Identificación molecular y biológica de las razas 0 y 5 de Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato del garbanzo en el noroeste de México*

Molecular and biological identification of physiological races 0 and 5 of Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato of chickpea in northwest Mexico

Sixto Velarde Félix¹, Pedro F. Ortega Murrieta², Gustavo A. Fierros Leyva², Isidoro Padilla Valenzuela³, Erasmo Gutierres Pérez⁴, Franklin G. Rodríguez Cota⁵, José A. López Valenzuela⁶, Jorge A. Acosta Gallegos⁷ y José A. Garzón Tiznado^6§

¹ Campo Experimental Valle de Culiacán- INIFAP. Carretera Culiacán-Eldorado km 17.5, Culiacán, Sinaloa, México. C. P. 80430.

³Campo Experimental Norman E. Borlaug-INIFAP. Calle Dr. Norman E. Borlaug km 12. Cd. Obregón, Sonora, México.

⁴Sitio Experimental Santo Domingo-INIFAP. Carretera Transpeninsular Km. 208. Cd. Constitución, B. C. S., México.

⁵Campo Experimental Valle del Fuerte-INIFAP. Carretera. México-Nogales km 1609, Juan José Ríos, Sinaloa, México.

⁶Universidad Autónoma de Sinaloa, Facultad de Ciencias Químico Biológicas. Av. de Las Américas y Blvd. Universitarios s/n, Culiacán, Sinaloa, México. C. P. 80013. ^§Autor para correspondencia: garzon24@uas.edu.mx.

⁷Campo Experimental Bajío- INIFAP. Carretera Celaya-San Miguel Allende Km. 6.5, Celaya Guanajuato, México. C. P. 38110.

* Recibido: julio de 2014
Aceptado: enero de 2015

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc) es un hongo fitopatógeno que causa la enfermedad conocida como fusariosis vascular en el cultivo del garbanzo. En México, el garbanzo para exportación sólo se cultiva en el Noroeste (Sinaloa, Sonora y Baja California Sur). Considerando que Foc limita la producción de este cultivo y que en México no existe información referente a la identificación de las razas fisiológicas de este hongo, el objetivo fue aislar e identificar mediante pruebas moleculares y biológicas las razas fisiológicas del hongo presentes en las zonas de cultivo de garbanzo de la región del noroeste de México. Durante el periodo 2010-2014 se colectaron plantas de garbanzo con síntomas de marchitez y amarillez en diferentes localidades de los estados de Sinaloa, Sonora y Baja California Sur. El hongo se aisló a partir de pequeñas porciones de la planta, los cuales fueron sembradas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar suplementado con pentanitroclorobenceno (PCNB) y cloranfenicol. Se aislaron y purificaron cultivos monospóricos, a los cuales se les extrajo el ADN para la identificación de razas fisiológicas mediante PCR y secuenciación enzimática. Estas cepas se inocularon en líneas diferenciales de garbanzo, confirmándose por primera vez en México la identificación de las razas fisiológicas 0 y 5 de Foc.

Palabras clave: garbanzo, líneas diferenciales, razas fisiológicas de Foc, secuenciación.

Abstract

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc) is a phytopathogenic fungus that causes the disease known as Fusarium wilt in chickpea cultivation. In Mexico, chickpea export only grown in the Northwest (Sinaloa, Sonora and Baja California Sur). Considering that Foc limits the production of this crop and no information concerning the identification of physiological races of this fungus in Mexico, the goal was to isolate and identify by molecular and biological tests physiological races of the fungus present in the growing areas chickpea in the northwest region of Mexico. During the period 2010-2014 were collected chickpea plants with symptoms of wilting and yellowing at different locations in the States of Sinaloa, Sonora and Baja California Sur. The fungus was isolated from small portions of the plant, which were seeded in medium potato-dextrose agar culture medium supplemented with pentanitroclorobenceno (PCNB) and chloramphenicol. We isolated and purified spore cultures, DNA was extracted for identification of physiological races by PCR and enzymatic sequencing. These strains were inoculated into chickpea in differential lines, confirming Mexico for the first time the identification of physiological races Foc 0 and 5.

Keywords: chickpea, differential lines, physiological races of Foc, sequencing.

Introducción

Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc) es un habitante natural del suelo que causa una enfermedad descrita como fusariosis vascular y ha sido reportada en la mayoría de los países donde se cultiva garbanzo (Haware y Nene, 1982), en México, Foc es el fitopatógeno más importante dentro del complejo de hongos que provocan la enfermedad conocida como "rabia del garbanzo" en este cultivo (Velarde-Félix et al., 2013). Investigaciones para evaluar fungicidas en semillas de garbanzo de diferente susceptibilidad, indican que algunos incrementan significativamente la emergencia de las plántulas y retrasan el comienzo de las enfermedades en cultivares moderadamente resistentes, pero no en cultivares altamente susceptibles como el caso de la línea P-2245 (Jiménez-Díaz y Trapero-Casas, 1985).

Se tiene reportado que las ocho razas presentan distinta distribución geográfica. Las razas 2, 3 y 4 solo han sido descritas en la India (Haware y Nene, 1982; Sharma et al., 2005); 0, 1B/C, 5 y 6 han sido principalmente mencionadas en la región del Mediterráneo y en California, E.U. (Phillips, 1988; Jiménez-Díaz et al., 1993; Halila y Strange, 1996; Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003), mientras que la raza 1A ha sido consignada en la India (Haware y Nene, 1982), California y la región del Mediterráneo (Jiménez-Díaz et al., 1993; Jiménez-Gasco et al., 2001). Existen diversas técnicas basadas en marcadores moleculares de ADN que se han usado para denotar la variabilidad genética de este patógeno como lo son los RAPD (Jiménez-Gasco et al., 2001), AFLP (Sharma et al., 2009; Gayatri et al., 2009), ITS e ISSR (Gayatri et al., 2009), así como su evolución en razas fisiológicas y patotipos (Jiménez-Díaz et al., 2002; Jiménez-Gasco et al., 2005); sin embargo, en México son escasos los estudios relacionados en este contexto, sin llegar a confirmar con precisión la identidad de las razas fisiológicas presentes (Luna-Páez et al., 2004).

La identificación precisa de las razas de Foc es de gran importancia para la generación de variedades de garbanzo resistentes a la fusariosis vascular, ya que el conocimiento del patógeno y de sus razas fisiológicas, relacionadas con el comportamiento de las variedades cultivadas en una región determinada, es un aspecto importante para el manejo de la enfermedad (Jiménez-Gasco et al., 2005, Sharma y Muehlbauer, 2007, Velarde-Félix et al., 2013). El objetivo del presente trabajo fue aislar e identificar mediante pruebas moleculares y biológicas, las razas fisiológicas de Foc presentes en las zonas cultivadas de garbanzo de la región del noroeste de México.

Materiales y métodos

Material fúngico. Durante los periodos de siembra y desarrollo del garbanzo comprendidos entre los años 2010-2014, se colectaron 30 plantas con síntomas de amarillez y marchitez en cada uno de los 500 lotes agrícolas muestreados en siete municipios del estado de Sinaloa, tres de Sonora y uno de Baja California Sur, con un total de 15 000 plantas dentro de las áreas muestreadas (Figura 1, Cuadro 1). Cada planta muestreada se colectó durante un tiempo no mayor a los 40 días posteriores a la germinación de la semilla de garbanzo.

Aislamiento y purificación de cultivos monospóricos. De las plantas de garbanzo colectadas se cortaron cilindros de tallo de 3 mm, los cuales fueron desinfestados superficialmente con hipoclorito de sodio al 2% por 2 min y etanol al 70% por 2 min, seguido de tres lavados consecutivos con agua destilada estéril. Para el crecimiento y desarrollo del hongo, el tejido vegetal fue colocado en cajas de Petri con medio papa-dextrosa-agar (PDA-Difco) suplementado con PCNB (1.5 mL L^-1) y cloranfenicol (600 mg L^-1), incubándose a una temperatura de 25 °C durante cinco días. La identificación de Fusaria se realizó con base a la morfología del micelio y microconidias en las fiálides, de acuerdo a lo propuesto por Leslie y Summerell (2006).

Para obtener cultivos monospóricos de Fusarium, se cortó un pequeño fragmento del micelio crecido en medio PDA, el cual fue resuspendido en 1 mL de agua destilada estéril, se estimó la cantidad de esporas con un hematocitómetro y mediante diluciones seriadas se obtuvo el cultivo monospórico, de acuerdo a lo descrito por Hernández-Martínez y Rangel-Montoya (2011). Los aislamientos se observaron al microcoscopio compuesto (Olympus C x 31; utilizando el objetivo 4 x) ubicando esporas individuales germinadas; se marcó el sitio sobre el agar y un fragmento de este con la espora germinada y seleccionada se transfirió a una nueva caja de Petri con medio PDA suplementado con PCNB y cloranfenicol, incubándose en las mismas condiciones anteriormente mencionadas. Por separado se transfirió un pequeño trozo de medio PDA con el hongo a tubos de ensaye que contenían arena tamizada estéril (8 x 10 hilos cm^-3) y se guardó a temperatura ambiente para su preservación.

Extracción del ADN. Para la extracción del ADN se empleó el método previamente descrito (Velarde-Félix et al., 2013), para ello, el micelio del hongo se obtuvo del medio de cultivo con el empleo de una asa bacteriológica, un fragmento de éste se maceró en mortero con pistilo de porcelana previamente esterilizados y enfriados a -70 ºC, al cual se agregó 1 mL de amortiguador de extracción que contenía: NaCl 30 mM, EDTA 30 mM y Tris Base 250 mM (pH 8.5). El producto de la maceración se colocó en tubos estériles de 1.5 mL. Enseguida se añadió a la muestra 100 µL de CTAB al 10% y 250 µL de NaCl 5M incubándose a 65 ºC durante 30 min y posteriormente se centrifugó. La solución acuosa fue lavada con un volumen de cloroformo y precipitada con isopropanol absoluto frio, finalmente la pastilla de ADN obtenida de los diferentes aislamientos se resuspendieron en 50 µL de agua libre de nucleasas (Promega) y se almacenó a 4 ºC.

Ensayos de PCR para Fo, Foc y razas fisiológicas. El ADN extraído de las muestras de Fusaria, se analizó por PCR, con el empleo de iniciadores específicos para Fo (FOF1-FOR1), Foc razas 0, 1A, 1B/C, 5 y 6, las cuales han sido reportadas en América (Jiménez-Gasco et al., 2001), se utilizó un termociclador (Nyx Technik Amplitronyx Series 6 A6 (ATC401) Thermal Cycler). La mezcla de reacción final (15 µL) contenía 100 ng de ADN, una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, MgCl₂, amortiguador de PCR, ADN Taq polimerasa (provisto por Promega^® PCR Master Mix, Catalogo No. M7502), 40 pmoles de cada oligonucleótido (Sigma^®). Las condiciones de amplificación para Fo fue de acuerdo a las descritas por Mishra et al. (2003) (Cuadro 2), mientras que para Foc y razas específicas fueron descritas por Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz (2003) (Tabla 2).

Secuenciación enzimática

Los productos amplificados de las razas fisiológicas fueron escindidos de la agarosa y purificados a través de columnas de sílica (EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit BS354, Bio Basic Inc.). Una vez obtenido el fragmento de PCR purificado, se procedió a enviar estas muestras para su secuenciación a el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad (LANGEBIO) del Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV-IPN), Unidad Irapuato, Guanajuato, México, basada en el método ddNTPs (Sanger et al., 1977), utilizando un secuenciador 3730 XL DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) y el kit Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La búsqueda de similitud entre secuencias de ADN se realizó por medio del programa BLAST, con el cual se compararon las secuencias de nucleótidos en estudio, con las bases de datos del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), identificándose los valores de homología.

Ensayos de razas fisiológicas de Foc mediante líneas diferenciales de garbanzo

Con el empleo de la secuenciación se detectaron la raza 0 (103 cepas monospóricas) y la raza 5 (212 cepas monospóricas). Por ello, se realizó un bioensayo de patogénesis en líneas diferenciales de garbanzo para confirmar biológicamente la identidad de estas razas en base a la respuesta de resistencia o susceptibilidad de cada línea diferencial, de acuerdo a la siguiente descripción. En inoculaciones artificiales de la raza 0, se ha descrito que las plantas susceptibles mueren hasta los 40 días después de la siembra en suelo, presentando el desarrollo progresivo de clorosis, amarillez y necrosis de foliolos, que progresan de forma acrópeta en la planta, dando lugar a la defoliación de esta (Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, 1985; Navas-Cortés et al., 2007). En la determinación de la raza 0, se usaron las líneas diferenciales JG-62 y P-2245 determinadas como resistente (R) y susceptible, respectivamente (S) (Rubio et al., 2003).

En la raza 5, el síndrome de marchitez se describe como un desarrollo rápido de flacidez y clorosis en las hojas, en ausencia de amarillez, que se extiende poco después al resto de la planta. La flacidez es seguida por la desecación de hojas y tallos, los foliolos permanecen adheridos al raquis y posteriormente la planta muere antes de los 30 días después de la siembra en suelo (Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, 1985; Navas-Cortes et al., 2007; Sharma y Muehlbauer, 2007). Las líneas diferenciales para la raza 5 fueron: JG-62 (S), P-2245 (S), SANFORD (S), CRIL-1-53 (R), CRIL-1-94 (I= intermedia), CRIL-1-17 (R), CRIL-1-36 (R) y WR-315 (R) (Sharma y Muehlbauer, 2007).

Las semillas de las líneas diferenciales de garbanzo fueron obtenidas del banco de germoplasma de garbanzo del Campo Experimental Valle de Culiacán-INIFAP. Para la preparación del inoculo del hongo, este fue crecido en medio PDA suplementado con PCNB y cloranfenicol durante una semana, a 25 ºC. De este medio, se cortaron ocho fragmentos de micelio y fueron depositados en un matraz con medio AMA (arena 450 g, harina de maíz 50 g, agua estéril 50 mL) incubados bajo las mismas condiciones durante 15 días. La desinfestación de las semillas de garbanzo de cada una de las líneas diferenciales consistió en lavarlas en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5% durante 3 min y posteriormente enjuagarlas en agua destilada estéril y para su germinación estas fueron depositadas en una incubadora a 25 °C durante 48 h.

Germinadas las semillas, estas fueron seleccionadas por uniformidad en tamaño, depositando cuatro plántulas por maceta. Para la preparación de la tierra-sustrato, se realizó una mezcla de tierra muerta (6 kg), turba (3 kg) y medio AMA (1 kg) (con inóculo del hongo) y 600 g de esta mezcla fueron depositados en macetas previamente esterilizadas. La cantidad de inoculo para ambas razas fue de 30 000 ufc/g de suelo. El experimento fue realizado con base al protocolo de Trapero-Casas y Jiménez-Díaz (1985) y Navas-Cortés et al. (2007) en un invernadero a 25 ºC y un fotoperiodo de 12 h. Se realizaron tres repeticiones de macetas incluidos los testigos sin inoculo.

Resultados y discusión

Colecta de muestras y aislamiento del patógeno. Se colectaron 15 000 muestras de plantas con síntomas de daño vascular previamente descritos (Jiménez-Díaz y Jiménez-Gasco, 2003; Sharma et al., 2005; Sharma y Muehlbauer, 2007); sin embargo, sólo se obtuvieron 3 585 cultivos monospóricos de Fusaria, caracterizados mediante la forma y tamaño de las fiálides de acuerdo a Leslie y Summerell (2006). Durante el proceso de aislamiento del hongo a partir de los tejidos vegetales con síntomas de daño vascular, 76.1% de las cajas de petri del cultivo in vitro se detectó la presencia de bacterias y otros hongos que posiblemente inhibieron el desarrollo de Fusaria lo que resultó en el aislamiento del hongo de interés en 23.9%. Esto coincide con reportes previos en donde señalan resultados similares al nuestro y mencionan que entre estos microorganismos es común encontrar antagonistas (Landa et al., 2004).

Extracción del ADN

Se realizó el aislamiento de ADN de cada uno de los 3 585 cultivos monospóricos, mismos que se usaron para el análisis de Fo, Foc y razas mediante PCR y secuenciación.

Ensayos de PCR para la identificación de Fo, y razas fisiológicas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris.

A partir de las 3 585 muestras de ADN de los cultivos monospóricos de Fusaria, 3 224 correspondieron a Fo mediante PCR, correspondiendo al tamaño amplificado de 0.34 kpb propuesto por Mishra et al. (2003) (datos no mostrados) y de estas en 315 amplificados por PCR se obtuvo un tamaño aproximado de 1.5 kbp, predichos para la detección de Foc de acuerdo a la descripción de Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz (2003); en la Figura 2, se observan los fragmentos amplificados con el tamaño predicho en algunas de las muestras analizadas a manera de ejemplo que describen a Foc (carriles 4 a 20). En el carril correspondiente al control negativo, no se observó amplificado. Sobre estas muestras de ADN amplificadas, se realizó un análisis específico para las razas fisiológicas "0", "1A", "1B/C", "5" y "6". En la Figura 3, en los carriles 2 al 19 se observan los fragmentos amplificados de 0.9 Kbp descritos por Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz (2003) para la raza "0", en el carril 20, correspondiente al control negativo sin ADN, correspondiente al control negativo, no se observó amplificado. En total se obtuvieron 103 amplificados positivos para la raza "0".

En la Figura 4, se describen los resultados correspondientes al análisis para la detección de la raza "5" en donde se distinguen los fragmentos amplificados con un tamaño predicho de 0.9 kbp en los carriles 2 al 19 en algunas de las muestras analizadas a manera de ejemplo. En el carril 20 correspondiente al control negativo, no se observa amplificación como se menciona en la observación anterior. En total se obtuvieron 212 amplificados para la raza "5". Los tamaños moleculares para ambos amplificados coincidieron con los reportados (Jiménez-Gasco y Jiménez-Díaz, 2003), siendo estos de 1.5 para Foc y de 0.9 kpb, para las razas 0 y 5, con el empleo de diferentes pares de iniciadores como se describe en la Figura 2. Bajo esta metodología, las razas 1A, 1B/C y 6 no fueron identificadas.

Secuenciación enzimática

La identidad de las secuencias de los fragmentos predichos de 0.9 kpb en nuestro estudio, tuvo una identidad 100% para la raza 0 y 99% para la raza 5 comparadas con las accesiones registradas en el GeneBank como AF491870 y AF491869, respectivamente. Ambas fueron ingresadas al GeneBank como KJ000583-raza 0 y KJ000584-raza 5. En cuanto a la comparación de las secuencias nucleotídicas entre estas dos razas, no procede debido a que los iniciadores usados para ambas razas son diferentes.

Identificación de razas fisiológicas de Foc mediante líneas diferenciales de garbanzo

Para el análisis de las razas fisiológicas de Foc de nuestro estudio, mediante líneas diferenciales, se emplearon las cepas registradas en el GeneBank como raza 0 (KJ000583) y raza 5 (KJ000584). En el bioensayo de patogenicidad para la raza 0 se observó el síntoma característico de amarillamiento del follaje, en las 12 plantas evaluadas del genotipo P-2245 (S), mientras que las 12 plantas de la línea JG-62 (R) no mostró ningún síntoma. Después de 60 días de la inoculación, las 12 plantas de P-2245 murieron (Cuadro 3), lo cual coincide con lo reportado por Trapero-Casas y Jiménez-Díaz, (1985); Navas-Cortés et al. (2007), para identificar la raza 0 (Figura 5).

Con respecto a la raza 5, los daños de la marchitez aparecieron en el follaje de las plantas diferenciales JG-62, P-2245, SANFORD y CRIL-1-94 a partir de los 19 días de inicio del experimento, mientras que las líneas CRIL-1-53, CRIL-1-17, CRIL-1-36 y WR-315, no presentaron daño. Posteriormente, a los 38 días, las 12 plantas de JG-62 y P-2245 murieron, mientras que no así en la diferencial descrita como SANFORD, en donde sobrevivieron 3 plantas y CRIL-94 que mantuvo vivas 6 plantas. Las diferenciales CRIL-1-53, CRIL-1-17, CRIL-1-36 y WR-315 no presentaron daño durante el periodo de 60 días en que se desarrolló el ensayo (Cuadro 4). Las plantas de las diferenciales usadas como testigos sin inoculo para confirmar las dos razas, no mostraron daño, coincidiendo con lo reportado por Trapero-Casas y Jiménez-Díaz. (1985) y Navas-Cortés et al., 2007 (Figura 6).

La fusariosis vascular del garbanzo en las zonas de cultivo en el Noroeste de México, hasta el momento y por los trabajos en este estudio se confirma es ocasionada principalmente por las razas 0 y 5, mismas que fueron analizadas mediante PCR, secuenciación y pruebas diferenciales. En ninguno de los lotes muestreados se logró identificar las razas 1A, 1B/C, 6 u otras razas, esto podría deberse a que otras razas no se han adaptado a las condiciones climáticas y época de siembra, aunado que podría estar implicado que las líneas y variedades generadas en el programa de mejoramiento genético del garbanzo en México sean resistente a ellas. Se considera fundamental el empleo de las metodologías moleculares y biológicas para establecer la identidad de razas fisiológicas de Foc, ya que ambas son complementarias en virtud de que la efectividad del uso de las líneas diferenciales de garbanzo que se han empleado históricamente (Haware y Nene; 1982).

Está influenciado por el genotipo, la condición del bioensayo y la observación del investigador, mientras que la caracterización molecular (PCR y secuenciación enzimática) se encuentra en una fase inicial, lo cual se demuestra por el reducido número de accesión con que se cuenta en el GenBank, de ahí que se proponga el uso de ambos métodos en el proceso de especiación de este hongo. Finalmente la identidad de estas dos razas fisiológicas de Foc encontradas en la región del Noroeste de México representa una base fundamental para el programa de mejoramiento genético del garbanzo, ya que se tiene comprobado que la mejor selección de líneas, es mediante la respuesta en cuanto a resistencia y susceptibilidad de la enfermedad bajo condiciones controladas (Jiménez-Díaz et al., 1993).

Conclusiones

Al analizar por PCR 315 aislamientos identificados como Foc, 103 amplificaron para la raza 0 y 212 para la raza 5.

Al comparar las secuencias de ADN de un amplificado correspondiente a la raza 0, con la accesión del GeneBank AF491870, se encontró una identidad de 100% y de otro amplificado correspondiente con la raza 5, con la accesión AF491869, se encontró una identidad de 99%.

Mediante los bioensayos de inoculación a plantas diferenciales, las respuestas de estas fueron específicas para la raza 0 y raza 5.

Por análisis de PCR específico, Secuenciación del ADN y bioensayos de genotipos diferenciales Se confirmó que las razas fisiológicas de Foc que infectan al garbanzo en las zonas de cultivo del Noroeste de México son la raza 0 y la raza 5.

La raza 5 se detectó con mayor frecuencia que la raza 0.

No se detectaron las razas 1A, 1B/C y 6.

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