Potencial Alelopático de extractos foliares de Astragalus mollissimus Torr. sobre la germinación in vitro de semillas de maleza*

Allelopathic potential of leaf extracts from Astragalus mollissimus Torr. on in vitro germination of weed seeds

María Antonia Flores Córdova^1§, Esteban Sánchez Chávez¹ y Ramona Pérez Leal²

¹ Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. Unidad Delicias, Av. Cuarta Sur Núm. 3820, Fraccionamiento Vencedores del Desierto Delicias Chihuahua, México. C. P. 33089. Teléfono: 52 639 474-8704. (esteban@ciad.mx).

* Recibido: septiembre de 2014
Aceptado: enero de 2015

Resumen

Astragalus mollissimus Torr. es una de las plantas tóxicas más importantes en los pastizales del desierto chihuahuense, tóxica para el ganado que la consume, debido a la presencia de metabolitos secundarios alcaloidales tales como swansinoina; sin embargo, no se tiene conocimiento de la existencia de trabajos anteriores sobre su efecto alelopático. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad alelopática en semillas de Lactuca vitrosa, Sorghum halepense, Lolium multiflorum, Arundo donax y Medicago sativa, las pruebas se realizaron con diferentes concentraciones 1,1.5, 2, 2.5, 3 y 3.5 % (v/v) de extractos acuosos de, diclorometano, acetona y metanol, obtenido de la flor, mediante la evaluación del efecto de los mismos sobre la germinación total (Gt) y velocidad de germinación acumulada (VGA). Se demostró que los extractos orgánicos fueron más fitotóxicos que el extracto acuoso, en la inhibición de la germinación de las semillas de, Carrizo y Jhonson. Por lo tanto, los extractos ensayados de A. mollisimus permitieron detectar la actividad alelopática para su posible desarrollo como herbicida natural.

Palabras clave: Carrizo, Jhonson, Raygrass, alfalfa, hierba loca, lechuga.

Abstract

Keywords: Reed, Johnson, Raygrass, alfalfa, locoweed, lettuce.

Introducción

La agricultura moderna depende de una alta utilización de insumos. Esta dependencia ha llevado a una excesiva utilización de fertilizantes, plaguicidas, fungicidas y herbicidas, que a largo plazo generan un impacto ambiental negativo (Oliva y Peña, 2004). Entre los insumos más utilizados se encuentran los herbicidas, que representan aproximadamente 43% del total de las ventas de plaguicidas a nivel mundial (Kogan y Pérez, 2003). El uso constante de herbicidas puede alterar el medio ambiente, la biodiversidad del suelo, la salud humana provocando intoxicaciones agudas, crónicas y malformaciones genéticas (Oliva y Peña, 2004).

Una alternativa natural y acorde con el medio ambiente a este tipo de insumos agrícolas, es la alelopatía. El fenómeno de la alelopatía, es definido, como el proceso por el cual una planta desprende al medio ambiente (Pazmiño, 1999, Larrea-Alcazar, 2003), una cantidad apreciable de compuestos biológicamente activos y algunos de ellos actúan como inhibidores o estimuladores de la germinación de las semillas las cuales afectan o benefician el crecimiento de las plantas (Isaza et al., 2007). Entre las sustancias con actividad alelopática se encuentran ácidos fenólicos, flavonoides, terpenoides, alcaloides y quinonas, los cuales están prácticamente en todos los tejidos vegetales y semillas de la planta (Rodríguez et al, 2002; Rabotnikof et al, 2005; Blanco et al, 2007).

Las plantas sintetizan diferentes metabolitos semejantes a la acción de los químicos sintéticos con la ventaja de ser biodegradables, un ejemplo de esto son los aleloquímicos, productos que por su naturaleza orgánica, se consideran saludables para el consumidor y el medio ambiente (Rizvi y Rizvi, 1992). La mayoría de estos agentes alelopáticos o aleloquímicos son sintetizados por las plantas, derivados de las rutas del acetato-mevalonato o del ácido shikímico (Piñol et al, 2008).

Los metabolitos secundarios con efecto alelopático se han convertido en una fuente de nuevos herbicidas con novedosas estructuras y mecanismos de acción (Gliessman, 2002), por consiguiente la búsqueda y desarrollo de nuevos agroquímicos ha puesto especial atención al fenómeno de la alelopatía y a los metabolitos secundarios involucrados en este fenómeno (Ávila et al, 2007) con el fin de preservar el medio ambiente y contribuir a una agricultura sustentable (Cabral et al, 2008).

Por lo tanto, se ha promovido el uso de compuestos alelopáticos en semillas germinadas, plántulas en desarrollo o en campo, como los estudios sobre flores de girasol donde sugieren alcaloides chalconas y flavonoides como agentes alelopáticos, entre estos se encuentran kulkulkanin que afecta germinación y tambulinque que afecta principalmente crecimiento en plántulas (Isaza et al, 2007). Los fenólicos estimulan a la AIA-oxidasa destruyendo a la hormona fundamental ácido indolacético (AIA) o auxina, en tanto que los terpénicos interfieren con las enzimas respiratorias con el grupo SH como se ha comprobado para la juglona.

En años recientes se ha informado de la acción inhibitoria de la isoalantolactona de Imula sp., sobre el quelite (Amaranthus) y el chual (Chenopodium) y del extracto acuoso de Ambrosia artemisifolia sobre el quelite y otras dicotiledóneas. También son inhibitorios los extractos acuosos del zacate Bermuda (Cynodon dactylon) y del zacate Jhonson (Sorghum halepense), que afectan el desarrollo radicular, peso seco de la plántula y respiración en semillas de frijol, trigo, avena y sorgo (Rojas y Gámez, 2002).

La gran diversidad de plantas alelopáticas justifica la necesidad de investigar otras especies que nunca han sido estudiados, como Astragalus mollissimus Torr., planta perene, leguminosa nativa de los pastizales medianos del norte de México, relativamente libre de enfermedades, plagas y malas hierbas, conocida como hierba loca, chinchines o sonadora (Ezedowski y Rzedoeski, 2001) de naturaleza tóxica asociada a la presencia de un alcaloide indolizolidizinico denominado swainsonina, que es un potente inhibidor de las enzimas alfa-golgi lisosomal a-mannosidasa y mannosidasa II (Pfister et al., 2007), el cual genera toxicidad para el ganado, ovejas, cabras y caballos en particular que la consumen (Zeinsteger et al., 2003), el alcaloide está presente en todas las partes de la planta (knight y Walter, 2003) y es tóxica durante cualquier etapa de crecimiento, incluso cuando se seca (Wolfe y Lance 1984).

Las propiedades fitotóxicas han sido detectadas en numerosos tipos de alcaloides; pero los mecanismos que justifican la actividad alelopática aún no han sido estudiados. Sin embargo, los alcaloides son compuestos que afectan e inhiben la actividad del ADN y ARN, de algunas enzimas, la biosíntesis de proteínas y la permeabilidad de las membranas, perturbando su estabilidad (Wink y Latz, 1995). Asimismo, los alcaloides son uno de los más diversos grupos de metabolitos secundarios. Se producen por una gran variedad de organismos, incluyendo bacterias, hongos, plantas y animales. Los alcaloides son tóxicos en la naturaleza y ayudan a las plantas, para protegerse de sus enemigos o competidores y facilitar su propia supervivencia en los ecosistemas. En las plantas, los alcaloides funcionan como compuestos alelopáticos, y esta propiedad hace que algunas de las plantas posean un potencial herbicida natural (Goyal, 2013) por lo cual A. mollisimus pudiera ser considerada con efecto alelopático (Figura 1).

Sin embargo no existe información sobre el efecto que tiene la planta o sus partes, que provoquen una fitotoxicidad, convirtiéndose en una planta interesante de investigación como agente alelopático (Saucedo, 2008).

Con base en lo anterior, y con el fin de proporcionar antecedentes alelopáticos de A. mollisimus, el objetivo de esta investigación consistió en evaluar la actividad alelopática de tres extractos de diferente polaridad acetona, diclorometano y metanol, obtenidos de la flor de la especie de A. mollissimus Torr., en semillas de lechuga silvestre (Lactuca vitrosa), zacate Raygrass (Lolium multiflorum) zacate Jhonson (Sorghum halepense) zacate Carrizo (Arundo donax) y alfafa (Medicago sativa).

Materiales y métodos

Recolecta del material vegetal

Preparación del material vegetal

El material vegetal colectado se lavó con agua a chorro y se secó a temperatura ambiente sobre papel estraza, para que absorbiera la humedad y se removió cada 24 h, para evitar la formación de hongos. Posteriormente se secó el órgano flor en una estufa marca Felisa durante cinco días a una temperatura de 45 °C para eliminar toda la humedad y se molió en un molino eléctrico Willey modelo 4, hasta convertirlo en polvo fino.

Preparación de los extractos

Se llevó a cabo mediante la metodología establecida por Pérez-Leal et al. (2005), para la preparación de los extractos orgánicos se realizó la maceración de la flor con tres materiales de extracción como solventes, acetona, diclorometano y metanol de diferente polaridad, durante ocho días a temperatura ambiente. Las disoluciones se filtraron con papel filtro Wattman, con el fin de separar el extracto del material vegetal restante. Los extractos crudos se obtuvieron concentrando a presión reducida en un rotavapor. Para preparar los extractos acuosos se maceró el material vegetal flor, durante 24 h. Posteriormente se preparó la solución madre a partir del extracto crudo de flor, de la cual se tomaron las concentraciones a utilizar de 1, 1.5, 2, 2.5, 3 y 3.5%.

Preparación de los tratamientos

Para los extractos orgánicos y acuosos se prepararon seis disoluciones de diferente concentración, al 1, 1.5, 2, 2.5, 3 y 3.5% y como testigo se utilizó solamente solvente puro o agua destilada según correspondiera.

Bioensayos in vitro

A las semillas utilizadas para este bioensayo se le realizaron previamente pruebas y se seleccionaron aquellas que tuvieran 95% de viabilidad. El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de Productos Naturales en la Facultad de Ciencias Agrotecnológicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua, según el método descrito por Pérez-Leal et al. (2005). En cajas petri de 10 cm de diámetro se colocó papel filtro Wattman Núm.1, adicionándose por separado 2.5 ml de cada concentración de los extractos acuosos de flor, se distribuyeron 50 semillas de cada especie, utilizándose como testigo agua destilada. Una vez preparadas las placas y selladas con parafilm, se introdujeron a una cámara de germinación a 24 °C en periodo diurno (16 h de luz) y a 20 °C durante el periodo nocturno (8 h oscuridad). Se probaron cada una de las concentraciones en dos especies de monodicotiledoneas de S. halepense. L. multiflorum y tres especies de dicotiledóneas L. vitrosa, A. donax y Medicago sativa.

Para los extractos orgánicos a diferencia del extracto anterior, se adicionaron 1.5 ml de cada concentración dejándose evaporar completamente antes de depositar las semillas, finalmente, se agregaron 2.5 ml de agua destilada a cada caja y se colocaron las semillas correspondientes. El testigo se preparó de manera similar utilizando el disolvente puro correspondiente y posteriormente evaporándolo. Se mantuvieron hidratados los tratamientos con agua destilada y se tomaron lecturas cada 24 h. Las variables que se consideraron para evaluar la actividad alelopática: fueron germinación total (Gt; porcentaje de semillas germinadas) y velocidad de germinación acumulada (VGA) según Anjum y Bajwa (2005).

La última lectura se realizó tomando en cuenta el ciclo de germinación establecido para cada semilla, según se establece en las reglas internacionales para el ensayo de semillas (Anónimo, 1976).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza para un diseño experimental completamente al azar, con cuatro repeticiones por tratamiento, la unidad experimental fue una caja petri con 50 semillas y una comparación de medias de Tukey mediante el uso del software SAS versión 9.0 (2002).

Resultados y discusión

Cuando se evaluó la fitotoxicidad del extracto acuoso, en la inhibición de la germinación de las especies, se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos respecto del control. Jhonson presentó una inhibición de 100% en la germinación a partir de la concentración mínima probada (Figura 2). Las semillas de lechuga y carrizo presentaron 60% mientras que Rayrass y alfalfa, tuvieron 20% de inhibición en la germinación. Estos resultados muestran que el extracto acuoso en las semillas de malezas Jhonson y Carrizo son más susceptibles a la actividad fitotóxica de A. mollissimus.

Corbino et al. (2002) estudiaron la posible actividad biológica de extractos foliares de Chenopodium album sobre la germinación de semillas y el crecimiento de plántulas de lechuga, y observaron inhibición del extracto acuoso, produciendo diferencias significativas respecto del control, en la longitud del hipocotilo. Asimismo, Puente et al. (2003) comprobaron el comportamiento alelopático del cultivo del girasol (Helianthus annuus L.) en la germinación y desarrollo de algunas malezas bajo condiciones de campo controladas. Utilizaron extractos acuosos de girasol al 50% (v/v) con 5 mL del extracto, mostrando una mayor inhibición en la germinación y en el retardo del crecimiento.

Extracto de diclorometano

Los resultados mostraron que la concentración y las diferentes especies probadas provocaron diferencias estadísticas significativas en relación al control (Figura 2), en Jhonson y Carrizo a partir de la concentración mínima probada tuvieron una efectividad 98% en la inhibición de la germinación, en lechuga se registró 70% de inhibición, sin embargo en Raygrass, a partir de la concentración de 2.5%, se obtuvo una inhibición de 50%. Al comprar el efecto fitotóxico sobre la germinación de los extractos diclorometano de flor en las cinco especies, resultó ser efectivo en la inhibición de la germinación de estas especies. Existen numerosas investigaciones con extractos de diversas especies al referirse a la fitotoxicidad y efecto alelopático (Blanco, 2006) Helianthus annus, Ipomea batata. L. (Blanco et al., 2007) Saccharum spp. (Arévalo, 2011) entre otras. Por su parte Pérez-Leal et al. (2005) menciona que los extracto de diclorometano afecta quizás debido a la naturaleza de baja polaridad; su capacidad para penetrar en la semilla y el tejido; la dispersión y la acumulación en los compartimentos intracelulares, y la diferente solubilidad de las fracciones en agua.

Extracto de metanol

Presentó diferencias estadísticamente significativas, en las semillas de Jhonson y Carrizo a partir de la mínima concentración probada, con el mayor porcentaje de inhibición de 100% y el más bajo lo presentó Raygras con un 40 % de inhibición de la germinación (Figura 3). Asimismo, Cabral et al. (2008) determinaron el potencial alelopático de neem (Azadirachta), sobre el crecimiento del sorgo, utilizando extractos de metanol, agua y hexano, en concentraciones de 10, 5 y 2 g de las flores de neem, obtenido un porcentaje de inhibición de 80% lo que es similar a los resultados obtenidos en este trabajo, por lo que podemos decir que A. mollissimus, resultó fitotóxico en dos de las especies probadas, tomando en cuenta el alto porcentaje de inhibición obtenido.

Existieron diferencias significativas en todos los tratamientos probados. El mayor porcentaje de inhibición de la germinación, con 90% correspondió a Jhonson y Carrizo, mientras que Alfalfa Raygras y lechuga presentaron una inhibición de 65% a partir de la concentración mínima probada (Figura 3).

Estos resultados han permitido evidenciar los efectos fitotóxicos de los extractos de A. mollisimus como potenciales inhibidores del crecimiento de plántulas, lo cual es necesario para el control de malezas y otras plantas no deseadas. (Gámez et al., 2002).

Asimismo, se puede inferir que la germinación de semillas de Carrizo y Jhonson fueron las más afectadas por los cuatro extractos, posiblemente porque son los más sensibles. Por otro lado, aunque se observó baja fitoxicidad del extracto acuoso en comparación con los orgánicos, el primero tiene menos implicaciones ecológicas, aunque el estudio de los extractos orgánicos permite identificar sustancias o metabolitos en algunos casos con mayor potencial fitotóxico, y pueden servir de modelo para la síntesis de nuevos herbicidas naturales (García-Mateos et al, 2005). Sin embargo, se considera que la inhibición de germinación detectada en este bioensayo hay que contrastarla en condiciones de campo, donde intervienen un mayor número de variables bióticas y abióticas (Chocarro y Lloveras, 2014).

Velocidad de germinación acumulada

Se calculó adicionalmente la velocidad de germinación acumulada (VGA) (Chiapusio et al, 1997), observándose que en el extracto acuoso a partir de la mínima concentración probada, lechuga, Jhonson y Carrizo disminuyen su emergencia.

En el extracto diclorometanico de flor, Carrizo y Jhonson disminuyen su germinación a partir de la mínima concentración probada (Figura 4).

En la Figura 5, observamos que la velocidad de germinación decae a partir de la concentración de 1% en Carrizo y Jhonson con el extracto acetona flor y la concentración de 1.5% hace efecto en las demás especies disminuyendo su velocidad de emergencia y de ahí continua su disminución.

En metanol todas las especies disminuyen su emergencia en la concentración de 1%, (Figura 5). Estos resultados coinciden con los observados para Gt.

Conclusiones

Se concluye que Astragalus mollissimus Torr., en su órgano flor fue efectivo en la inhibición de la germinación en un rango de 90% en las semillas de Jhonson y Carrizo, con los extractos de diclorometano acetona y metanol, el cálculo de la germinación acumulada determinó que a partir de la mínima concentración probada, se observa el efecto fitotóxico del extracto, por lo que resultaría conveniente proseguir con el estudio fitoquímico, con el fin de obtener los compuestos responsables de la actividad biológica.

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