Ácido benzoico y un producto basado en especies de Bacillus para proteger la productividad de los lechones y al ambiente

Benzoic acid and a product based on Bacillus species to protect piglet productivity and the environment

María Alejandra Pérez Alvarado^a, Jorge Cervantes López^b, Diego Braña Varela^c, Gerardo Mariscal Landín^a,c, José Antonio Cuarón Ibargüengoytia^a,c

^a Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias de la Producción y la Salud Animal, Facultad de Estudios Superiores - Cuautitlán, UNAM. México.

^c Centro Nacional de Investigación en Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP. Km 1 Carretera a Colón, 76280, Ajuchitlán, Colón, Qro. México. brana.diego@inifap.gob.mx. Correspondencia al tercer autor.

Recibido el 19 de marzo de 2013.
Aceptado el 7 de mayo de 2013.

Resumen

Se indagó la compatibilidad del ácido benzoico (ABZ) y especies de Bacillus (BAC), en la productividad de lechones y su impacto ambiental. En el Ensayo 1, se usaron 180 lechones, durante 42 días. El ABZ (0 ó 5 kg/t) y BAC (0 ó 0.5 kg/t) fueron incluidos en la dieta en un arreglo factorial 2x2 en dos bloques de un diseño de bloques completos al azar. Semanalmente se registró el consumo y peso de los lechones y se colectaron aguas residuales para medir pH, N, NH₃, coliformes, BAC y gasto de agua. En el Ensayo 2, en una granja comercial, se registró la productividad de 384 lechones en 2 tratamientos: un programa de medicación tradicional y otro simplificado por el uso de ABZ y BAC. En el Ensayo 1, se tuvo respuesta al ABZ en la ganancia de peso y eficiencia (13 y 9.5 %; P<0.005); en las aguas residuales bajó (P<0.001) el pH y los coliformes totales. El ABZ no impidió la germinación de BAC, y su uso combinado interactuó (P<0.08) aumentando la fijación del NH₃. El uso de BAC se justifica además, por la reducción en gasto de agua (P<0.001). En el Ensayo 2, ABZ y BAC igualaron la respuesta productiva a la de los antimicrobianos (P>0.15). El ABZ es un recurso para proteger el crecimiento de lechones al destete y reducir la variación en la engorda; es entonces una alternativa al uso indiscriminado de antibióticos, ya que en combinación con BAC, reduce la producción de NH₃ y el gasto de agua.

Palabras clave: Crecimiento, Protección ambiental, Antibióticos, Gasto de agua, Amoniaco, Cerdos.

The compatibility of benzoic acid (ABZ) and Bacillus species (BAC), in productive response of weaned piglets, and environmental impact was examined. In Assay 1, 180 weaned piglets were used during 42 d. Treatments resulted from the factorial arrangement (2x2) of ABZ (0 or 5 kg/kg) and BAC (0 or 0.50 kg/t) in a randomized complete block design. Feed intake and weight gain were recorded weekly, and wastewater was collected to measure pH, N, NH₃, coliforms, BAC, and water waste. In the Assay 2, in a commercial farm, productive performance was recorded from 384 weaned piglets in two treatments: a program of traditional medication, and a simplified, reduced antibiotics, program with the use of ABZ and BAC. The results from Assay 1 showed ABZ effects on body weight gain and feed efficiency (13 and 9.5 %; P<0.005); in waste water reduced (P<0.001) pH and the total coliforms count. The ABZ didn't hindered BAC germination, and their combined use interacted (P<0.08) increasing the capture of NH₃. The use of BAC is also justified given the reduction (P<0.001) in water consumption. In Essay 2, ABZ and BAC reached the same (P>0.15) productive response than the obtained with the antibiotics. Benzoic acid is a resource to protect weaned piglets growth and to reduce body weight variation during finishing; being then an alternative to the indiscriminate use of antibiotics, in combination with BAC reduces NH3 production and the consumption of water.

Key words: Growth, Environmental protection, Antibiotics, Water consumption, Ammonia, Pigs.

INTRODUCCIÓN

El uso irracional de los antimicrobianos como profilácticos en los alimentos para animales, es un cofactor en el desarrollo de patógenos resistentes a los antibióticosC^1,2,3), lo que es una grave preocupación en salud humana y veterinaria^(4,5,6), pero además hay repercusiones ambientales al arrastrarse los fármacos en las excretas^(7,8). Por estas razones, se han buscado alternativas para limitar su uso, por ejemplo, mediante la acidificación de los alimentos con ácidos orgánicos^(9,10) se pueden lograr bloqueos al crecimiento de la microbiota enterotoxicogénica⁽¹¹⁾, pero la efectividad es variable dependiendo de sus constantes de disociación (pKa)^(9,12), tanto como de la composición de las dietas⁽¹¹⁾, su capacidad buffer y de las secuelas en la digestibilidad de los nutrientes⁽¹²⁾.

Aun cuando existen pocas citas en la literatura científica sobre el uso del ácido benzoico (o sus sales) aplicado a la producción y salud de los cerdos, se ha mostrado su efectividad por los efectos antibacterianos o antifúngicos⁽¹³⁾, en analogía a su uso casi universal en la conservación de alimentos. Pero su valor profiláctico no está en el poder de acidificación de la ingesta⁽¹⁴⁾ y parece residir en una lenta absorción a nivel intestinal⁽¹⁵⁾, con su posterior transformación metabólica, donde el hígado lo conjuga con glicina para producir ácido hipúrico, que se excreta cuantitativamente en la orina^(15,16). Por lo que, el ácido benzoico puede modificar la microbiota intestinal⁽¹³⁾ y actuar efectivamente para el control clínico de patógenos entéricos^(17,18).

La reducción del pH de la orina por el ácido hipúrico⁽¹⁶⁾, es de interés para la protección ambiental al prevenir la volatilización del amoniaco (NH₃), porque en solución y a un pH ácido, el NH₃ se mantiene en su forma protonada como amonio (NH₄+); a menor gasificación, el riesgo de irritar las mucosas de los animales y de sus manejadores se reduce⁽¹⁴⁾, pero el impacto ambiental más grave, la eutrofización, sólo se podrá evitar cuando se mantenga al NH₄⁺ en solución, o se ligue a otras formas de nitrógeno con menor solubilidad. En este contexto, existe un producto basado en esporas viables de cultivos específicos de Bacillus (BAC), el que se adiciona a la dieta como recurso de inoculación continua para la degradación de las excretas, con la ventaja de que estas especies usan el nitrógeno no proteico para la síntesis de su proteína y reducen las emisiones de NH₃⁽¹⁹⁾, pero no hay evidencia de la posible interacción con el ácido benzoico.

Este trabajo se condujo con la hipótesis de que el ácido benzoico, como recurso para reducir el uso de antibióticos en alimentos para lechones al destete, puede aumentar la fijación del nitrógeno soluble en las excretas, particularmente durante la fermentación, y que la adición de los cultivos de Bacillus podría potenciar esta función. Así, los objetivos de este trabajo fueron reducir la carga de antimicrobianos en los alimentos por el uso del ácido benzoico, y medir la interacción al adicionar los cultivos de BAC en el comportamiento productivo de lechones, en las características de las excretas y de las aguas residuales, como recursos para proteger la productividad animal y al ambiente.

Se realizaron dos ensayos, un experimento en condiciones de granja experimental y la validación de los resultados en el ambiente de una granja comercial con problemas infecciosos. El trabajo de investigación (Ensayo 1) se realizó en las instalaciones del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Fisiología y Mejoramiento Animal, INIFAP, situado a 20°41'42" N y 100°00'54" O y 1,969 msnm, mientras que el trabajo de validación (Ensayo 2) se llevó a cabo en una granja del estado de Guanajuato (20°36'56" N y 100°58'25" O y 1,744 msnm).

Ensayo 1

Se usaron un total 180 lechones en 36 unidades experimentales (UE), divididas en dos bloques (grupos consecutivos al destete), siendo 20 UE en el primer bloque y 16 en el segundo; la UE fue una jaula o corral con cinco lechones (tres machos castrados y dos hembras o tres hembras y dos machos, equilibrado entre tratamientos). En ambos bloques, los lechones se pesaron un día antes del destete y, con base en grupos contingentes por camada de origen, sexo y peso corporal, se aleatorizaron conforme a un diseño de bloques completos al azar, asignándose a los tratamientos y jaulas. La edad y peso promedio de los lechones al destete, al inicio del experimento, fue de 21 ± 1.6 días y 6.1 ± 1.17 kg.

El experimento se condujo durante las seis semanas posteriores al destete y se dividió en dos etapas, cada una de 21 días, con objeto de crear dos situaciones de estrés, por el destete y por el cambio de alojamiento, manejo ambiental y alimentación. En la primera etapa, los lechones se alojaron en una sala de ambiente controlado por un calentador de gas y ventilación natural. El edificio tiene 24 jaulas elevadas con piso de rejilla de plástico, para una superficie total de 1.63 m² y efectiva de 1.36 m², cada jaula cuenta con un comedero tipo tolva con seis bocas de alimentación y un bebedero de chupón al lado opuesto. Los lechones recién destetados se recibieron a una temperatura promedio del termostato de 30 °C y cada semana se disminuyó en 4 °C, hasta alcanzar un promedio de 22 °C en la tercera semana posdestete. Los últimos 21 días del ensayo se condujeron en un edificio de tipo frente abierto, sin más control ambiental que el uso de cortinas. El edificio tiene 24 corrales con piso sólido de concreto, para una superficie total de 6.19 m² y efectiva de 5.40 m². Cada corral cuenta con un comedero húmedo con tolva, que incluye un bebedero de chupón en el plato de consumo y un bebedero de chupón adicional, al lado opuesto del comedero. Al pasar de la sala de destete al edificio de frente abierto, se mantuvo la secuencia e identidad de las UE.

Se partió de un programa comercial de "preiniciadores" (Unión Ganadera Regional de Porcicultores de Guanajuato, Irapuato, Gto.), con tres fases de alimentación durante el experimento: Fase 1, primera semana posdestete; Fase 2, semanas 2 y 3 posdestete y Fase 3 durante las tres últimas semanas del ensayo. Normalmente estos alimentos incluyen antibióticos para controlar problemas digestivos y respiratorios, pero sólo se incluyeron los dirigidos al control de afecciones respiratorias diagnosticadas y prevalentes en la granja: se usaron 200 ppm de hidrato de amoxicilina (Amoxicoll®, Collins División Veterinaria, S. A. de C. V.) en todos los tratamientos de las primeras dos fases de alimentación y 100 ppm de fumarato hidrogenado de tiamulina y 300 ppm de Clortetraciclina (Denagard CTC^®, Novartis Salud Animal, México) en los alimentos de la Fase 3. Por lo demás, los aditivos se manejaron estrictamente como en el programa de alimentación comercial. Todos los alimentos se ofrecieron como pellet, de 2 mm en las fases 1 y 2, cambiando a 3 mm en la Fase 3.

En el Cuadro 1 se detallan los ingredientes y la composición de los alimentos. En las dietas se determinó la materia seca (MS), proteína cruda (PC), calcio (Ca) y fósforo (P) conforme a los procedimientos del AOAC⁽²⁰⁾. Los niveles calculados de energía metabolizable (EM) fueron de 3.45, 3.42 y 3.36 Mcal/kg, para las fases 1 a 3 y de lisina digestible (digestibilidad ileal estandarizada), en la misma secuencia, de 1.35, 1.32 y 1.28 %; con el resto de los aminoácidos limitantes, se mantuvo un perfil de proteína ideal⁽²¹⁾. Con la finalidad de estimular el consumo, los lechones se alimentaron en la sala de destete cuatro veces al día (0800, 1200, 1600 y 2000 h); pasados los primeros 21 días, al cambiar a los corrales en piso e iniciar con el alimento de Fase 3, se sirvió alimento sólo una vez al día (0800 h).

Los tratamientos resultaron del arreglo factorial (2 x 2) de dos niveles de ácido benzoico (ABZ, VevoVitall^®, DSM Nutritional Products México), la inclusión o no de 5 kg/t, y dos niveles de una premezcla con esporas viables de tres cepas específicas, dos de Bacillus subtillis y una de Bacillus lichenformis (BAC, MicroSource® S, DSM Nutritional Products México), 0 ó 0.5 kg por tonelada, para resultar en la adición o no de 7.36 x 10¹⁰ ufc/t de alimento terminado. Ambos aditivos se incluyeron sustituyendo una cantidad igual de grano de sorgo.

Los lechones se pesaron al inicio (al destete) y semanalmente hasta el día 42 posdestete. Diariamente se registró el alimento ofrecido por UE y al final de cada semana se retiraron y pesaron los remanentes para calcular por diferencia el consumo. El peso de los lechones y el consumo de alimento se registraron desde el inicio y cada semana, para calcular la ganancia diaria de peso (GDP), el consumo diario de alimento (CDA) y la eficiencia alimenticia, expresada ésta como la ganancia en función del consumo (GxC). Diariamente, enseguida de la primera oferta de alimento se realizó una inspección visual de cada una de las UE para calificar la consistencia promedio de las excretas con el uso de una escala de calificación del 1 al 5⁽²²⁾, en donde: 1= secas y duras, 2= normales, 3= pastosas, 4= semilíquidas y 5= líquidas; simultáneamente se llevó un registro de excepciones y observaciones clínicas.

Durante la estancia en el destete, y sólo con el primer bloque, cada semana se instaló un contenedor de plástico afín de una fosa anegada durante 24 h, para colectar una muestra de las aguas de desecho (o residuales). El contenido de cada uno de los contenedores se pesó, registrando el volumen y homogeneizando antes de tomar dos muestras, la primera de 1 L para estudios bacteriológicos y la determinación del pH, sólidos totales, nitrógeno total (N), nitrógeno amoniacal (NH₃), nitratos y nitritos, conforme a las Normas Mexicanas (NMX) o las Normas Oficiales Mexicanas (NOM). La segunda muestra fue una alícuota del 4 % del total de la fosa, que se agregó a una jarra Nalgene^® que se mantuvo cerrada (excepto por el momento en que se añadieron las otras muestras semanales) por 21 días después de agregar la última muestra (día 21 del experimento), para permitir la fermentación, emulando el trabajo de fosas anegadas por 21 días más (tiempo máximo de fermentación 35 días). Las jarras se mantuvieron en las salas de destete, creando entonces condiciones anaerobias similares a las fosas en granjas convencionales. El pH se determinó al momento de la toma de muestras con un electrodo conectado a un potenciómetro (Thermo^®, Orión 230A). Los sólidos totales se determinaron con el procedimiento descrito en la NMX⁽²³⁾. La determinación de nitrógeno total se realizó conforme a la NMX⁽²⁴⁾ (N de Kjeldahl), usando un sistema Kjeltec (FOSS 2300). La determinación de nitrógeno amoniacal siguió las indicaciones del AOAC, método 973.49⁽²⁰⁾. La determinación de nitratos y nitritos se realizó como lo marcan las NMX correspondientes^(25,26).

Al finalizar la estancia en la sala de destete (21 días posdestete), los lechones se transfirieron por UE a las instalaciones de crecimiento con piso sólido de concreto en un edificio de frente abierto. Inmediatamente, al desocupar la sala de destete, ésta fue lavada completamente con una máquina hidrolavadora a presión con un motor de 5.5 caballos de fuerza. El lavado se hizo detalladamente en cada una de las jaulas cronometrando el tiempo y, para estimar el gasto de agua, se conectó la manguera fuente de la hidrolavadora para aplicar el método volumétrico⁽²⁸⁾, que en lo particular consistió en llenar (en cada día de muestreo) 25 recipientes de 20 L, en los que se cronometró el tiempo para ser llenados, estimando entonces el flujo de agua, que fue de 17 ± 0.485 L/min; con el flujo de agua y el tiempo de lavado, se calculó el gasto. Así mismo, durante la estancia en el área de crecimiento, semanalmente se realizaron lavados parciales (sólo el área sucia) a cada uno de los corrales para aliviar la carga de excretas. Para ello, simplemente se lavó con el chorro de una manguera conectada a una toma de agua (i.e., no se usó la hidrolavadora) y al finalizar el experimento (42 días posdestete) los cerdos se movieron a otra área, y los corrales fueron lavados completamente con la misma hidrolavadora usada en el destete. Se registró el tiempo de lavado de cada uno de los corrales y, al igual que en la sala de destete, se cuantificó el tiempo de lavado para calcular el gasto de agua, que fue de 15 ± 0.921 L/ min.

Al final del experimento (después de 42 días, a los 63 días de edad), los cerdos se reagruparon por tamaño, independientemente de tratamientos, a corrales (superficie total de 18.51 m² y efectiva de 17.20 m²) de 12 a 16 animales, en los que se alimentaron a libertad con una misma dieta libre de antibióticos, de ABZ o de BAC, en forma de harina y en cuatro fases consecutivas (cada una de 21 días para cubrir los requerimientos de la población, Cuadro 1), siguiendo el crecimiento al pesar individualmente a los cerdos en intervalos de 42 días hasta los 147 días de edad, cuando se extrajeron los primeros cerdos para el mercado y se evaluó el coeficiente de variación en el peso vivo, considerando los efectos mayores de tratamiento.

El análisis estadístico de los datos se condujo con las restricciones de un diseño de bloques completos al azar, distinguiendo los efectos mayores de ABZ y de BAC, así como de su interacción. Se usaron los procedimientos GLM, MIXED, REG y CORR de SAS v.9.2⁽²⁹⁾ con las rutinas de Littell et al⁽³⁰⁾. Las variables del comportamiento productivo se presentan, como las medias de mínimos cuadrados, al final de la primera semana y de las respuestas acumuladas a 21 y 42 días, así como el gasto de agua de lavado a 21 y 42 días. La calificación del excremento y las variables del muestreo de las aguas residuales (microbiológicos y calidad de agua), se analizaron como muestras independientes no concatenadas. Al analizar las características de las aguas residuales, debido al proceso utilizado, la respuesta al día 35, resultó de la dinámica de acumulación, más la actividad microbiológica en el tiempo (alícuotas vertidas en las jarras), en las que se permitió la fermentación por una media ponderada de 28 días.

Ensayo 2

Se buscaron granjas con problemas infecciosos, habiéndose elegido una en el estado de Guanajuato, con antecedentes de PRRS y circovirus, que a la inspección previa, al inicio del ensayo, mostró signos de problemas respiratorios, cuadro que se juzgó agravado por hacinamiento y fallas en el manejo de la ventilación. Se optó por esta granja porque la infraestructura y la actitud de los manejadores permitía la comparación de la respuesta de los lechones a dos alimentos (tratamientos), en este caso el uso intensivo de antibióticos (del programa comercial decidido por el veterinario de la granja) y por la reducción de la carga de antibióticos al remover los de curso entérico por el uso de ABZ.

Se recabaron los datos de 384 lechones en 20 unidades experimentales (UE). Cada UE, consistió en dos corrales adjuntos, compartiendo un mismo comedero; en cada corral se tuvieron 8 ó 12 animales, lo que resultó en 40 corrales. El ensayo se realizó con un diseño de bloques completos al azar, donde cada bloque estuvo conformado por lechones nacidos en tres grupos consecutivos de parición. Se tuvieron tres bloques, en dos diferentes tipos de edificios: dos bloques en sendos edificios con 6 UE (12 corrales), cada una de 16 lechones (8 por corral) y un bloque con 8 UE (16 corrales) de 24 animales (12 por corral). Los lechones se destetaron a los 23 ± 1.2 días y aproximadamente el 8 % de los animales de menor peso en cada grupo se destinaron a una sala de cuidados intensivos (i.e., no se usaron para el ensayo), para que el personal de la granja, siguiendo sus prácticas convencionales, alojara a los animales en corrales homogéneos por tamaño, sin poner atención a la camada de origen o al sexo.

Los tratamientos (2) se plantearon con base en una modificación del tiempo de uso del Programa de alimentación comercial de la Unión Ganadera Regional de Porcicultores de Guanajuato: Fase 1 de 7 días; Fase 2 de 21 días y Fase 3 de 21 días. El programa de alimentación comercial (testigo), incluyó el uso rutinario de antibióticos indicados contra problemas respiratorios y digestivos, Fases 1 y 2, 200 ppm de hidrato de amoxicilina, 10 ppm de enramicina (Enradin^® F 80, MSD Salud Animal México), 44 ppm de clorhidrato de lincomicina y 44 ppm de sulfato de espectinomicina (Linco-Spectin^®, premezcla, Zoetis, México); Fase 3, fumarato hidrogenado de tiamulina, 100 ppm y clorotetraciclina, 300 ppm. En el segundo tratamiento (ABZ+BAC), se eliminaron parcialmente los antibióticos, sólo se incluyeron: Fases 1 y 2, 200 ppm de hidrato de amoxicilina; Fase 3 fumarato hidrogenado de tiamulina, 100 ppm y clorotetraciclina, 300 ppm, más la inclusión de ABZ a 5 kg/t y BAC, 0.5 kg/t.

Considerando el uso de los antimicrobianos o del ABZ y BAC, las dietas fueron las mismas que se describen en el Cuadro 1 y su preparación por la adición de los antibióticos, ABZ y BAC fue con los procedimientos que ya se describieron (Ensayo 1).

Los cerdos se pesaron individualmente al inicio, ya en las UE y dentro de las primeras 4 h después de su remoción a las salas de destete, y luego en los días 7, 28 y 49 posdestete (32, 53 y 74 de edad), mientras que el consumo se calculó semanalmente al registrar la cantidad servida y los remanentes al inicio de la siguiente semana. El ensayo se condujo durante la estancia de los animales en las salas de destete (por 49 días, en las que se inició con una temperatura de 30 °C por el control de estufas de convección y el manejo manual de cortinas, reduciendo gradualmente la temperatura en 2 °C cada semana.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Ensayo 1

Durante los meses del experimento (noviembre y diciembre) la temperatura ambiental promedio fue de 12.1 °C, con un rango de -7.9 a 27.6 °C y humedad relativa promedio de 37.8 %. En general el estado de salud de los animales fue bueno en ambos bloques; sin embargo, en el bloque 1, a partir del día 6 posdestete se notó en todas las UE una caída en el consumo de alimento, que se mantuvo hasta el día 12. Desde el día 9 posdestete, en el 60 % de los cerdos se notó una pérdida ostensible en la consistencia de las excretas (calificaciones entre 4 y 5), la severidad de las diarreas, que fueron evidentes en todas las jaulas, demandó una intervención clínica, inyectando a todos los lechones con clorhidrato de ceftiofur (3 mg/kg de peso vivo) durante tres días. La mejoría (en la consistencia de las excretas), se notó desde el segundo día de terapia y debe hacerse notar que fue en este período (día 7 a 14 posdestete) el único momento en el que se detectó un efecto del ABZ (P<0.02) en este criterio de respuesta (Cuadro 2).

Con los lechones del bloque 2, a los seis días posdestete se notaron algunos signos respiratorios (tos húmeda, estornudos, aletargamiento, pelo hirsuto, disminución en el consumo de alimento), lo que justificó el uso generalizado de clorhidrato de ceftiofur como se hizo en el bloque 1. Los signos, como antes, cedieron rápidamente. En ninguno de los bloques se volvieron a presentar problemas clínicos durante el transcurso del experimento. Aun cuando los signos en el bloque 1 fueron predominante-mente entéricos, la respuesta a las cefalosporinas y el cuadro mismo sugieren un origen respiratorio de la afección. Exceptuando las diarreas, quizá por la rapidez de intervención en el bloque 2, el cuadro de enfermedad en ambos casos coincide con la pérdida de inmunidad por seroconversión y sugiere un ataque oportunista de Pasteurella spp, de la que hay antecedentes en la granja.

En los parámetros de la respuesta productiva de los lechones (Cuadro 3), no se observaron interacciones (P>0.17) en ninguna de las variables analizadas, por lo que sólo se discuten los efectos mayores de tratamiento. Las únicas diferencias en comportamiento productivo, fueron aquéllas provocadas por el uso de ABZ, lo cual concuerda con lo esperado, ya que no se espera ningún efecto directo de BAC sobre el consumo de alimento o la ganancia diaria de peso de los lechones⁽¹⁹⁾. Así mismo, y según lo esperado⁽¹⁶⁾, el consumo diario de alimento ya sea a los 7, 21 ó 42 días no fue diferente (P>0.21) entre tratamientos.

Por efecto de la variación, el peso de los lechones sólo difirió (P<0.03) a los 42 días posdestete, cuando los lechones que recibieron ABZ pesaron 9 % más que los que no lo recibieron. Esto fue consecuencia de una mayor GDP, 73 % mayor (P<0.001) en la primera semana posdestete; luego de la cual, la diferencia (P<0.004) se fue haciendo menor, 18 % a los 21 días y 13 % a los 42 días. Como resultado de la mayor GDP, la eficiencia en el uso del alimento (GxC), siempre fue mayor (10 %; P<0.04) cuando las dietas incluyeron ABZ, lo cual concuerda con observaciones previas^(11,13).

El efecto del ABZ en el patrón de la respuesta durante los primeros 21 días es difícil de explicar, pero no se puede atribuir completamente a un efecto antimicrobiano intestinal, ya que los problemas entéricos fueron muy localizados y se atribuyeron como secuela de un problema respiratorio. Tampoco se pueden inferir consecuencias fisiológicas, porque el consumo de alimento fue prácticamente el mismo^(15,16). Adicionalmente, cuando se usan por ejemplo antibióticos como promotores del crecimiento, más allá de sus efectos terapéuticos, típicamente la respuesta de los animales susceptibles es mayor a la de los resistentes, con lo que se logran algunas mejoras en los coeficientes de variación (CV); en este experimento, el comportamiento de los CV fue prácticamente igual. Entonces, la única explicación de la respuesta al ABZ resta en el bienestar de los animales, y se sugiere la posibilidad de que la inmunidad de membranas esté involucrada, potencialmente al disminuir las consecuencias de la respuesta inflamatoria^(31,32).

Tanto en los alimentos, como en las aguas residuales se corroboró (P<0.001) la identidad de los tratamientos por las ufc de los microrganismos en BAC (Cuadro 4), ya que mientras se encontraron altas concentraciones de BAC en los alimentos adicionados y en las aguas residuales de quienes los consumieron, no fue posible distinguirlos en los alimentos sin BAC. El producto intacto ofrece 1.472 x 10⁸ ufc/g; cuando el alimento fue sometido a condiciones adecuadas para la germinación de las esporas de BAC, se encontraron 3.83 x 10⁴ ufc/g, lo que sugiere un 46 % de germinación (7.36x 10⁴ ufc/g de alimento terminado), y en las aguas residuales, se hallaron 3.19 x 10⁴ ufc/ml, lo que indica que el bacilo estuvo presente en los alimentos adicionados, y que fue capaz de germinar luego de su paso en el tracto digestivo, ya que el número de bacilos recuperados en las aguas residuales, fue mucho mayor del adicionado en el alimento.

Al usar los coliformes totales como indicadores de la contaminación microbiológica de origen entérico en las aguas residuales, a fin de calificar la posibilidad de que los aditivos redujeran la carga microbiana (Cuadro 4), se tuvieron efectos del ABZ en las aguas residuales de la segunda semana (12 %; P<0.02), de la tercera (5.6 %; P<0.09) y al final del período de fermentación (20 %; P<0.001). El ABZ reduce las poblaciones bacterianas en el intestino⁽¹³⁾, lo que explica la razón de haber encontrado un menor número de coliformes totales. Aun cuando el conteo de coliformes no difirió en la primera semana, la ganancia y la eficiencia sí mejoraron en respuesta a ABZ. La falta de diferencias en las ufc a la primera semana probablemente se deba a que los cambios en microbiota son paulatinos⁽¹⁰⁾. Lo que sí se modificó (P<0.001) desde la primera semana de consumo fue el pH de las aguas, por lo que pudiera considerarse que los efectos del ABZ también se asociaron a la acidificación de la orina, y no sólo a una respuesta antimicrobiana en el intestino^(15,16), lo que coincide en la idea de involucrar los efectos del ABZ con la inmunidad de mucosas y con el mantenimiento de la ecología intestinal^(32,33).

Como parte de las mediciones de productividad se incluyó al gasto de agua (Cuadro 3), en el que BAC (P<0.001) redujo la demanda de agua de lavado en cerca del 18 %, que es de un impacto importante, en especial si se cuantifica sumando el ahorro en el gasto energético y el tiempo de labor. La falta de interacción (P>0.2) entre ABZ y BAC sugiere que el ácido benzoico no interfiere con la actividad microbiana del BAC.

Al analizar la concentración total de nitrógeno en las aguas de desecho, éste se incrementó (5 %; P<0.03) sólo en respuesta a la inclusión de ABZ. En cambio, en el N amoniacal (Cuadro 5), ABZ y BAC interactuaron (P<0.07). Aparentemente los efectos de ambos son aditivos, lo que hace sentido porque el ácido benzoico, al reducir el pH (P<0.001) retiene al N amoniacal disociado (NH₄+)⁽¹⁴⁾, mientras que el BAC activado incorpora este N y otras formas a la síntesis de su proteína^(1,14). Aun cuando se analizaron nitratos y nitritos, no se encontraron efectos. En las aguas residuales los nitritos fueron 0.47 mg/L y los nitratos 8.81 mg/L, ambos dentro de norma^(24,25) y similares a lo obtenido en el agua de bebida (nitratos 7.24 mg/L y nitritos, 0.34 mg/L).

Habiendo concluido el Ensayo 1, al seguir el crecimiento de los cerdos hasta la cosecha de los primeros a la venta, a los 147 días de vida (después de 84 días de haber terminado la fase experimental), como se esperaba, la ventaja lograda por ABZ al día 42 posdestete se mantuvo hasta el final de la engorda (P<0.11): 94.2 ± 9.57 vs 91.3 ± 12.41 kg (Figura 1).

El mayor coeficiente de variación (13.6 vs 10.2 %) en el peso de los cerdos sin ABZ, se presenta gráficamente (Figura 1) y se explica por el peso mínimo en el rango (52.6 a 115.2 kg) y la frecuencia de casos por debajo de una desviación estándar (-1S) de la media, que fue menor con los cerdos que recibieron ABZ (74.43 a 115.7 kg), pero también en la incidencia de cerdos aptos para el mercado, los sobrevivientes y los que alcanzarían un peso superior a 95 kg a las 24 semanas de vida, que fue superior cuando los cerdos se alimentaron con ABZ (92.4 vs 87.5 %). Con estos resultados, se puede inferir que el efecto del ABZ, fue para proteger la productividad de los animales más susceptibles a los factores de estrés, que provocaron retraso en el crecimiento.

Los resultados de este primer ensayo indican que el ABZ es un recurso efectivo para proteger el crecimiento de los lechones al destete. Es probable que con este recurso se logre racionalizar el uso de los antibióticos, disminuyendo su carga en los alimentos pero, claramente, no como un sustituto de los antimicrobianos terapéuticos. Con BAC se potencian los efectos del ABZ para evitar las emisiones de NH₃ y se logran mejoras en el manejo de las excretas; en este caso se redujo el tiempo de lavado de las instalaciones y el gasto de agua.

Ensayo 2

Con la mezcla de los cuatro antibióticos (testigo), se redujeron las cuentas de coliformes totales, tanto como con el ABZ y BAC en presencia del hidrato de amoxicilina, lo que sugiere que el ABZ interviene tan efectivamente como la mezcla de antimicrobianos en el control de la proliferación de la microbiota intestinal^(10,17). Sin embargo, esta inferencia está confundida al no haber conseguido observaciones de un tratamiento sin antibióticos, o sólo con amoxicilina sin ABZ.

En el mejor de los casos, es probable que el ABZ haya mediado en la respuesta y, evidentemente, estos resultados sugieren la necesidad de indagar las posibles interacciones entre ABZ y la microbiota intestinal, saprófita y enterotoxigénica, al tiempo que es imposible inferir la posibilidad de efectos aditivos entre ABZ y amoxicilina u otros antibióticos^(11,13). Cuando más, es aparente que el uso de estos dos fármacos es compatible, y que el ABZ puede moderar las consecuencias de alteración de la microbiota por los antimicrobianos.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Los resultados indican que el ABZ es un recurso efectivo para proteger el crecimiento de los lechones al destete y reducir la variación en el peso vivo de los cerdos al final de la engorda; además de representar una alternativa al uso de antibióticos. Sin embargo, se requiere investigación que sustente su modo de acción, siendo posible, entre otros, la modificación de la microbiota intestinal, aunque también se sugiere la posibilidad de explorar sus efectos en la inmunidad de mucosas. El ácido benzoico previene las emisiones de NH₃ y los BAC protegen al ambiente y se justifican económicamente por la reducción en el gasto de agua. El ABZ no impidió la germinación de BAC, y además tuvo una interacción positiva entre con los BAC en la captura del NH₃; los efectos fueron aditivos.

AGRADECIMIENTOS

LITERATURA CITADA

1. Jensen LB, Sengeløv G, Andersen JS, Bolada SB, Halling-Sørensen B, Agersø Y. Bacterial antibiotic resistance levels in Danish farmland as a result of treatment with pig manure slurry. Environment International 2003;28:587-595.         [ Links ]

2. Álvarez JA, Otero L, Lema JM, Omil F. The effect and fate of antibiotics during the anaerobic digestion of pig manure. Bioresource Tech 2010;101:8581-8586.         [ Links ]

3. Mangalappalli-Illathu A, Duriez P, Masson L, Diarra MS, Scott A, Tien YC, Zhang Y, Topp E. Dynamics of antimicrobial resistance and virulence genes in Enterococcus fecalis during swine manure storage. Canadian J Microbiol 2010;56:638-691.         [ Links ]

4. Van Den Bogaard AE, Stobbering EE. Antibiotic usage in animals. Impact on bacterial resistance and public health. Drugs 1999;58:589-607.         [ Links ]

5. Valenzuela AS, Omar NB, Abriouel H, López RL, Veljovick K, Cañamero MM, Topisrovick MKL, Gálvez A. Virulence factors, antibiotic resistance, and bacteriocins in enterococci from artisan food of animal origin. Food Control 2009;20:381-385.         [ Links ]

6. Collignon P. Antibiotic resistance in human Salmonella isolates are related to animal strains. Proc Royal Soc B: Biol Sci 2012;279:2922-2923.         [ Links ]

7. Létourneau V, Duchaine C, Cote C, Letellier A, Topp E. Presence of zoonotic pathogens in physico-chemically characterized manures from hog finishing houses using different production systems. Bioresource Tech 2010;101:4048-4055.         [ Links ]

8. Varel VH, Wells JE, Shelver WL, Rice CP, Armstrong DL, Parker DB. Effect of anaerobic digestion temperature on odor, coliforms and chlorotetracycline in swine manure or monensin in cattle manure. J Applied Microbiol 2012;112:705-715.         [ Links ]

9. Partanen KH, Mroz Z. Organic acids for performance enhancement in pig diets. Nutr Res Rev 1999;12:117-145.         [ Links ]

10. Walsh MC, Sholly DM, Hinson RB, Saddoris KL, Sutton AL, Radcliffe JS, Odgaard R, Richert BT. Effects of water and diet acidification with and without antibiotics on weanling pig growth and microbial shedding. J Anim Sci 2007;85:1799-1808.         [ Links ]

11. Walsh MC, Rostagno MH, Gardiner GE, Sutton AL, Richert BT, Radcliffe JS. Controlling Salmonella infection in weanling pigs through water delivery of direct-fed microbials or organic acids. Part I: Effects on growth performance, microbial populations, and immune status. J Anim Sci 2012;90:261-271.         [ Links ]

12. Gerritsen R, van Dijk AJ, Rethy K, Bikker P. The effect of blends of organic acids on apparent fecal digestibility in piglets. Livestock Sci 2010;134:246-248.         [ Links ]

13. Guggenbuhl P, Séon A, Piñón-Quintana A, Simões-Nunes C. Effects of dietary supplementation with benzoic acid (VevoVitall®) on the zootechnical performance, the gastrointestinal microflora and the ileal digestibility of the young pig. Livestock Sci 2007;108:218-221.         [ Links ]

14. Mroz Z, Jongbloed AW, Partanen KH, Vreman K, Kemme PA, Kogut J. The effects of calcium benzoate in diets with or without organic acids on dietary buffering capacity, apparent digestibility, retention of nutrients, and manure characteristics in swine. J Anim Sci 2000;78:2622-2632.         [ Links ]

15. Kristensen NB, N0rgaard JV, Wamberg S, Engbaek M, Fernández JA, Zacho HD, Poulsen HD. Absorption and metabolism of benzoic acid in growing pigs. J Anim Sci 2009;87:2815-2822.         [ Links ]

16. Bridges JW, French MR, Smith RL, Williams RT. The fate of benzoic acid in various species. Bichem J 1970;118:47-51.         [ Links ]

17. Martínez AA, López J, Merino B, Cervantes J, Cuarón JA. Benzoic acid as feed additive for growing pigs naturally infected with Salmonella cholerasuis. J Anim Sci 2007;85(Suppl 1):516.         [ Links ]

18. Paulus C, Wiemann M, Valientes R. Benzoic acid and salmonella. Pig Progress. 2011;27:2-4. http://www.pigprogress.net/background/benzoic-acid-and-salmonella-the-latest-knowledge-7491.html Consultado 13 nov, 2012.         [ Links ]

19. Davis ME, Parrott T, Brown DC, de Rodas BZ, Johnson ZB, Maxwell CV, Rehberger T. Effect of a Bacillus-based direct-fed microbial feed supplement on growth performance and pen cleaning characteristics of growing-finishing pigs. J Anim Sci 2008;86:1459-1467.         [ Links ]

20. AOAC. Official Methods of Analysis. 15th Ed. Association of Official Analytical Chemist, Arlington, VA, USA: Association of Official Analytical Chemist. 1990.         [ Links ]

21. NRC Nutrient Requirement of Swine. National Research Council. 11th ed. Washington, DC, USA: Natl Acad Press; 2012.         [ Links ]

22. Montagne L, Cavaney FS, Hampson DJ, Lallés JP, Pluske JR. Effect of diet composition on post weaning colibacillosis in piglets. J Anim Sci 2004;82:2364-2374.         [ Links ]

23. Norma Mexicana. NMX-AA-034-SCFI-2001. "Análisis del agua. Determinación de sólidos y sales disueltas en aguas naturales, residuales y residuales tratadas. Método de prueba". Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 2001.         [ Links ]

24. Norma Mexicana. NMX-AA-026-SCFI-2001. "Análisis de agua. Determinación de nitrógeno total Kjeldahl en aguas naturales, residuales y residuales tratadas. Método de prueba". Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 2001.         [ Links ]

25. Norma Mexicana. NMX-AA-099-SCFI-2006. "Análisis de agua. Determinación de nitrógeno de nitritos en aguas naturales y residuales. Métodos de prueba". Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 2006.         [ Links ]

26. Norma Mexicana. NMX-AA-079-SCFI-2001. "Determinación de nitrógeno de nitratos en aguas naturales, potables, residuales y residuales tratadas. Método de prueba". Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 2001.         [ Links ]

27. Norma Oficial Mexicana. NOM-113-SSA1-1994. "Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa". Secretaria de Salud. 1994.         [ Links ]

28. CNA. Comisión Nacional del Agua. Ochoa AL. Serie autodidáctica de medición del agua. Métodos y sistemas de medición. Comisión Nacional del Agua. http://www.conagua.gob.mx Consultado 3 de nov, 2011.         [ Links ]

29. SAS User's Guide. Statistics (Version 9.2, 2nd Ed.). Cary NC, USA: SAS Inst. Inc. 2009.         [ Links ]

30. Littell PC, Henry PR, Ammerman CB. Statistical analysis of repeated measures data using SAS procedures. J Anim Sci 1998;76:1216-1231.         [ Links ]

31. Casula G, Cutting SM. Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2002;68(5):2344-2352.         [ Links ]

32. Brahmachari S, Jana A, Pahan K. Sodium benzoate, a metabolite of cinnamon and food additive, reduces microglial and astroglial inflamatory responses. J Immunol 2009;183:5917-5927.         [ Links ]

33. Maier E, Kurz K, Jenny M, Schennach H. Ueberall F, Fuchs D. Food preservatives sodium benzoate and propionic acid and colorant curcumin suppress Th1-type immune response in vitro. Food Chem Toxicol 2010;48:1950-1956.         [ Links ]