Uso de residuos lignocelulósicos para optimizar la producción de inóculo y la formación de carpóforos del hongo comestible Lentinula boryana*

Use of lignocellulosic residues to optimize spawn production and carpophore formation of the edible mushroom Lentinula boryana

Rigoberto Gaitán-Hernández^1§ y Dulce Salmones¹

¹ Red Manejo Biotecnológico de Recursos-Instituto de Ecología, A. C. Carretera antigua a Coatepec 351, Xalapa, 91070, Veracruz, México. Tel: 01 (228) 8 42 18 30. (dulce.salmones@inecol.mx). §Autor para correspondencia: rigoberto.gaitan@inecol.mx.

* Recibido: febrero de 2015
Aceptado: junio de 2015

Resumen

Se evaluaron diferentes residuos lignocelulósicos para la producción de inóculo y carpóforos de Lentinula boryana. El crecimiento micelial y biomasa asociada a la actividad metabólica (AM) se estimaron a los 12 y 19 d de incubación, con 12 cepas en tres tipos de inóculo: fórmula 1 (F1), fórmula 2 (F2) y fórmula 3 (F3). El diámetro del micelio en caja Petri a los 12 y 19 d fue mayor en F1, con 61.9 a 74.8 mm y de 71.8 a 90 mm, respectivamente. La mayor AM a los 12 d de incubación se presentó en F1, fluctuando de 10.1 a 46.76 μMol FDA min^-1g^-1 y a los 19 d en F1 y F2, con 6.15 hasta 36.26 μMol FDA min^-1g^-1, para ambos tipos de inóculo. Con el objetivo de identificar residuos con potencial para la fructificación de esta especie, se estimó la tasa de crecimiento (Kr) in vitro en paja de cebada (P), paja-madera de vid (PV), paja-bagazo de caña (PC), paja-viruta de encino (PE) y paja-viruta de madera de teca (PT). En PE se observó la mayor Kr promedio (2.64 mm d¹) y la menor en PT (1.08 mm d^-1). En la producción de carpóforos, los parámetros de eficiencia biológica (EB), tasa de producción (TP) y rendimiento (R) fueron significativamente afectados por la cepa, sustrato y sus interacciones. La mezcla PV presentó la mayor EB (12.92%), TP (0.125%) y R (3.642%).

Palabras clave: materiales lignocelulósicos alternativos, producción de hongos, shiitake americano.

Abstract

Lignocellulosic wastes were evaluated for the production of spawn and carpophores of Lentinula boryana. Radial extension growth and biomass associated with the metabolic activity (MA) was estimated after 12 and 19 d of incubation with twelve strains and three types of spawn: Formula 1 (F1), Formula 2 (F2) and Formula 3 (F3). Mycelial diameter in Petri dishes at days 12 and 19 was greater in F1 formula. Colony diameters measured 61.9 to 74.8 mm and 71.8 to 90 mm, respectively. The highest MA values at 12 d of incubation were presented in F1, ranging from 10.1 to 46.76 μMol FDA min^-1g^-1 and at 19 d in F1 and F2, with 6.15 to 36.26 μMol FDA min^-1g^-1, for both types of spawn. In order to identify residues with potential for the fructification of this specie, the growth rate (Kr) in vitro was estimated on barley straw (S), straw-vineyard pruning (SV), straw-sugar cane bagasse (SC), straw-oak shavings (SO) and straw-teak shavings (ST). The highest mean Kr was observed in SO (2.64 mm d¹) and the lowest in ST (1.08 mm d^-1). In the carpophore formation the parameters of biological efficiency (BE), production rate (PR) and yield (Y) were significantly affected by strain, substrate and their interactions. The substrate SV presented the highest BE (12.92%), PR (0.125%) and Y (3.642%) values.

Introducción

En el país existen abundantes recursos genéticos de hongos comestibles y medicinales, por lo que se debe fortalecer su conservación, estudio y utilización (Gaitán-Hernández, 2012), tan solo en México se ha registrado el consumo de alrededor de 300 especies de hongos comestibles (Garibay-Orijel et al, 2010).Algunas de estas especies tienen un gran potencial para la producción comercial, tal es el caso de Lentinula boryana (Berk. & Mont.) Pegler (Gaitán-Hernández, 2012), el cual se distribuye en las regiones tropicales y subtropicales del continente americano, confinada al neotrópico (Guzmán et al., 1997; Capelari et al, 2010). Diversas comunidades indígenas y campesinas la consumen y comercializan en mercados populares (Garibay-Orijel et al, 2010).

Por las similitudes morfológicas entre Lentinula boryana y L. edodes, han motivado una serie de estudios (Mata y Guzmán, 1993; Soto-Velazco et al, 1995; Mata et al, 1997; Hermann et al, 2013). Así también, con base en diversos estudios de entrecruzamiento genético, aloenzimas y filogenéticos, se ha reconocido que L. boryana y L. edodes son especies distintas (Thon y Royse, 1999).

En México se ha puesto especial énfasis en realizar ensayos sobre su cultivo, utilizando diferentes residuos (Mata y Gaitán-Hernández, 1992; Mata et al., 2000; Gaitán-Hernández, 2001; Mata et al, 2001; Salmones y Gutiérrez-Lecuona, 2008). Los residuos de paja son ampliamente utilizados para el cultivo de A. bisporus y Pleurotus spp., pero la paja de cebada evaluada aquí, prácticamente no ha sido usada como sustrato para L. boryana. Así también, dado el vasto potencial genético de germoplasma silvestre, en el presente estudio se planteó evaluar diferentes residuos lignocelulósicos de bajo costo, con el propósito de optimizar la producción de inóculo y formación de carpóforos de cepas mexicanas de L. boryana y con ello contribuir a diversificar la producción de hongos comestibles silvestres.

Materiales y métodos

Cepas y condiciones de crecimiento

Las doce cepas de Lentinula boryana evaluadas en este estudio fueron las siguientes: IE-17, IE-93, IE 152, IE 154,IE 232,IE 233,IE 250,IE 268,IE 270,IE 271,IE 721 y IE-735. Las cepas IE-232 e IE-233 se obtuvieron por entrecruzamiento de la IE-93 e IE-154, respectivamente. Las cepas restantes se aislaron de ejemplares silvestres que crecían en troncos de madera de encino (Quercus sp.). Las cepas se encuentran almacenadas en el Cepario de Hongos del Instituto de Ecología, A. C. (INECOL, Xalapa, México) (World Data Centre for Microoiganisms). Todas las cepas se mantuvieron en extracto de malta agar (BIOXON, EUA) a 25 °C.

Determinación del crecimiento micelial radial y actividad metabólica

Preparación del sustrato y formulaciones de inóculo. Se obtuvo pulpa de café de un beneficio de café cercano al INECOL. La pulpa fresca se secó con aire, hasta que alcanzó 20% de humedad, posteriormente se almacenó hasta su uso. La paja de cebada y el mijo (Panicum miliaceum L.) fueron adquiridos de un centro forrajero local. La pulpa de café (Coffea arabica L.), paja de cebada (Hordeum vulgare L.) y peat moss (Sphagnum sp.) se pulverizaron con un molino doméstico. Para la preparación del inóculo, los granos de mijo se hidrataron hasta un contenido de humedad del 55%, posteriormente se mezclaron con el resto de los ingredientes, de acuerdo a cada formulación. Se midió el pH de cada condición con un potenciómetro digital (Orion, modelo 230A, EUA). Los ingredientes de cada formulación de inóculo fueron como sigue : F1 mijo (88.5%), paja de cebada (8.8%), peat moss (1.3%) y CaSO4 (1.3%); F2 mijo (88.5%), pulpa de café (8.8%), peat moss (1.3%) y CaSO4 (1.3%); F3 (testigo) mijo (100%). La mezcla de ingredientes se embolsó y se esterilizó durante 90 min a 121 °C. Cuando el sustrato se enfrió, de cada formulación se colocaron 20 g en cajas Petri y se inocularon con implante de micelio crecido en PDA. Las muestras se incubaron a 25 °C en oscuridad.

Determinación de la extensión radial de crecimiento. El crecimiento micelial de las doce cepas y tres formulaciones de inóculo se midió a los 12 y 19 d de incubación. La estimación del crecimiento se realizó con base en la medición sobre dos líneas (Plano Cartesiano) trazadas en la tapa de la caja. Cada condición se evaluó por quintuplicado.

Estimación de la actividad metabólica. La biomasa fúngica asociada a la actividad metabólica micelial (AM) para las diferentes formulaciones de inóculo se determinó en muestras frescas, con la técnica de hidrólisis del diacetato de fluoresceína (FDA, Sigma Chemical Col. / por sus siglas en inglés) (Inbar et al, 1991; modificado por Mata et al, 2002). El experimento se llevó a cabo con 1 g de muestra por cepa, por sustrato y por periodo de incubación, en tubos de vidrio estériles. Para iniciar la reacción, 3 mL of FDA (10 mg L^-1) se añadieron a la muestra, posteriormente los tubos se agitaron manualmente y se colocaron en baño maría por 30 min a 30 °C. Al término, la reacción se detuvo al añadir 10 mL de acetona. Esta suspensión se filtró (Whatman No. 1) y la cantidad de FDA hidrolizado contenido en la solución se detectó con un espectrofotómetro a 490 nm (Spectronic Genesys 5). Una unidad de AM se definió como el equivalente de 1 μMol de FDA hidrolizado min^-1 g^-1 (peso seco) para cada formulación dada. Los resultados fueron los promedios de tres réplicas.

Tasa de crecimiento micelial en paja de cebada suplementada y formación de carpóforos

Estimación de la tasa de crecimiento. Se utilizó inóculo F1 seleccionado del ensayo anterior y se preparó como se ha citado previamente, colocando 50 g de la mezcla de ingredientes en frascos de vidrio de boca ancha de 100 mL. El sustrato se esterilizó durante 90 min a 121 °C y en condiciones de asepsia se inocularon con micelio de cada cepa de 15 d de crecimiento en PDA. La tasa de inoculación fue de 5%, con base al peso fresco, posteriormente se incubaron en oscuridad a 25 °C. Una vez preparado el inóculo, para estimar la tasa de crecimiento, se usaron cinco combinaciones de sustrato, con paja de cebada como sustrato base.

La paja se fragmentó a un tamaño de partícula de 0.5 a 1 cm. Los suplementos utilizados fueron polvos de madera de encino (Quercus sp.), de madera de vid (Vitis vinifera L.), de madera de teca (Tectona grandis Linn F.) y bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.). Inicialmente, los suplementos se hidrataron por separado durante 12 h por inmersión en agua. Después de eliminar el exceso de humedad a todos los ingredientes, cada suplemento se mezcló de manera homogénea con la paja y se les agregó CaSO₄ (0.25%) y Ca(OH)₂ (0.25%), haciendo un total de cinco sustratos: paja-encino (PE), paja-vid (PV), paja-teca (PT), paja-caña (PC) y paja (P) como testigo. Se tomaron muestras de los sustratos para determinar el pH y humedad inicial. Posteriormente, se colocaron 25 g húmedos de cada sustrato en tubos de vidrio (25 x 150 mm).

Se prepararon siete tubos por cada condición, haciendo un total de 175 muestras. Los tubos se esterilizaron durante 90 min a 121 °C. A cada tubo se le colocó 1.5 g de inóculo previamente preparado (F1) y se taparon con algodón estéril para permitir el intercambio gaseoso. Finalmente, los tubos se incubaron en oscuridad a 25 °C. La tasa de crecimiento (Kr) se calculó con la función de crecimiento lineal y= kr x + c (donde y es la distancia, x es el tiempo y c el factor constante) y se expresó en milímetros por día (mm d^-1). Para ello, en cada tubo se trazaron dos líneas longitudinales opuestas, A y B. Sobre las líneas se midió el crecimiento del micelio cada día durante 15 d. Con los datos obtenidos, se estimó el crecimiento del micelio promedio por día.

Las bolsas con sustrato se esterilizaron durante 90 min a 121 °C. Bajo condiciones de asepsia, a cada bolsa se le colocó 180 g (10%) de inóculo de cada una de las cepas. Se prepararon cinco muestras por cada condición (= 50 muestras). Las bolsas se incubaron en oscuridad a 25°C. Cuando el micelio de las cepas de Lentinula cubrieron completamente el sustrato, las muestras se transfirieron al cuarto de producción, con condiciones favorables para fructificación, donde se les retiró la bolsa de polipropileno. La temperatura ambiental se mantuvo a 16-19 °C, con una humedad relativa de 85 a 90%. Se aplicó recirculación de aire para mantener una distribución uniforme del mismo y niveles bajos de CO₂ (< 500 ppm). Se mantuvo un fotoperiodo de 12 h con 350 lux de iluminación con lámparas durante el día. La producción se evaluó con base en los datos de eficiencia biológica (EB), tasa de producción (TP) y rendimiento (R). También se registró el periodo de producción (PP) y número de cosechas. De igual manera, se evaluó el tamaño de las fructificaciones obtenidas, de acuerdo al diámetro del píleo: grupo 1 (G1) < 5 cm, grupo 2 (G2) 5-9.9 cm y grupo 3 (G3) >10 cm, como lo citado en Gaitán-Hernández et al. (2006).

Diseño experimental y análisis estadístico

A los valores de diámetro de crecimiento micelial, actividad metabólica y tasa de crecimiento se les aplicó un diseño factorial completamente aleatorizado. El análisis factorial también se aplicó a los valores de producción. Un análisis de varianza se aplicó a todos los valores, además de una comparación de medias de acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Tukey (p< 0.05), utilizando el paquete estadístico Statistica V7.0.

Resultados

Determinación del crecimiento micelial radial. El crecimiento micelial de las cepas a los 12 y 19 d de incubación se muestra en el Cuadro 1. Los diámetros desarrollados por las cepas en el inóculo suplementado con paja de cebada (F1) midieron entre 61.9 (IE-735) a 74.8 mm (IE-152); en F2 entre 54.5 (IE-721) a 75.5 mm (IE-93) y para la F3 de 23.1 (IE-233) a 64.2 mm (IE-93). A los 19 d de incubación, los diámetros miceliales de las cepas variaron de 71.8 (IE-154 e IE-232) a 90 mm (IE-93). Ésta última cepa fue la única en lograr cubrir el diámetro total de las cajas Petri. En la formulación con pulpa de café (F2), los diámetros fluctuaron entre 64.5 (IE-152) a 87.2 mm (IE-93), mientras que la formulación con mijo (F3), los valores promedio fueron de 32.1 (IE-233) a 81.1 mm (IE-93). El análisis estadístico aplicado a los promedios de las formulaciones a los 12 d de incubación determinó diferencias significativas entre las formulaciones, correspondiendo a F1 los valores más altos, mientras que a los 19 d no se observaron diferencias significativas (p > 0.05) entre los promedios de las formulaciones suplementadas con paja y pulpa de café, pero éstas si presentaron diferencias con la formulación testigo. En general, las cepas tuvieron mayor crecimiento micelial en F1 y F2, que en el testigo.

Actividad metabólica. La AM de los micelios en las diferentes formulaciones evaluadas se observan en el Cuadro 2. A los 12 d de incubación, las cepas provenientes del inóculo preparado con paja de cebada (F1) presentaron una AM de 10 (IE-154) hasta 46.8 μMol FDA min^-1g^-1 (IE-93), correspondiendo a las cepas IE-93, IE-232, IE-735 e IE-233 los valores más altos, mientras que la IE-154, IE-250 e IE-17 tuvieron los más bajas actividades. A los 19 d de incubación, las cepas presentaron un comportamiento variable, ya que mientras para la cepa IE-154 el valor de AM fue similar a la medición anterior, en siete cepas disminuyó y en las cuatro restantes aumentó la AM. Los valores promedios alcanzados en esta formulación fluctuaron entre 9 (IE-268) hasta 39.4 (IE-735) μMol FDA min^-1g^-1.

En la formulación preparada con pulpa de café (F2), los valores promedio de AM fluctuaron entre 6.4 (IE-250) a 56.9 (IE-93) (Mol FDA min^-1g^-1 a los 12 d de incubación; y de 5.5 (IE-250) a 33.8 (IE-17) μMol FDA min^-1g^-1 a los 19 d. Las cepas que presentaron mayor AM a los 12 d fueron la IE-93 e IE-17. A igual que los resultados mostrados en F1, el comportamiento de los micelios desarrollados en pulpa de café fue variable a los 19 d de incubación, ya que mientras para las cepas IE-17, IE-93, IE-154 e IE-268 las AM fueron menores respecto a la medición anterior, las cepas IE-152, IE-232 e IE-271 presentaron mayor AM a los 19 d y en las cepas restantes los valores fueron similares entre los días detectados. En la formulación testigo (F3), la AM cuantificada a los 12 d fueron de 6.9 (IE-250) a 18.9 (IE-93) μMol FDA min^-1g^-1, y de 6.2 (IE-250) a 36.3 (IE-233) μMol FDA min^-1g^-1 a los 19 d de incubación. Con excepción de las cepas IE-93, IE-154 e IE-250, el resto mantuvo o incrementó su AM a los 19 d, contrariamente a lo observado en las otras formulaciones.

Se observó una disminución del pH en todos los sustratos conforme transcurrió el tiempo de crecimiento. El valor inicial varió de 5.35 (PE) a 6.18 (PT), con un pH final promedio de 2.9 a 3.28, respectivamente, por efecto del crecimiento de las cepas. La cepa IE-232 favoreció una mayor disminución del pH del sustrato, con un valor final de 2.1, mientras que la IE-735 fue la que ejerció menor efecto en la disminución del pH, presentando un valor final de 3.3. Por otra parte, en general, los sustratos manifestaron una pérdida de 0.7 a 3.3% de humedad del valor final respecto al inicial.

Formación de carpóforos. Todas las cepas fructificaron en PE y PV, excepto la IE-93 cuya producción de hongos fue mínima por lo que no se consideró en el análisis de la producción. Las cepas IE-232 e IE-735 formaron fructificaciones de tamaño G1 y G2 en ambos sustratos, solo que la IE-735 logró hongos G3 en PV, una característica importante a destacar para esta cepa. Las cepas produjeron principalmente hongos del G1 en PV, excepto la IE-735 donde el G2 fue el mayoritario. En el promedio general, el sustrato PE produjo más hongos del G2, mientras que PV produjo más G1 (Cuadro 4). La producción de hongos se distribuyó en dos cosechas, excepto para las cepas híbridas IE-232 e IE-233 que produjeron sólo una cosecha en PE.

Con respecto a los días de incubación, la cepa IE-232 tuvo una formación temprana de primordios en ambos sustratos, a 66 (PE) y 70 d (PV), pero no todos lograron alcanzar su etapa adulta, lo que podría indicar que las condiciones ambientales que se establecieron durante este periodo no le fueron favorables. La cepa IE-233 requirió de 72 y 74 d para la formación de primordios y la IE-735 de 80 y 76 d en PE y PV, respectivamente (Cuadro 5).

La EB, TP y R fueron significativamente afectados por la cepa (F= 94.17, 90.33, 94.17, respectivamente), el sustrato (F= 29.50, 51.07, 29.50, respectivamente) y sus interacciones (F= 19.82, 34.84, 19.82, respectivamente). Los valores promedio de EB, TP y R, indican que la cepa IE-735 fue estadísticamente mejor a las otras cepas (p< 0.05) y presentó en PV los mejores resultados de EB (12.92%), TP (0.125%) y R (3.642%), en tanto que en PE se observaron valores de 5.96%, 0.041% y 1.682%, respectivamente. La cepa híbrida IE-232 fue estadísticamente similar en los valores de TP y R (p> 0.05) en PE y PV, mientras que la cepa IE-233 produjo los valores más altos de EB y R en PE, aunque la TP fue similar (p> 0.05) en ambos sustratos. En el promedio general, el sustrato PV fue significativamente mejor que el sustrato PE (p< 0.05) (Figura 1).

Discusión

Se ha demostrado que la aplicación de suplementos en la preparación del inóculo de shiitake puede incrementar su vigorosidad y mejorar su resistencia ante la presencia de mohos antagonistas (Mata et al., 2002). No existen estudios previos de suplementación de inóculo para L. boryana, pero debido a que ambos hongos crecen de manera natural en madera en descomposición de encino y que además, la fructificación de la especie americana se ha logrado con técnicas y sustratos utilizados para L. edodes, se podría esperar un comportamiento similar entre ambas especies a nivel micelial. Los resultados de esta etapa mostraron que la adición de paja de trigo o pulpa de café a las semillas de mijo incrementan el crecimiento micelial y la producción de biomasa en las cepas de L. boryana, debido probablemente a la presencia de elementos químicos que favorecen una mayor actividad enzimática del hongo.

De acuerdo a Beltrán García et al. (2001), los compuestos flavonoides y fenólicos presentes en cultivos líquidos de L. edodes podrían ser los responsables del incremento en la producción de biomasa. Sin embargo, cuando se cultiva un hongo en un sustrato de composición química compleja como es la pulpa de café, el organismo requiere primeramente detoxificar el medio a través de la secreción de enzimas que degraden los compuestos inhibitorios del desarrollo micelial y posteriormente, incrementar su biomasa; esto podría explicar porque las cepas de L. boryana evaluadas presentaron mayor biomasa en paja de trigo que en la pulpa de café, comportamiento previamente observado en cultivos de Pleurotus spp. (Salmones et al., 2005).

Con base a la experimentación in vitro, tanto el sustrato como la cepa utilizados son variables que influyen en los resultados de la Kr de L. boryana. También se observó, que la adición de madera de encino, madera de vid o bagazo de caña a la paja de cebada (1:1) estimuló el crecimiento de L. boryana, mientras que la adición de madera de teca (1:1) no lo incrementó.

Sobre la producción de L. boryana en paja de cebada y madera de vid, no existe referencia previa; no obstante, los mejores valores de EB en este estudio, fueron los de la cepa IE-735 en PV (12.92%). Estos valores no superan los reportados por Gaitán-Hernández (2001) quién probó el bagazo de caña y una mezcla de este sustrato con viruta de Pinus spp. (EB= 36.82%) y de P. montezumae (EB= 25.45%) para la fructificación de esta especie, ni los reportados por Salmones y Gutiérrez Lecuona (2008) (EB= 15.02%).

En este estudio, el mejor sustrato para la producción de L. boryana fue la combinación PV; la madera de vid ha resultado ser un sustrato excelente para la fructificación de Lentinula edodes (Gaitán-Hernández et al, 2006), es probable que la combinación de la composición química del mismo y la adición de salvado de trigo, influyeron considerablemente en la estructura física y disponibilidad de nutrientes necesarios para el desarrollo de la especie aquí estudiada.

Conclusión

La suplementación del inóculo de L. boryana con paja de cebada favoreció el incremento en la actividad metabólica y el crecimiento radial micelial in vitro de las cepas. La suplementación con la pulpa de café favoreció una mayor actividad pero no tuvo efecto sobre un mayor crecimiento micelial, debido probablemente a la presencia de compuestos químicos (polifenoles, cafeína y ácido cafeíco) presente de manera natural en este sustrato, que pudieron haber interferido con el desarrollo micelial. En general, los mayores valores de crecimiento correspondieron al inóculo suplementado con paja de cebada. La evaluación de Kr y la formación de carpóforos reveló que el sustrato y la cepa utilizados tuvieron una influencia en el crecimiento y producción de hongos de esta especie.

La adición de viruta de madera de encino, madera de la poda de vid o de bagazo de caña de azúcar a la paja de cebada, favoreció el crecimiento del micelio, mientras la adición de viruta de la madera de teca fue perjudicial. Las combinaciones de los sustratos PE y PV representan residuos lignocelulósicos potenciales para la formación de carpóforos de L. boryana.

Este estudio es una contribución a la optimización del proceso de cultivo de una especie comestible susceptible de ser comercializada, la cual es consumida regionalmente y representa un recurso genético importante para a la diversificación de germoplasma de interés comercial. Sin embargo, se requieren de más estudios para caracterizar cepas, determinar su capacidad para biodelignificar el sustrato y para seleccionar otras características adecuadas para su producción en sustratos alternativos. De igual manera, el trabajo aporta información relevante en el potencial uso de residuos lignocelulósicos, para la producción del inóculo y la formación de carpóforos del "shiitake americano" Lentinula boryana.

Agradecimientos

Literatura citada

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