Estimación de la madurez ósea en canales de bovino por fluorescencia diferencial
Estimating bone maturity in beef carcasses through differential fluorescence
Gastón R. Torrescano Urrutiaa, Armida Sánchez Escalantea, Martín Gustavo Vásquez Palmab, Marco Antonio Valenzuela Escárcegab Ricardo Paz Pellatb, Dino A. Pardo Guzmánb
a Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD, AC), Carretera a la Victoria km 0.6, Hermosillo, Sonora. México. Tel. +52 (662) 2892400, Fax. +52 (662) 2800421. gtorrescano@ciad.mx. Correspondencia al primer autor.
]]> b Centro de Investigación y Desarrollo en Ingeniería Avanzada, S.A. de C.V.
Recibido el 17 de junio de 2011.
Aceptado el 2 de agosto de 2011.
RESUMEN
Actualmente, el análisis de clasificación de calidad de la canal depende en gran medida de la edad del animal; sin embargo, el patrón en México es demasiado impreciso, pues sólo requiere identificar si éste es menor o mayor a 30 meses. Esta falta de precisión genera la necesidad de sistemas objetivos para medir la madurez fisiológica. El propósito de esta investigación fue estimar de manera precisa el porcentaje de osificación del cartílago en la 12ava costilla, como un indicador de madurez ósea en canales de bovino, utilizando un esquema electrónico por visión artificial. En el esquema desarrollado se aprovecha la mayor fluorescencia que genera el cartílago, en comparación con la del hueso y la grasa, sobresaliendo claramente la región del cartílago, desarrollando algoritmos de procesamiento de imágenes para analizar esta región, y estimar de manera precisa el porcentaje de osificación, y por tanto la edad fisiológica de la canal. El sistema de visión artificial desarrollado permitió evaluar la madurez ósea de una canal en menos de un segundo, y la información obtenida fue utilizada para establecer la clasificación electrónica de la canal en menos de cinco segundos.
Palabras clave: Madurez, Osificación de cartílagos, Bovino, Imágenes fluorescentes.
ABSTRACT
]]> At present, carcass grading is dependent to a great degree on age of the animal. However, in México standards are vague on this matter, because the only requirement is stating if the animal is younger or older than 30 mo. This vagueness is the source of a need of developing objective systems for determining physiological maturity. Therefore, the purpose of the present study was estimating with great accuracy ossification of the cartilage in the 12th rib, as an indicator of bone ossification in bovine carcasses, by means of an electronic pattern obtained through artificial vision. In the model developed to this end, better use of fluorescence generated by the cartilage is made, in comparison to both bone and fat, and as a result the cartilage area stands out clearly, and by developing image processing algorithms for analyzing it, ossification percentage can be estimated with accuracy, and consequently, carcass physiological age. The artificial vision system developed in the present study allows evaluating bone maturity in a carcass in less than one second and data obtained is used for establishing carcass electronic grading in less than five seconds.Key words: Maturity, Cartilage ossification, Bovines, Fluorescent image.
INTRODUCCIÓN
De acuerdo a los criterios de clasificación de canales en México y Estados Unidos, es posible hacer una estimación de la edad fisiológica del animal mediante determinaciones visuales realizadas por personal técnico designado por las dependencias gubernamentales. En México, la clasificación de la carne de bovino en canal se rige por la norma MMX-FF-078-SCFI-2002(1), que tiene como objetivo establecer la calidad para asignación de mayor precio a mayor calidad, considerando diferentes criterios o atributos, siendo estos: madurez, conformación, color de la grasa y de la carne, distribución de la grasa subcutánea y perirrenal; y a conveniencia del mercado, se pueden considerar el marmoleo y la firmeza de la carne. Bajo este esquema, en México, el grado de calidad de la canal depende primeramente de la madurez ósea, y se clasifica de acuerdo con grados básicos de calidad en Suprema, Selecta, Estándar, Comercial y fuera de clasificación.
La norma de clasificación del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés)(2), asigna al marmoleo un peso específico muy importante, y junto con la madurez ósea definen el grado de calidad de una canal de bovino(2). Un contenido de grasa intramuscular abundante en animales menores de 30 meses se considera un grado de calidad de primera (Prime, en inglés); y para el resto, ésta dependerá del grado de marmoleo (de modesto a nulo) sin considerar variaciones en el grado de madurez.
Así, en ambos sistemas de clasificación la madurez ósea de la canal es importante. Primero, por su valor comercial debido al grado de madurez fisiológica; y segundo, por la importancia de la seguridad alimentaria, derivado de las enfermedades asociadas a la edad de los animales, como es la encefalopatía espongiforme bovina.
Las metodologías disponibles para medir el grado de madurez de la canal son subjetivas, haciéndolas imprecisas y lentas, ya que consideran aspectos como la osificación en vértebras sacras, lumbares y torácicas, además del color del cuerpo de las vértebras y costillas(1), generando dificultad para medirlos en la línea de producción.
La visión artificial es una técnica relativamente nueva, muy importante en el sector agroalimentario (procesos de clasificación y control de calidad), para realizar una evaluación objetiva, automática, rápida e higiénica(3). Así, mediante esta técnica puede estimarse con precisión, pero con éxito limitado, el área del ojo de la costilla(4), el color de la carne y grasa(5), la longitud del sarcómero(6), y la grasa intramuscular(7).
El grado de osificación, es el grado en que el cartílago se va transformando en hueso; asi, a mayor osificación mayor edad y mayor grado de coloración roja en el cartílago de las puntas de las apófisis vertebrales. Para determinar el porcentaje de osificación con un dispositivo electrónico se requiere de una correcta identificación del área del cartilago, por medio del procesamiento de imágenes. Sin embargo, se presenta un problema para identificar el cartilago, ya que alrededor de éste existen regiones con hueso o grasa, cuyo color puede ser similar, generando una confusión al equipo de visión artificial para distinguir al cartílago de otros componentes de sus alrededores.
]]> En estudios realizados por varios grupos de investigación sobre las propiedades ópticas del cartílago expuesto a radiación ultravioleta o infrarroja, se han obtenido nuevas posibilidades para identificar de manera precisa el área del cartilago(4,8-13). A diferencia de la grasa y hueso, el cartílago exhibe una fuerte fluorescencia cuando éste es excitado mediante radiación ultravioleta, con picos de emisión a 380 y 466 nm(13). Este comportamiento se asocia a la fluorescencia de los diferentes tipos de colágeno del cartilago(10,13 -15), y más específicamente a la emitida por colágenos del tipo I, III y V del músculo Longissimus dorsi, como resultado de la foto excitación a 332 y 380 nm(4); aunque el espectro de emisión de los colágenos tipo I y III es similar al del tejido perimisial en el Longissimus dorsi.En tanto que el color de la grasa, hueso y cartílago pueden ser muy similares, los dispositivos de visión artificial tradicionales enfrentan grandes dificultades para separar la región del cartílago del hueso y grasa adyacentes, por lo que en el presente trabajo se estudiaron las características diferenciales en la fotoluminiscencia de estos tres componentes para la construcción de un dispositivo electrónico, y el desarrollo de algoritmos de procesamiento de imágenes para estimar la madurez ósea de manera objetiva.
MATERIALES Y MÉTODOS
Captura de imágenes
La captura de imágenes se llevó a cabo utilizando una cámara digital Canon EOS 30D, SLR AF/AE (Canon Inc., Tokio, Japón), con balance de blancos y compensación en la temperatura de color, filtros de color primario tipo RGB y sensor CMOS de 8.2 mega pixeles. A efecto de controlar y automatizar el proceso de captura de imágenes, se adquirió el CD-S DK (Canon Digital camera Software Development Kit) versión 7.3 proporcionado por Canon. El CD-SDK es una librería que facilitó la construcción de una interfase con la cámara digital, donde se capturaron 20 imágenes por canal.
Para la captura de imágenes se desarrolló un software que tiene un módulo de visualización, que consta de tres filtros de media y de mediana para la eliminación de ruido, y un filtro creado especialmente para este proyecto, el cual ajusta los canales RGB (red, green, blue) a una amplitud y un "offset" dados. Con estos filtros se busca eliminar defectos de la imagen provocados por fallas del sensor de la cámara, que aparecen como picos de intensidad muy pronunciados. Estos picos se eliminan promediando la intensidad de los pixeles en su vecindad (filtro de media); si la variancia es mayor a un valor predeterminado, se utilizará el valor central de los datos cercanos (filtro de mediana), lo cual tiene la ventaja de que el valor final del pixel es un valor real presente en la imagen, y no un promedio, y de este modo se reduce el efecto borroso que tienen las imágenes debido al uso del filtro de media. La ventana principal es MDI, es decir, soporta varios documentos abiertos a la vez, por lo tanto se visualizan tantas imágenes como se desee.
Este módulo cuenta con dos ventanas que permiten el acceso al menú del software, las cuales despliegan información acerca de la imagen activa en tiempo real, RGB View y Phase View, que muestran los canales RGB y la fase de una línea seleccionada en la imagen. La selección de línea se realiza pulsando el botón con la función deseada sobre la imagen, con lo cual aparecerá un pequeño recuadro correspondiente al área de análisis.
La fuente de iluminación fue variada. Se prepararon diferentes fuentes de iluminación LED (light emission diode) en varios rangos espectrales con diodos electroluminiscentes: luz blanca (flash de la cámara), azul-UV, azul, verde, amarilla y roja, con valores alrededor de los 400, 440, 540, 570 y 640 nm respectivamente. Para las pruebas de fluorescencia se utilizó una fuente de 6 watts con pico de emisión en los 380-390 nm.
]]> Procesamiento de imágenes
Para analizar las imágenes capturadas se utilizaron los algoritmos generados como parte de este proyecto y otros algoritmos estándares de procesamiento de imágenes con el fin de convertirlas en imágenes binarias. A las imágenes se les aplicaron ajustes de umbral con el propósito de identificar contornos, para lo que se utilizó la transformada rápida de Hough, para posteriormente presentar las imágenes en diferentes espacios de color, segmentando por métodos como el k-means (con diferentes números de capas) o entropía máxima, teoría de grafos, análisis de los niveles de color en sus tres dimensiones, cambios a escala de grises, clasificación de partículas para identificar elementos con base en su redondez y tamaño, análisis de textura, manipulación del histograma en escala de grises y color; de manera que el algoritmo resultante para procesar las imágenes fuera una combinación optimizada de varios algoritmos de visión artificial.
Pruebas en campo
Las pruebas de campo se realizaron en 10 canales de bovino procesadas en una planta de sacrificio, corte y deshuese Tipo Inspección Federal (TIF), localizada en el Parque Industrial de la ciudad de Hermosillo, Sonora, México (29°052 563 N/110°572 153 O). Los animales fueron de la raza Brangus, machos sin castrar y en edades menores de 30 meses, lo cual se estableció de acuerdo a su dentición. Al final del faenado las canales se pesaron, y se etiquetaron para su identificación y posterior conducción a las cámaras de enfriamiento (0 °C), donde permanecieron por 24 h. La evaluación de las canales se llevó a cabo en un pasillo acondicionado antes de ser introducidas a la sala de deshuese, que convencionalmente también es utilizado para la clasificación electrónica de las canales. El acondicionamiento del pasillo consistió en establecer controles de iluminación ambiental, necesarios para las pruebas de color.
Evaluación de canales
El proceso de osificación del cartílago de las canales fue inspeccionado en el botón torácico localizado en la doceava costilla. Posteriormente, se tomaron varias imágenes consecutivas de los cartílagos sin emplear iluminación ambiental, puesto que se utilizaron los diferentes tipos de iluminación ya mencionados. Una vez capturadas las imágenes, se aplicaron los diferentes algoritmos de procesamiento desarrollados, para distinguir el cartílago en la imagen.
Análisis de la información
]]> En el análisis estadístico se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para valorar la distribución normal de las variables. Posteriormente al análisis descriptivo, se llevaron a cabo regresiones de Kruskal Wallis para determinar la significancia estadística a un intervalo de confianza del 95% (P<0.05). Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS versión 11 (SPSS Inc. Chicago, USA)(16).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de la madurez ósea por fotoluminiscencia
Para estimar la madurez ósea de una canal de bovino se desarrolló un sistema de procesamiento de imágenes que logra identificar el cartílago en una imagen, basado en las normas de México y Estados Unidos. Posteriormente, también se determinó el grado de madurez en base a la presencia de coloración rojiza que se presenta en las regiones detectadas, mediante la evaluación del área del cartílago y de las manchas de osificación en los mismos, calculándose el grado de madurez ósea como un porcentaje que los relaciona.
Como se aprecia en los Cuadros 1 y 2, existen ciertas discrepancias entre ambas normas para asignar, por ejemplo, una edad cronológica a una canal que muestra un 11 % de osificación en botones torácicos. Según la norma estadounidense una canal así correspondería a un animal entre 30 y 42 meses de edad, mientras que en la norma mexicana este animal podría tener entre 25 y 30 meses. Entonces, de acuerdo a la norma mexicana, esta canal correspondería a un grado "Selecta", mientras que en la norma estadounidense podría ser Prime, Choice, Standard, Utility, pero no Select.
Más allá del grado de calidad, la calificación de un animal menor de 30 meses es considerada mejor que la dada a un animal mayor de 30 meses en ambas normas. Por ello, en el dispositivo electrónico que se desarrolló en el presente proyecto es posible seleccionar la norma de clasificación del interés del operador.
Durante el sacrificio, al separar las canales en dos partes, se pueden observar los cambios en la calcificación (osificación) de los cartílagos y huesos, así como en la textura superficial de la carne, los cuales son utilizados como indicadores de la madurez de la canal(17). Estos cambios se observan a lo largo de la columna vertebral, especialmente en las vértebras sacras, las cuales son las primeras en osificarse y fusionarse, aumentando la calcificación de éstas al aumentar la edad del animal, lo cual provoca que los músculos sean oscuros(18). La evaluación del grado de calcificación dependerá de la suavidad, coloración y porosidad de los huesos, siendo indicativo de un animal joven cuando aparecen botones en los cartílagos de las vértebras torácicas, las cuales desaparecen con la madurez del animal(19).
Aplicación de las técnicas de segmentación en imágenes en carne y cartílago
]]> En el análisis de las imágenes adquiridas se hicieron pruebas con un software de procesamiento de imágenes, cambiando a forma binaria mediante ajustes en el umbral, buscando contornos, variando el espacio de color, segmentando por métodos como el k-means (con diferentes números de capas) o entropía máxima. Posteriormente, se analizaron los niveles de color en las tres dimensiones, cambiando a escala de grises; después, se hizo la clasificación de partículas (en un principio se tenían fotos con manchas de osificación redondas) para separar con base en la forma (redondez) y el tamaño. Además, se analizó la textura manipulando el histograma, tanto en escala de grises como en color; realizando estas pruebas en cada capa de colores por separado o con mezcla de ellas.La Figura 1 muestra dos imágenes con diferente grado de osificación en los cartílagos. En la primera (a) se observa una canal que presenta osificación completa; mientras que la segunda (b) muestra un caso que presenta osificación con cierto grado de avance, lo cual se indica dentro de los círculos azules. Estas imágenes fueron las que se utilizaron en las pruebas iniciales de los algoritmos de segmentación, las cuales se presentan más delante de forma detallada.
Pruebas de segmentación por selección de umbral
La forma básica de hacer la conversión de RGB a escala de grises es mediante el promedio de las tres capas de color; es decir, promediando las intensidades de cada color mediante la siguiente ecuación:
Las imágenes en formato binario, blanco o negro sin escala de grises, pueden obtenerse asignando un valor de 1 ó 255 a los valores por encima de un umbral; 127 por ejemplo, en la escala de grises en la Figura 2(a), y asignando un valor 0 a los valores por debajo del mismo umbral, para finalizar con una imagen binaria como se muestra en la Figura 2(b). Esta técnica por sí sola no fue suficiente para identificar la región del cartílago, pues éste se confunde con la grasa.
El tipo de imágenes del cartílago que se trataron de analizar, no presentó un patrón definido, lo cual posiblemente se debió a que la coloración, las formas y tamaños suelen cambiar de un animal a otro, así como la cantidad y color de la grasa, de cartílagos y huesos. Sin embargo, sí presentan (de forma regular) al menos tres tipos de tejidos: grasa, hueso y músculo esquelético, y a veces cartílago y cartílago osificado. Debido a esto se intentaron hacer pruebas de análisis por segmentación en regiones similares, o "clusterizando" por color. Esta metodología es recomendada en aquellos casos donde existe cierta diversidad de texturas, pero que se puedan agrupar en cierto número de clases. El método que logra este tipo de segmentación es el llamado k-means, el cual recibe como entrada la imagen y el número de segmentos clústeres o elementos que se quieren identificar.
En la Figura 3 se muestra la imagen adquirida de una sola apófisis con cartílago y osificación que también incluye grasa y que posteriormente fue procesada mediante k-means en 2, 3 y 4 segmentos. Puede observarse como el método falla en la ubicación del cartílago, ya que una vez más lo confunde con la grasa en los tres casos.
Pruebas de fotografía con diversas fuentes de luz
Dada la diversidad de formas y colores que pueden presentar tanto la grasa como el hueso y el cartílago, las diferentes técnicas de procesamiento de imágenes apuntaron al mismo problema: desarrollar un mejor sistema de captura de imágenes que resaltara con mayor claridad la región del cartílago, sin importar el color o forma de los elementos en la imagen. Para ello se instalaron fuentes de iluminación en varios rangos espectrales como se muestra en la Figura 4.
La luz blanca (Figura 4a) muestra el problema típico inicial, donde la grasa y cartílago se confunden en unas regiones y en otras no. Con la luz verde o azul (Figura 4b y 4c) se observa una ligera mejoría, ya que el cartílago parece reflejar la luz con mayor intensidad, pero aún no lo suficiente.
]]> La Figura 4d muestra una clara mejoría, el cartílago fluoresce con mayor intensidad que las regiones adyacentes. Para las pruebas de este tipo de iluminación se utilizaron lámparas de 6W para el caso de luz ultravioleta (luz negra con emisión entre 350 y 400 nm). La fluorescencia generada por este tipo de radiación permitió una notable mejoría en la diferenciación del cartílago, por lo que se prosiguió con la aplicación de técnicas de segmentación para separar la región del cartílago para su posterior procesamiento.
Cálculo de porcentaje de avance de osificación
Una vez que se logró resaltar la región deseada, es decir la segmentación de las regiones ocupadas por los cartílagos, se procedió a determinar el porcentaje de avance de la osificación. En este punto se tuvo como entrada la imagen binaria, que marca con blanco a los cartílagos y en negro el resto de los objetos. El siguiente paso requiere,
1) El área total del cartílago con y sin osificación (B); 2) el área de osificación (R); 3) hacer el cálculo del porcentaje de osificación:
Utilizando la escala y correlacionando la madurez ósea del cartílago con la edad cronológica de la canal, mostrada en el Cuadro 1, se logró establecer una relación funcional entre osificación de los botones torácicos y edad aproximada (aplicada a la norma mexicana). Para ello se graficaron los datos de esta tabla y aproximado por mínimos cuadrados a una curva polinomial de tercer grado.
La curva resultante con un R2=0.8289, es:
Edad (meses)= 20.298+85.365*0-200.19*02+166.38*03
]]>En forma similar para la norma estadounidense, con un R2=0.7411:
Edad (meses)= 17.533+134.82*0-222.93*02+197.10*03
Donde O es el porcentaje de osificación del botón torácico.
Pruebas con imágenes capturadas en rastro TIF
Para probar que el funcionamiento del sistema de segmentación con iluminación UV (luz negra) era el adecuado, el equipo se instaló en una planta TIF para capturar algunas imágenes dentro de las áreas refrigeradas. Las lámparas se montaron en el mismo tripié que la cámara y se construyó una cortina para obstruir la luz ambiental. Las imágenes de la Figura 6, donde (a) corresponde a la fluorescencia de un cartílago, (b) al cartílago segmentado y separado de la imagen original, y (c) a la imagen en binario para identificar el cartílago sin osificación (blanco) y con osificación (rojo) son un ejemplo de este procedimiento.
Utilizando la ecuación para la norma mexicana, se estimó la edad correspondiente:
Edad (meses) = 20.928 + 85.368*0.566 -200.19*0.5662 + 166.38*0.5663
Edad (meses)= 25.1 meses de edad estimada
En forma similar, según la norma estadounidense:
EdadUSA (meses)= 17.533 + 134.82*0.566 -222.93*0.5662 + 197.1*0.5663
EdadUSA (meses)= 24.5 meses de edad estimada
Estos resultados confirman que con el uso de las ecuaciones obtenidas, es posible estimar la edad de los animales con una mayor similitud a la edad cronológica, al obtener valores cercanos a los que se obtuvieron con el método que utiliza la evaluación de la dentición.
]]> CONCLUSIONES E IMPLICACIONES
Se desarrolló una técnica de análisis de madurez ósea por visión artificial, utilizando una fuente de iluminación en el ultravioleta cercano. Con el dispositivo electrónico construido es posible evaluar en fracción de segundos el porcentaje de osificación del cartílago en el botón torácico de la 12ava costilla de bovinos, y estimar la edad fisiológica del animal según la norma mexicana o la estadounidense. Ambas normas deberán establecer una relación funcional entre el porcentaje de osificación observado y la correspondiente edad cronológica. Con el uso de fuentes ultravioleta por diodos electroluminiscentes con pico en 380 nm, sería posible tener una señal de excitación más definida (pico de emisión más angosto) que las lámparas de luz negra, y por lo tanto la imagen del músculo, grasa y hueso estaría más oscura con relación a la imagen del cartílago. Esto facilitaría aún más la segmentación de la imagen y por tanto la posibilidad de evaluar la madurez ósea de cualquier canal en menos de un segundo. Las ecuaciones obtenidas con este método permiten determinar con mayor precisión la edad de los animales, que con la evaluación de la dentición.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Fondo Sectorial SAGARPA-CONACYT-COFUPRO por su apoyo financiero para la realización del proyecto Clave 48567 denominado: Dispositivos optoelectrónicos y modelación multivariable para la trazabilidad integral de la calidad en productos cárnicos y administración de ranchos.
LITERATURA CITADA
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