg/ml. En todos los casos se realizaron tres réplicas de cada tratamiento y los respectivos testigos: negativo (medio de cultivo sin inocular) y positivo (medio de cultivo inoculado sin AFB). Además se comprobó la pureza de la suspensión del inóculo subcultivando alícuotas en placas de agar Muller Hinton y se incubó simultáneamente.
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se determinó como la menor concentración de la AFB que inhibió el crecimiento visible del microorganismo.
La Concentración Mínima Bactericida (CMB), se determinó tomando 100 μl de cada tubo de las concentraciones de ensayo donde no se observó crecimiento y se añadieron en placas con medio Muller Hinton incubándose de 18 a 24 h a 37 °C. El conteo de colonias se realizó mediante un contador de colonias y se elegieron aquellas concentraciones con crecimiento de colonias viables > 10 UFC ml-1 donde se evidenció un efecto bactericida.
Los datos del aislamiento de salmonella en cada órgano se analizaron con la prueba de proporciones múltiples para determinar los órganos más afectados (P<0.05). Los análisis se realizaron con el paquete estadístico "Statistica for Windows", versión 8.0 (StatSoft, Tulsa, OK).
Las pruebas bioquímicas y serológicas demostraron la presencia de Salmonella en el 87.3 % de los cultivos obtenidos, al procesar 300 muestras recogidas en 50 pollitas. Además, se observó diferencia significativa entre la cantidad de muestras positivas y negativas, evidenciándose los mayores valores de positividad en hígado, bazo, pulmón y saco vitelino, siendo este último el más infectado (Cuadro 1).
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La caracterización serológica mostró que el serogrupo D era el mayormente identificado (61.24 %), seguido en orden descendente por el E (19.3 %), B (15.21 %) y el C (11.33 %).
La CMI y CMB de la AFB frente a la cepa ATCC 25922 de E. coli y Salmonella del serogrupo D, resultaron ser similares, alcanzando un valor de 12.5 mg/ml para ambos microorganismos no observándose diferencia significativa entre los valores de CMI y CMB de las cepas estudiadas, demostrando la capacidad antimicrobiana del producto contra Salmonella enterica y E. coli.
Las pruebas bioquímicas y serológicas empleadas corroboraron la presencia de Salmonella en el 100 % de las muestras, alcanzándose los mayores valores de aislamiento en hígado, bazo y saco vitelino. Estos resultados coinciden con otros trabajos(6) donde se considera a la salmonelosis como una denominación genérica de los procesos producidos por bacterias del género Salmonella, la cual adquiere nombre específico en el caso de cuadros particulares como sucede en la fiebre tifoidea.
Los valores alcanzados de CMI y CMB de la acetamida frente a cepas ATCC 25922 de E. coli y Salmonella del serogrupo D, indican que es una sustancia bioactiva, que tiene una acción bactericida y fungicida potente, y que su efecto concuerda con el valor obtenido en otros trabajos(7) además al evaluar su eficacia frente a cepas de Staphylococcus aureus y Cándida albicans. Además, este valor de CMI es superior a los umbrales reportados por otros autores para diferentes antibióticos.
Estos resultados pueden deberse, a que la AFB tiene un efecto bactericida que además se corroboró al evaluar cepas de E. Coli, Cándida Albicans, Pseudomona aureginosa, coincidiendo con otros autores(6), los cuales consideran que los valores de CMI y la CMB obtenidas en antibióticos considerados como bactericidas, habitualmente difirieren en una o dos diluciones.
Así mismo otros autores(8), plantean que la susceptibilidad de las cepas testigo frente a los antibióticos de uso convencional, el halo oscila entre 16 a 23; en el presente estudio el halo de inhibición de la AFB, está dentro del rango de la zona de inhibición obtenida por estos autores con respecto a las cepas testigo con los diferentes antibióticos, e incluso para algunos antibióticos está por encima.
Sin embargo otros autores(9) corroboraron que en 150 cepas S. typhimurium serovar, aisladas entre 1980 y 1984 en Normandía, 101 mostraron resistencia múltiple frente a los antibióticos. Por otra parte, Kirby(10) señaló que en Inglaterra en 14,400 casos, el 52 % correspondió a S. typhimurium, exhibiendo una resistencia múltiple a los antibióticos usuales. De igual forma se ha señalado(11) que en 2,000 aislamientos realizados desde 1959 en Holanda, se comprobó resistencia múltiple a las drogas, y que en el caso de S. typhimurium y serovar Dublin aisladas, se apreció incremento en la resistencia desde 1972.
Otros autores(12) encontraron que al realizar estudios de antibiograma con 412 cepas de S. dublin aisladas, resultaron susceptibles a la estreptomicina el 100 %. Sin embargo, el comportamiento de la misma serovariante ha variado. En el caso de la S. typhimurium de 208 aislamientos, fueron susceptibles a la estreptomicina y a la kanamicina el 58 %.
]]> También se comprobó un aumento progresivo de la salmonelosis(13) pero además un incremento de la resistencia a los antibióticos de 35 % entre 1977 y 1978, al 64 % entre 1984 y 1985. En un inicio la resistencia fue a tres antibióticos, pero ya en 1985 de 98 aislamientos 47 fueron resistentes a cinco y 51 a seis. En todos los casos se apreció resistencia a la estreptomicina, al cloranfenicol y a la nitrofurantoína. Así mismo en estudios realizados en 300 cepas aisladas en 29 países, comprobaron que todas las cepas susceptibles a los antibióticos eran libres de plásmidos específicos presentes en cepas resistentes(14).Se ha demostrado(15) que el 60 % de las Salmonellas aisladas, entre las que se encontraban la S. typhimurium y la S. dublin, mostraron resistencia a los antibióticos más frecuentes. De igual forma16) desarrollaron un trabajo desde 1972 a 1984 tendiente a conocer la susceptibilidad de cepas de S. typhimurium, ser. dublin y S. enteritidis, y comprobaron un incremento progresivo en la resistencia a las antibióticos y quimioterapéuticos.
Por otra parte se ha corroborado(17) la adquisición de resistencia a antibióticos de cepas de S. arizona a partir de cepas de E. coli resistentes a la kanamicina, tetraciclina y ampicilina, lo que sugiere que la resistencia en las salmonellas puede ser adquirida a partir de líneas de E. coli resistentes.
Se plantea que el cloranfenicol es desde hace tiempo la droga de elección en el tratamiento de la fiebre tifoidea y las septicemias por Salmonella(18), pero han aparecido cepas resistentes al cloranfenicol. Por consiguiente se requieren pruebas de sensibilidad antimicrobiana, siendo la ampicilina parenteral y la trimetroprinsulfametaxazol alternativas clínicamente efectivas.
Se ha reportado(19) que la enrofloxacina (Baytril) es la droga más efectiva; aún en dosis doble durante un período de tres semanas, la S. typhimurium puede volverse a aislar en 48 h en pollos. El tratamiento combinado con el Baytril, seguido de la aplicación de flora intestinal por dos veces, resultó efectivo en la eliminación total del estado portador de la S. enteritidis en pollos adultos. Sin embargo, usado en aves infectadas el concepto solo provocó reacción significativa en los porcentajes de reaislamiento, pero nunca pudo eliminar el estado portador o la diseminación del agente.
Al evaluar la sensibilidad in vitro de 12 antimicrobianos frente a 32 cepas de Salmonella sp. otros autores(20) obtuvieron mayor resistencia a la estreptomicina; y también se observó resistencia para tetraciclina y triple sulfa (96.8 %), con valores de concentraciones mínimas inhibitorias mayores de 500 μg/ml.
Por otro lado(6) identificaron 93 cepas de S. enterica subespecie enterica; 52 de contenido cecal y 41 de nódulo linfático ileocecal, evaluándose 15 antimicrobianos por el método de dilución en agar: amikacina, gentamicina, ciprofloxacina, cefalotina, cefotaxima, enrofloxacina, fosfomicina, polimixina-B, tetraciclina, cloranfenicol, estreptomicina, trimetoprima-sulfametoxazol, ampicilina, nitrofurantoína y ácido nalidíxico, observándose mayor resistencia a la tetraciclina en 24 de las 93 cepas, a cloranfenicol en 22, a estreptomicina en 22 a trimetoprima-sulfametoxazol en 20, a ampicilina en 18, a nitrofurantoína y ácido nalidíxico en 3.
Según algunos autores(21) al estudiar la susceptibilidad de las 20 cepas de Salmonella grupo D (móviles e inmóviles) aisladas de ponedoras comerciales en Colombia, encontraron resistencia frente a 17 productos disponibles comercialmente para avicultura; lo que significa que todas las bacterias obtuvieron un porcentaje que varió entre 22 y el 44 %. Todo esto conlleva a la gran responsabilidad que genera la correcta utilización de los productos antimicrobianos, ya que su uso indiscriminado puede generar cepas multiresistentes.
Es importante tener en cuenta que para garantizar un buen tratamiento de las enfermedades entericas de etiología bacteriana es necesario un correcto aislamiento del agente etiológico, la elección del fármaco basado en el conocimiento de la susceptibilidad, así como la selección y frecuencia de la vía de administración a utilizar(3).
La acetamida furánica bromada teniendo presente la clasificación comúnmente empleada para referir la toxicidad inicial de una sustancia, se puede plantear que es muy poco tóxica(5) por tanto esto es un punto de partida importante para su utilización. Las propiedades bactericidas y funguicidas de la AFB, unida a su baja toxicidad abren amplias perspectivas para la aplicación del citado producto como fármaco.
]]> En el trabajo se pudo demostrar las propiedades antibióticas de la AFB, resultados similares con cepas de referencias como son E. coli, St. aureus, Ps. auriginosa y C, albicans frente a la Salmonella fueron obtenidos por otros investigadores(22).Los resultados que aporta la presente investigación tienen gran repercusión, debido a que constituyen una posible opción in vitro para perfeccionar la terapéutica en el tratamiento de la Salmonelosis, al demostrarse su efecto bactericida, ya que esta enfermedad presenta una alta incidencia en la población de ponedoras, en nuestra provincia, causando grandes pérdidas económicas, y por otra parte la disminución de la efectividad de los antimicrobianos usualmente empleados contra esta patología.
Deben considerarse las propiedades bactericidas y fungicidas de la AFB para continuar estudios in vivo, buscando una mayor efectividad del producto. La actividad biológica de los derivados furánicos bromados no siempre está asociada con la tenencia de átomos de bromo en la posición 5 del esqueleto carbonado de dicho compuesto(5).
LITERATURA CITADA
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