Evaluación de subpoblaciones de linfocitos T en bovinos vacunados contra la tuberculosis bovina: estudio longitudinal comparativo

Evaluation of T lymphocyte subpopulations in cattle vaccinated against bovine tuberculosis: longitudinal comparative study

Xochitl Eva González González^a, Laura Jaramillo Meza^b, Ricardo Lascurain Ledezma^c, Jorge Torres Barranca^a, Eve–Lyne Quevillon Cardinal^d, Fernando Díaz Otero^b

^a Universidad Autónoma Metropolitana– Xochimilco, UAM–X. México.

^c Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM.

^d Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM.

Recibido el 17 de agosto de 2010.
Aceptado el 14 de enero de 2011.

Resumen

La respuesta inmune a las micobacterias es compleja y en ella participan diferentes poblaciones de linfocitos T; sin embargo la clave en la defensa contra estos microorganismos es el establecimiento de una respuesta inmune tipo Th1. El objetivo fue realizar un análisis de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T y de la expresión del marcador de activación en becerras vacunadas con BCG, o con el extracto proteico del filtrado de cultivo (CEPE) de Mycobacterium bovis bajo condiciones de campo. Se formaron tres grupos con cinco becerras cada uno, seleccionadas aleatoriamente. Uno se inoculó subcutáneamente con BCG, 10⁴ UFC; otro con 300 μg/ml del CFPE y el tercero fue el testigo. Los resultados de seguimiento de la respuesta inmune se analizaron por MANOVA. La BCG indujo la producción de IFN–γ en una etapa más temprana que el CFPE, sin diferencia estadística entre ellos. El CFPE además de inducir la producción de IFN–γ favoreció la respuesta mediada por anticuerpos (P<0.05). En el grupo vacunado con BCG se observó un mayor porcentaje de linfocitos T CD4 en los cultivos estimulados con PPD bovis (P<0.05). La proporción de linfocitos T γδ activados fue mayor en el grupo vacunado con CFPE en el día 30 postvacunación; misma que se incrementó para el grupo BCG al día 60. La dosis de vacuna BCG empleada fue capaz de inducir una respuesta proliferativa de linfocitos CD4 con mayores niveles de IFN–γ que el CFPE como inmunógeno, señalando el desarrollo de una mejor respuesta inmune en los becerros vacunados con la BCG.

Palabras clave: Tuberculosis bovina, Vacunas, Inmunidad, Linfocitos.

Abstract

The immune response to mycobacteria is complex and involves different T cell subsets. However, the key in the resistance against the bacillus is the establishment of a cell–mediated immune response. The objective of this study was to carry out a comparative analysis of different subpopulations of T lymphocytes and expression of cellular activation marker CD25 in calves vaccinated with BCG or with Mycobacterium bovis culture filtrate protein extract (CEPE) under field conditions. Three randomly assigned groups of 5 calves each were formed. One of them vaccinated subcutaneously with BCG, 10⁴ CFU; another with 300 μg/ml of CFPE and the third group was the control. The results of monitoring the immune response were analyzed by MANOVA. The BCG induced IFN–γ production in an earlier stage than the CFPE in the vaccinated groups with no statistical difference between them. The CFPE, besides inducing IFN–γ production, enhanced antibody–mediated response (P<0.05). The group vaccinated with BCG showed a higher percentage of CD4 T lymphocytes in cultures stimulated with bovine PPD (P< 0.05). The rate of γδ T lymphocyte activation was higher in CFPE group at d 30 post–vaccination, which increased for BCG group at d 60. Thus the dose of BCG vaccine used in the study was capable of inducing a proliferative response of CD4 T cells with higher levels of IFN–γ than CFPE as immunogen, indicating a better immune system enhancement in calves vaccinated with BCG.

Key words: Bovine tuberculosis, Vaccines, Immunity, Lymphocytes.

INTRODUCCIÓN

La tuberculosis bovina (TB) produce un impacto directo en la eficiencia productiva y reproductiva del ganado bovino de leche, y como consecuencia provoca importantes pérdidas económicas al sector pecuario; a más de representar un riesgo para la salud humana⁽¹⁾; por eso las estrategias de control basados en la vacunación se consideran la mejor alternativa. Para conseguir éxito en ese propósito es necesario determinar las condiciones óptimas bajo las cuales debe aplicarse la vacuna, así como comprender los mecanismos inmunológicos que ofrecen resistencia contra la enfermedad. 0iendo Mycobacterium bovis un patógeno intracelular es deseable que las vacunas que se empleen induzcan una inmunidad tipo Th1, caracterizada por la producción signi fi cativa de interferón gamma (IFN–γ), factor de necrosis tumoral alfa (TNF–ot) e interleucina (IL–12), citocinas responsables de la activación y efecto microbicida de los macrófagos, principales células efectoras contra microorganismos intracelulares⁽²⁾.

En bovinos infectados con M. bovis se determinó que los linfocitos T CD4⁺ específicos producen cantidades más altas de IFN–γ en relación a otras poblaciones celulares⁽³⁾. De igual modo, las células T CD8⁺ poseen un papel i m portante en la resistencia hacia la tuberculosis, ya que además de destruir directamente a las células infectadas, delimitan el granuloma e impiden la diseminación bacteriana^(4,5). Estudios experimentales empleando dosis altas de vacuna BCG (8 X10⁶ UFC) señalan que la primera población que se activa y prolifera después de la vacunación es la de los linfocitos Tγδ; mientras que los linfocitos T CD4+ aumentan a partir de la cuarta semana, siendo las células CD8⁺ la última población en activarse⁽⁶⁾.

Los linfocitos Tγδ representan el enlace entre la inmunidad innata y la inmunidad adquirida; poseen funciones antiinflamatorias, de protección y de regulación, por tanto representa una primera línea de defensa contra patógenos intracelulares⁽⁷⁾. Estas células se acumulan en el sitio de lesión al inicio del proceso infeccioso y funcionalmente son capaces de producir IFN–γ, y exhibir citotoxicidad en respuesta a macrófagos infectados, otra de sus habilidades es reconocer antígenos no peptídicos en ausencia de mecanismos clásicos de presentación antigénica^(8,9). La molécula CD25 mejor conocida como la cadena alfa del receptor de IL–2 está involucrada en la activación y regulación de las funciones efectoras de los linfocitos, así como en la división y la proliferación de células de memoria. Por tanto su cuantificación es un indicador temprano de la activación celular⁽¹⁰⁾.

Dentro de las estrategias del progreso de mejores vacunas contra l a TB se considera necesario identificar aquellos antígenos capaces de inducir una respuesta inmune celular. En relación a ello, se ha observado que las micobacterias vivas, son eficientes en la generación de protección contra la enfermedad; este hecho se ha utilizado como argumento para sustentar que los antígenos secretados durante el metabolismo activo de la micobacteria, y que están presentes en los extractos de filtrado de cultivo (CFPE) son esenciales para el propósito buscado⁽¹¹⁾. Actualmente no existe claridad sobre cuáles son las mejores condiciones para proteger a los bovinos contra la tuberculosis bovina mediante la vacunación; lo que es innegable es que el tipo de inmunógeno empleado y la dosis son factores determinantes para la inducción de resistencia a la enfermedad^(12,13). Así, el objetivo del trabajo fue realizar un análisis comparativo de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T y de la expresión del marcador de activación celular CD25 en animales vacunados con BCG, o con el extracto proteico del filtrado de cultivo de Mycobacterium bovis bajo condiciones de campo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales de estudio

Se seleccionaron 15 becerras Holstein–Friesian, entre 15 a 30 días de edad, localizadas en un hato del estado de Hidalgo, México, y que provenían de madres negativas a la prueba de tuberculina; de igual modo durante los primeros días de su nacimiento se les suministró calostro de madres no reactoras. Las becerras se dividieron en tres grupos de forma aleatoria, con cinco animales cada uno. El Grupo I se inoculó subcutáneamente con la vacuna BCG cepa Phipps de M. bovis (1x10⁴ UFC); el Grupo 2 se inoculó con 300 μg/ml del extracto proteico de filtrado de cultivo (CFPE) por la misma ruta; el Grupo 3, testigo, se inoculó con 1 ml de PBS como placebo. Las becerras se muestrearon cada 15 días en el primer mes y posteriormente cada 30 días por espacio de tres meses para evaluar la producción de IFN–γ en cultivos de sangre estimulados con PPD–bovino, niveles de anticuerpos mediante un ELISA empleando el CFPE de M. bovis como antígeno. La respuesta de las subpoblaciones celulares se determinó por citometría de flujo, luego de la estimulación antigénica in vitro de cultivos de células mononucleares de sangre periférica.

Obtención del extracto proteico de filtrado de cultivo de M. bovis

Se empleó la cepa AN5 de M. bovis para obtener el extracto proteico utilizado para la inmunización de las becerras y para la evaluación de la inmunidad humoral. La micobacteria se cultivó en medio líquido de Dorset–Henley a 37 °C por seis semanas, al término, los cultivos se filtraron obteniendo el medio libre de bacterias. Las proteínas constituyentes del filtrado se precipitaron con sulfato de amonio a una saturación del 80 %, y se recuperaron por centrifugación a 10,000 rpm por 60 min a 4 °C (Beckman rotor J0–13.1). El precipitado se suspendió en PBS pH 7.2 para dializarse primero contra agua y después con PBS empleando bolsas de diálisis (0pectra/Por) con límite de exclusión de 6 a 8 kDa⁽¹⁴⁾. La concentración de proteína del extracto se determinó por el método de Bradford⁽¹⁵⁾, su concentración se ajustó a 3 mg/ml y dividió en alícuotas que se almacenaron a –70 °C.

Obtención de la vacuna BCG Phipps

La cepa Phipps de BCG de M. bovis se cultivó en medio Middlebrook 7H11 (Difco Laboratories, Detroit MD, USA ) enriquecido con 10% de OADC (Oleic acid–Album i n–D extrose–Catalase) (BBL Middlebrook OACD Enrichment, Becton Dickinson, 0parks MD, USA) a 37 °C por 15 días. Posteriormente, se inocularon frascos conteniendo medio Middlebrook 7H9 líquido (BBL Middlebrook 7H9 Broth Base, Becton Dickinson, Cockeysville MD, USA ) enriquecido con 10% de OACD y 0.5% de Tween 80 (Sigma–Aldrich, Inc.). Los cultivos se incubaron a 37 °C por ocho días con agitación constante; hasta alcanzar la fase media logarítmica. Se realizaron diluciones en medio 7H10 y se ajustó la concentración celular a 1x10⁴ UFC/ml en PBS estéril⁽¹⁶⁾.

Prueba de Interferón–γ (IFN–γ)

Se obtuvieron muestras de sangre con heparina de las becerras, la cual se distribuyó en placas de cultivo en condiciones de esterilidad a razón de 1.5 ml de sangre por pozo, considerando tres pozos por muestra. Uno de los cultivos se estimuló con 100 μl de PPD bovino, otro con 100 μl de PPD aviar (ambos PPD a una concentración de 0.3 mg/ ml) y dejó uno sin estimular. Las placas se incubaron a 37 °C por 24 h bajo una atmosfera humidificada con 5% de CO₂. Al término de la incubación se obtuvo el plasma de los cultivos para evaluar la producción de IFN–γ mediante un ELISA sándwich, empleando un kit comercial (BOVIGAM_TM Bovine Gamma Interferón Test)⁽¹⁷⁾.

Para la determinación de anticuerpos se cubrieron placas de ELISA (Maxisorb, NUNC) con el CFPE de M. bovis a razón de 1 μg/100 μl disuelto en solución amortiguadora de carbonato/bicarbonato (0.1 M), pH 9.6 por pozo. Los sitios de unión libres se bloquearon con leche descremada al 3% en PBST. Luego de este procedimiento y del lavado de las placas, se depositaron 100 μl de de cada uno de los sueros diluidos 1:100 en solución bloqueadora, y se incubaron por 1 h a 37 °C. Nuevamente se lavaron las placas y se agregaron 100 μl de proteína–G peroxidasa (Sigma–Aldrich Chemicals. st. Louis MO., USA) a una dilución 1:10,000, incubando 1 h a 37 °C. Después de los correspondientes lavados se agregó la solución de revelado [4 μg de orto–fenilendiamina (Sigma–Aldrich Chemicals. st. Louis MO., USA) disuelta en 10 ml solución amortiguadora de citratos pH 4.5, adicionando 4 μl de H₂O₂ al 3%]. La reacción se detuvo mediante la adicción de 50 μ/pozo de la solución de paro (H₂ SO₄ 2M). Se determinaron las absorbancias de la prueba a 492 nm (18).

Obtención de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Para la determinación de las poblaciones celulares se obtuvo sangre de las becerras con heparina, la cual se diluyó 1:2 con PBS estéril y depositó sobre Ficoll–Hypaque. Los tubos con los contenidos se centrifugaron (Eppendorf 5810R) a 2,800 rpm por 40 min y recuperó la interfase de las PBMC. La suspensión celular se lavó con PB 0 estéril centrifugando a 1,500 rpm x 5 min. Se determinó la viabilidad de las células mediante el método de exclusión con azul tripan. Posteriormente se ajustó su concentración a 2.5 x 10⁶ células/ml en medio RPMI–1640 suplementado (10 mM del amortiguador HEPES, 2 mM de L–glutamina, 50 μM de 2–mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ ml de estreptomicina y 10% suero fetal).

Estimulación de linfocitos

La suspensión celular se distribuyó a razón de 1.5 ml/pozo en placas de cultivo de 24 pozos (Nunclon, Roskilde, Denmark), considerando dos pozos por muestra. Uno de los cultivos se estimuló con 100 μl de PPD bovis (0.3 mg/ml) y al otro se le adicionaron 100 μl de PBS como testigo. Los cultivos se incubaron a 37 °C por 72 h bajo una atmosfera humidificada con 5% de CO₂. Al término de la incubación las células se colectaron y transfirieron a microtubos para eliminar el sobrenadante por centrifugación y efectuar un lavado con PBA (PBS estéril pH 7.2, conteniendo azida de sodio al 0.2 % y albúmina sérica bovina al 0.2 %) para efectuar el marcaje de las poblaciones por tinción indirecta.

Marcaje de subpoblaciones de linfocitos T y el receptor de IL–2 (CD25)

Las células se suspendieron en 1 ml de PBA y se dividieron en cuatro partes que se depositaron en microtubos, luego de centrifugar a 1,500 rpm por 10 min se adicionó el anticuerpo monoclonal correspondiente a diluciones previamente establecidas, se mezcló suavemente y se dejó incubara temperatura ambiente por 30 min. Después de lavarse por centrifugación se adicionó el segundo anticuerpo monoclonal fluorescente según el isotipo del primer anticuerpo monoclonal empleado (Cuadro 1), incubándose por 30 min a temperatura ambiente. Al final se lavó con PBA a 1,500 rpm 10 min, y se adicionaron 500 ml de la solución FAC0Flow (BD Biosciences 0an José, CA) para su análisis⁽¹⁹⁾.

Citometría de flujo

La adquisición y análisis de los datos del fenotipo de las subpobl aci ones se realizó m ediante el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson 0an José EU). Se capturaron 5,000 eventos y mediante un gráfico de tamaño contra complejidad celular se estableció la región de los linfocitos. Para el análisis de los datos se empleó el software WinMDI 2.8.

Se realizó un análisis de varianza multivariada (MANOVA) para la comparación de resultados entre grupos en los diferentes tiempos de muestreo, empleando el programa estadístico JMP Starter (USA)⁽²⁰⁾.

RESULTADOS

Evaluación de IFN–y en becerras vacunas con BCG o con CFPE

Los niveles de IFN–γ al inicio del experimento para los diferentes grupos en presencia del PPD bovis fueron bajos, 0.178 ± 0.0165 (promedio de la D.O450_nm ± error estándar), incrementándose a través del tiempo y sin ser significativo en las primeras dos semanas pos vacunación para los diferentes grupos. A los 30 días se observó la mayor respuesta en el grupo vacunado con BCG, 0.788 ± 0.298 vs 0.487 ± 0.104 del grupo vacunado con CFPE y 0.2198 ± 0.106 del grupo testigo. En los

meses subsecuentes los niveles de la citocina descienden en el grupo vacunado con BCG; en tanto que a los 60 días en el grupo vacunado con el CFPE se registró el nivel más alto de producción, 0.8531 ± 0.5812. Durante el experimento se observaron incrementos en la producción del mediador evaluado para el grupo testigo, pero los valores que se registraron en los primeros dos meses del experimento no excedieron a los que se determinaron para los grupos vacunados, a excepción del último muestreo en el que la producción de IFN–γ fue superior a estos, 1.215 ± 1.142 (Figura 1a), no existió diferencia estadística entre grupos.

Respuesta inmune humoral en becerras vacunas con BCG o con CFPE

Evaluación de subpoblaciones de linfocitos T

El porcentaje promedio de células T CD4 + que se registró antes de la aplicación de las vacunas en las becerras que fueron inoculadas con BCG y las del grupo testigo fue del 25 %, en tanto que el del grupo vacunado con CFPE fue del 17 %. A los 15 días pos vacunación hubo un incremento significativo luego de la estimulación in vitro en el grupo vacunado con BCG, 32.7 % (P<0.05). De igual modo, un porcentaje significativo de esta población celular se determinó en el grupo inoculado con el CFPE a los 60 días, 32.8 % (P<0.05) (Figura 2a). En relación a las células T CD8 + en el grupo vacunado con BCG el porcentaje más alto se registró a los 15 días con un valor promedio del 19 % (P<0.05), situación que coincide en tiempo con el mayor porcentaje de células T CD4 + observado para este grupo. En tanto que en el grupo inoculado con el CFPE el valor más alto de células T CD8 + se determinó a los 90 días, 29 % (P<0.05). Los porcentajes del grupo testigo estuvieron por debajo de los valores de los grupos vacunados en las primeras semanas del experimento, a excepción de los 30 días, cuando el porcentaje fue mayor que los de los grupos vacunados, 22 % vs 16 % para BCG y 15 % para CFPE, (Figura 2b). Al inicio la proporción CD4/CD8 era más alta en el grupo testigo 2.29 vs 1.67, que se registró para el grupo inoculado con BCG y de 1.33 para el grupo inoculado con CFPE. En las semanas subsecuentes y al final del experimento la proporción en este grupo disminuyó y se mantuvo abajo de la de los grupos vacunados. Mientras que, en el grupo inoculado con BCG se incrementó ligeramente a los 30 días en relación a su valor basal y sin ser mayor a la proporción del grupo inoculado con CFPE; en este último el aumento fue significativo en relación a su valor basal y al que se observó para los demás grupos en los días 30 y 60, con valores de 2.02 y 2.0 respectivamente. Al final del experimento la proporción fue similar entre grupos (Figura 2c).

En relación a las células γδ, los porcentajes iniciales fueron similares entre grupos, luego de la vacunación sólo fue evidente un incremento significativo a los 15 días en el grupo testigo, 20 % (P< 0.05); pero no para los grupos vacunados en ese periodo, ni en los subsecuentes muestreos, antes bien el porcentaje de estas células disminuyó para los grupos vacunados y testigo a través del tiempo (Figura 2d).

Evaluación de la expresión de CD25

La expresión de este marcador fue significativa en el grupo inoculado con CFPE a los 30 días con un valor promedio del 65 % (P<0.05) contra el 48 % que se registró al inicio. De igual modo, en el grupo inoculado con BCG se registraron incrementos a los 7 y 30 días, sin ser significativos. La expresión de CD25 en el grupo testigo fue similar e incluso mayor a la que se determinó para los grupos vacunados en las primeras cuatro semanas, en específico el valor más alto para éste se observó en la segunda semana. En el segundo y tercer mes evaluado la expresión de CD25 desciende para todos los grupos, (Figura 3a). Al hacer un análisis comparativo de la activación de células γδ, se observó que la relación CD25/γδ fue en ascenso en los grupos vacunados durante los primeros dos meses; respecto a ello, fue posible apreciar que en el grupo inoculado con el CFPE la relación fue mayor a los 30 días, con un valor de 5.6; mientras que para el grupo vacunado con BCG la relación más alta se observó a los 60 días con un valor de 5.9. En el grupo testigo la relación siempre estuvo por debajo de los grupos vacunados durante el periodo evaluado (Figura 3b).

DISCUSIÓN

En la evaluación de vacunas contra la TB la cuantificación y seguimiento de la producción de IFN–γ, por las células T específicas, ha sido un parámetro esencial que permite determinar parcialmente el establecimiento de la inmunidad protectora, de manera que el aumento de la eficacia de la vacuna está ligado al incremento de la producción específica de IFN–γ⁽¹²⁾. De acuerdo a ello, los resultados del presente estudio muestran una producción incrementada y moderada de IFN–γ en las becerras vacunadas con BCG o con el extracto proteico de M. bovis en función del tiempo; apreciándose los niveles más altos a los 30 días pos vacunación en el grupo inoculado con BCG, mientras que para el grupo inoculado con el CFPE la mayor producción se registró a los 60 días; indicando que la dosis baja de vacuna BCG empleada fue capaz de inducir más pronto un nivel apreciable de IFN–γ, que el CFPE en los grupos vacunados. En el grupo testigo la producción de la citocina fue significativa a los tres meses que procedieron a la vacunación en relación a los grupos vacunados, situación que se relaciona con la continua sensibilización de los animales a micobacterias ambientales o a las propias cepas de campo virulentas de M. bovis circulantes, considerando que el estudio se realizó bajo condiciones naturales, en una explotación en la que se había determinado una prevalencia del 5 % en nacencias y 35 % en vacas en producción.

Se ha comprobado que las becerras al nacer son inmuno–competententes y naturalmente sensibles a los antígenos de micobacterias ambientales, tal es el hecho que a las seis semanas los becerros alcanzan niveles de respuesta inmunitaria celular similares a la de los adultos^(20), indicando que a edad temprana los becerros se encuentran inmunológicamente aptos para establecer programas de inmunización, lo cual debe considerarse en el caso particular de las vacunas contra la tuberculosis bovina a fin de evitar la sensibilización por micobacterias ambientales y favorecer el desarrollo de una inmunidad protectora especifica^(21,22).

Estudios relacionados con el establecimiento de una respuesta protectora ante un desafío controlado en función de la dosis de vacuna BCG, muestran que dosis mayores a 6 x10⁶ UFC a pesar de que inducen una elevada producción de IFN–γ en becerras vacunadas, su capacidad de protección ante el desafío es menor que aquélla que se desarrolla en becerras vacunadas con una dosis baja⁽²³⁾. Estudios en modelo ratón muestran que dosis bajas inducen preferentemente una respuesta Th1 por el aumento significativo de las citocinas IL–2 e IFN–γ, mientras que dosi s altas favorecen el desarrollo de un respuesta Th2 debido a la producción de IL–4 e IL–10, respuesta que no ofrece resistencia ante el desafío micobacteriano⁽²⁴⁾. Referente a ello, en becerras se ha observado que la vacunación a dosis alta induce una respuesta mixta Th1/Th2, definida por la expresión de IFN–γ e IL–4. De igual modo se ha determinado que la aplicación repetida de la vacuna induce esta respuesta mixta, que ante el desafío micobacteriano no es protectora⁽²⁵⁾.

Se ha puesto en duda la participación de la inmunidad mediada por anticuerpos (IMA) en la protección contra la TB, debido a que la micobacteria es un patógeno intracelular que habitualmente tiene su nicho dentro del macrófago, donde los anticuerpos circulantes, se dice, son inaccesibles al microorganismo. Sin embargo, no se puede descartar su participación en la defensa contra la enfermedad, ya que estos facilitan la internalización y fagocitosis por opsonización; además, se ha señalado la internalización por los macrófagos vía receptores Fc que inducen la producción de intermediarios de oxígeno y favorecen la fusión fagosoma–lisosoma. Se ha observado en ratones deficientes de anticuerpos e infectados con M. tuberculosis un mayor número de UFC en sus bazos con respecto a ratones testigo sin déficit de anticuerpos mostrando el efecto protector de estos en el control de la enfermedad⁽²⁶⁾. En este estudio fue evidente que el CFPE además de promover una cantidad apreciable de IFN–γ, también indujo un incremento importante en los niveles de anticuerpos en los animales vacunados; resultados similares han sido informados por otros investigadores, quienes han evaluado la utilidad del CFPE como inmunógeno solo, o en combinación con la vacuna BCG en vaquillas. Cuando se emplea solo, como en este trabajo, ellos observaron una respuesta retardada en la producción de IFN–γ con niveles altos de anticuerpos, mientras que la combinación BCG–CFPE indujo una producción elevada de IFN–γ y un nivel bajo de anticuerpos⁽²⁷⁾.

Se considera que el papel protector de los anticuerpos dentro de los mecanismos de defensa frente a M. bovis, varía dependiendo de la etapa en que se encuentre el proceso infeccioso. Inicialmente cuando la micobacteria llega a la superficie de la mucosa, los anticuerpos actúan como elementos efectores, demostrando el valor de los mecanismos clásicos de neutralización y opsonización, lo que conllevaría a la activación eficiente de la célula fagocítica y probablemente a la eliminación de la bacteria. Suponiendo que la infección logra establecerse, los anticuerpos podrían tener importancia si tenemos en cuenta los nuevos conceptos de sus funciones: con un efecto regulador sobre la IMC, su interacción con este sistema y la habilidad de ellos para regular la respuesta de anticuerpos y generar anticuerpos antiidiotipos. La internalización del anticuerpo por medio del receptor Fc es esencial para el desarrollo de la inmunidad celular⁽²⁸⁾. La opsonización, además de aumentar la capacidad de presentación celular, la actividad lisosomal y la degradación intracelular del patógeno, también induce una rápida y elevada producción de IL–12, que estimula una respuesta inmune rápida y preferencial hacia Th1. La eficacia de los anticuerpos depende en algunos casos de una IMC intacta, pero la interdependencia y la redundancia entre estos sistemas es un hecho, por lo que los anticuerpos pueden potenciar la respuesta inmune celular, induciendo el mantenimiento de células de memoria en individuos infectados por M. tuberculosis o en su caso con M. bovis⁽²⁹⁾.

En ganado vacuno infectado experimentalmente con M. bovis la subpoblación de células TCD4 + parece dominar dentro de las principales células efectoras que proliferan en presencia de los antígenos micobacterianos, produciendo niveles altos de IFN–γ y TNF–α, citocinas responsables de la actividad microbicida de los macrófagos, por lo cual se dice que una respuesta inmune con estas características evocada por la vacunación, se correlaciona con la protección contra la tuberculosis^(6,30). En condiciones normales, el porcentaje de linfocitos CD4+ oscila entre 20 a 25 % en las primeras semanas de edad de las becerras. En el presente estudio el porcentaje de CD4 + en el grupo vacunad o con B CG se incrementó significativamente a los 15 días pos vacunales, y a los 60 días en el grupo vacunado con el CFPE, coincidiendo en tiempo con la mayor producción de IFN–γ observada para este grupo. Las actividades efectoras de la respuesta inmune celular incluyen no sólo la producción de citocinas, sino también la citolisis de células infectadas. La citotoxicidad para el control de patógenos, puede implicar la apoptosis vía interacción fas–ligando de Fas, o bien la lisis/ apoptosis de la célula infectada como resultado de la liberación directa de gránulos citotóxicos⁽¹⁶⁾. Por lo cual, el incremento en el porcentaje de las células CD8 + es un parámetro que permite determinar el establecimiento de inmunidad en los animales vacunados. Los resultados, en este caso, muestran un incremento significativo a los 15 días para el grupo vacunado con BCG, y a los 90 días para el vacunado con CFPE, señalando nuevamente un retardo en el establecimiento de una inmunidad celular para el último grupo referido.

Estudios de cambios poblacionales en vaquillas de más de seis meses de edad vacunadas con dosis altas de BCG (8x10⁶ UFC) muestran que l a población que se incrementa en las primeras semanas pos vacunación son las células, seguido de un aumento en la relación CD4/CD8 y declive de la proporción de las células a partir de la cuarta semana, observándose al final de la evaluación un decremento en la relación de esas poblaciones celulares⁽⁶⁾. En este estudio se observó en el grupo vacunado con BCG una disminución en el índice CD4/CD8 a los siete días pos vacunación, seguido de un ligero incremento en las semanas posteriores sin ser significativo, en tanto que en el grupo vacunado con el CFPE, la proporción fue mayor entre los 30 a 60 días, siendo el valor más alto determinado para el resto de los grupos; este incremento coincide con lo reportado en cuanto a tiempo de respuesta. No obstante, las diferencias entre lo reportado y nuestros resultados con la vacuna BCG pueden ser debidas a las altas dosis empleadas por otros autores (de 100 a 1000 veces mayores que las aplicadas a las becerras en este estudio); otra diferencia a considerar es la edad en la que se vacunaron las becerras, puesto que se ha observado que a mayor edad se favorece la sensibilización del sistema inmune por micobacterias ambientales y patógenas existentes en los hatos, influyendo grandemente en el balance de las diferentes subpoblaciones linfocíticas, por la constante exposición del sistema inmune de las becerras⁽²⁵⁾; para evitar el efecto señalado, las becerras se vacunaron entre las dos y cuatro semanas de edad en este estudio, a fin de favorecer el desarrollo de una respuesta inmune especifica.

El marcador de superficie CD25 es el receptor de IL–2 es una molécula involucrada con la activación y función reguladora de los linfocitos, así como en la división y proliferación de las células T de memoria. E n los bovinos las diferentes subpoblaciones de células T son reguladas por CD25 en respuesta al estímulo de antígenos de la micobacteria⁽³¹⁾. En el experimento, la expresión de IL–2R al inicio y a través del tiempo fueron elevados, observándose sólo diferencia significativa en el grupo inoculado con CFPE a los 30 días pos vacunación. En bovinos sanos se ha mostrado que existe un nivel relativamente alto de expresión de CD25 en células T sin estimular⁽⁹⁾, lo cual explica de alguna manera los valores observados al inicio del experimento en los diferentes grupos, y en el grupo sin vacunar durante el desarrollo de éste. Un mayor grado de activación de las células γδ se observó en los grupos vacunados, pese a que no hubo una proliferación significativa de estas células, a excepción de la observada en el día 15 para el grupo vacunado con el CFPE; a este respecto se ha informado que la activación y expresión de CD25 en estas células puede ser consecuencia del efecto directo de la IL–2 secretada por las células CD4 + luego del estimulo antigénico, sin que se inicie su proliferación⁽³⁰⁾. A diferencia de lo que encontramos, otros estudios muestran fuerte grado de activación de las células γδ tras la vacunación de becerras con dosis altas de BCG, conjuntamente con un nivel alto de IFN–γ⁽⁶⁾, lo cual indicaría el establecimiento de una sólida respuesta inmune hacia M. bovis; sin embargo hasta ahora los estudios de vacunación con dosis altas de BCG han mostrado bajo nivel protector ante desafíos experimentales⁽³²⁾.

Las células T γδ sirven de enlace entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa⁽⁷⁾. Reconocen una gran variedad de antígenos así como pequeñas moléculas de fosfato orgánico y proteínas de antígenos sin procesar, que son presentados a través del MHC por lo que su eficiencia, a este respecto, es mejor que los linfocitos T CD4 + y CD8 + ^(7,8). Hasta ahora, no existe una fórmula única, que señale cuáles son los mejores biomarcadores a considerar en el establecimiento de una inmunidad protectora inducida por vacunación contra la tuberculosis bovina; lo que sí está ampliamente documentado es la influencia que tiene la sensibilización del sistema inmune del hospedero por micobacterias ambientales y la edad de vacunación para conseguir una inmunidad duradera y especifica contra M bovis, por lo cual en el estudio se consideró la aplicación de las vacunas a edad temprana con resultados satisfactorios.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

Los resultados indican que la aplicación de la vacuna BCG a una dosis baja, así como el empleo del CFPE de M. bovis como inmunógeno, en becerras recién mantenidas durante el estudio en un hato lechero de alta prevalencia, promovieron la proliferación y activación de linfocitos T CD4 + y CD8 +, con un nivel moderado en la producción de IFN–g, los cuales son indicadores del desarrollo de una buena inmunidad contra Mycobacterium bovis.

AGRADECIMIENTOS

A la Productora Nacional de Biológicos Veterinarios (PRONABIVE), por la donación de los sobrenadantes de cultivo de M. bovis AN5. Así también por la asesoría incondicional al Dr. Chiharu Murata por el valioso apoyo en el análisis estadístico.

LITERATURA CITADA

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