Caracterización de germoplasma nativo de frijol con base en marcadores moleculares y atributos de calidad*

Characterization of native bean germplasm based upon molecular markers and quality attributes

Carmen Jacinto-Hernández^1§, Ramón Garza-García², Dagoberto Garza-García¹ e Irma Bernal-Lugo³

¹ Campo Experimental Valle de México-INIFAP, km 13.5 Carretera Los Reyes-Texcoco. San Miguel Coatlinchán, Texcoco, Estado de México. C. P. 56250. México. Tel. 01 (595) 9212715. Ext. 140. (dagarza60@yahoo.com).

² Universidad de Tamaulipas. (rgarzagarcia@gmail.com).

* Recibido: julio de 2013
Aceptado: febrero de 2014

Resumen

La caracterización del germoplasma nativo es fundamental para el conocimiento de la diversidad genética y su aprovechamiento en el fitomejoramiento de la calidad del grano para satisfacer la demanda de los consumidores y mejorar su nutrición sin modificar sus hábitos alimenticios. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue estimar la variabilidad genética de 111 genotipos nativos de frijol (Phaseolus vulgaris L.) de diferentes estados de México con marcadores RAPD y por sus atributos de calidad física, culinaria y contenido de proteína. Se determinó la similitud genética entre variedades por el método de promedios aritméticos de grupos apareados no ponderados (UPGMA). Con los datos sobre calidad, se realizó un análisis de componentes principales y de agrupamiento jerárquico. Cuando se utilizaron todas las variedades para generar los dendrogramas, los grupos no fueron claros, aunque parecieron estar determinados por localización geográfica; cuando se analizaron por separado los genotipos de colores amarillo mostaza y negro, en ambos casos se generaron grupos bien definidos y similares entre los obtenidos con las características tecnológicas y con los RAPD. Los genotipos nativos sobresalientes por combinar las características de calidad culinaria y alto contenido de proteína (>24.8%) fueron Ph.vulg.2346 (beige), Ph.vulg.403 (azufrado), Ph.vulg.2435 (bayo) y Ph.vulg.2519 (amarillo mostaza), las cuales podrían ser útiles en los programas de mejoramiento.

Palabras clave: variedades nativas de Phaseolus vulgaris, calidad culinaria, contenido de proteína marcadores RAPD, relaciones genéticas.

Abstract

Key words: Phaseolus vulgaris landraces, cooking quality, protein content, RAPD markers, genetic relationships.

Introducción

México es centro de origen de frijol (Gepts y Debouck, 1991), por lo que existe una gran diversidad genética expresada en la gran variabilidad en atributos de calidad del germoplasma nativo de frijol (Jacinto-Hernández et al, 2002b; Muñoz et al, 2009). Se cultiva en las diferentes regiones agroecológicas que existen y puede prosperar desde nivel del mar hasta 2 300 msnm. Esta gran variabilidad evidencia una fuente de genes que debe ser aprovechada en el mejoramiento genético, para generar nuevas variedades con las características organolépticas valoradas por los consumidores(as).

La utilización de esta variabilidad genética permitió introducir en la variedad BayoAzteca la resistencia a picudo del ejote (Apion godmani W.), plaga que causa hasta 80% de pérdidas a la producción en los Valles Altos de México. Actualmente en el Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX), se emplean los criollos Negro México-332 y el J-117 como fuente de resistencia a enfermedades como tizón común y antracnosis.

Sin embargo, esta riqueza genética se ve amenazada por diferentes factores, como el cambio en el uso de la tierra, el cambio climático que afecta la agricultura; así como por la disminución de la población económicamente activa dedicada a la agricultura. De lo anterior se deduce que la caracterización del germoplasma nativo es de capital importancia para los programas de fitomejoramiento. Por lo que el objetivo del presente estudio fue 1) estimar la variabilidad genética de 111 variedades de frijol nativo de diferentes estados de México con base en el polimorfismo detectado con marcadores tipo RAPD y por sus atributos de calidad física, culinaria y contenido de proteína; y 2) seleccionar los genotipos sobresalientes para el mejoramiento genético enfocado a generar variedades mejoradas con atributos morfológicos y de calidad culinaria similares a las preferidas por los consumidores(as) en las áreas rurales, pero con mayor aporte nutrimental, por su contenido de proteína.

Materiales y métodos

Material vegetal

Las semillas, cien de cada colecta, se sembraron en parcelas para su multiplicación, en Santa Lucía de Prías, Texcoco, Estado de México, que se ubica a los 19° 27' latitud norte y 98° 53' longitud oeste; a 2 250 msnm. El clima en el área se clasifica como Cb (Wo), templado con lluvias en verano y una temperatura media anual de 15.2 °C, con una precipitación de 636.5 mm anuales (García 1988). Cada colecta se sembró en un surco de 4 m de longitud, separados por un surco, para evitar contaminación. Las plantas se regaron y fertilizaron con la dosis N-P-K fue de 40-40-00 al momento de la siembra. Se colocaron estacas de madera para que pudiesen desarrollar sus guías las variedades de hábito IV.

Se registró el hábito de crecimiento de las variedades de acuerdo a la clasificación del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT 1984). Del total de colectas, 109 mostraron un sólo color de grano y dos estuvieron compuestas por distintos colores, en estos casos de cada accesión se seleccionaron granos del color predominante. Para el manejo de las colectas en el campo y en el laboratorio se les asignó un número de identificación denominado "tratamiento", y entre paréntesis se indica el número de curador asignado por el Banco de Germoplasma.

Análisis RAPD

El ADN se extrajo mediante el método descrito por Afanador et al. (1993), de la hoja trifolia de plantas cultivadas en el invernadero en 2009. Se almacenó a -20 °C. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron en un equipo Techne-PHC-512, con las condiciones descritas por Jacinto-Hernández et al. (2003).

Los datos moleculares se ordenaron en una matriz en la que los fragmentos de RAPD se calificaron 1 ó 0 para presencia o ausencia de la banda respectivamente utilizando el paquete NTSys (Rohlf2002). Únicamente se incluyeron en el análisis los datos de las bandas que pudieron inequívocamente ser calificadas en todas las muestras. Las similitudes genéticas entre muestras se agruparon por el método de promedios aritméticos de grupos apareados no ponderados- UPGMA-(Sneath y Sokal 1981), con ésta información se generó un dendrograma con el NTSYS-pc.

Pruebas físicas, calidad culinaria y contenido de proteína

Los genotipos se clasificaron por su raza, según la descripción de Singh et al. (1991), así como también por su tamaño, color y brillo de la testa, de acuerdo al CIAT (1987). Las características tecnológicas, asociadas con la calidad culinaria que se midieron fueron la capacidad de absorción de agua, tiempo de cocción del grano y el porcentaje de sólidos en el caldo, que es un indicador del espesor del mismo, así como el porcentaje que representa la testa con respecto al peso total del grano. Las pruebas se realizaron por duplicado, de acuerdo a la metodología descrita por Guzmán et al. (1995).

Resultados y discusión

Caracterización por hábito de crecimiento y color de grano

De las 111 variedades, cuatro (3.6% del total) se clasificaron como de hábito de crecimiento erecto (hábito II); 92 (82.9%) como semiguía postrado (hábito III) y seis (5.11%) como trepador (hábito IV), en nueve genotipos no se obtuvo el dato. Por el color de la testa se formaron 14 grupos que se denominaron "tipos" de frijol. Predominaron los genotipos de color amarillo mostaza (19.8%) y negro (22.5%); aunque dentro de la diversidad se apreciaron algunos poco convencionales como color vino, acerados, vino con pintas crema y pinto moteado morado-crema-negro. Un 58% de los genotipos mostró testa brillante y 42% testa opaca, lo cual coincide con lo descrito por Cárdenas et al. (1996) quienes indican que del total de las colectas existentes en el Banco de Germoplasma del INIFAP; 70% tienen testa brillante o intermedio y 30% testa opaca. Dentro del grupo de los negros hubo 21 brillantes y sólo 4 opacos.

Considerando lo detectado en trabajos de recolección de frijol nativo recientes (Díaz et al, 2008; Ramírez-Pérez et al, 2012), el patrón de preferencia en la zona de Puebla, de donde proviene la mayor parte de genotipos del presente estudio (47.7%), continúa siendo similar al de hace más de 30 años (Cárdenas et al, 1996), con predominancia de los tipos color amarillo mostaza, negro y crema, aunque no se ha documentado si ha habido variación en la diversidad genética dentro de cada tipo de frijol, como consecuencia, entre otros factores, del cambio climático.

En la época en la que se colectaron los genotipos nativos estudiados, los efectos del cambio climático eran menores. En la zona de los Valles Altos de México, de donde provienen la mayoría de los genotipos, el cultivo se realiza bajo condiciones de temporal, por lo que la siembra depende del inicio de la época de lluvia. De acuerdo a los datos de la Comisión Nacional del Agua (CONAGUA, 2008; SIAP, 2008) de México y a los de Breña (2004), la precipitación pluvial en los primeros meses del año ha disminuido.

Hace aproximadamente 10 años la precipitación pluvial en marzo, permitía establecer las siembras; mientras que actualmente es en mayo, junio o julio cuando se inician. El periodo de lluvias y libre de heladas, que antes era de 130 a 140 días, actualmente es de aproximadamente 110 a 120.

Antes de la temporada de lluvias no es posible establecer el cultivo. Éste efecto del cambio climático tiene un impacto directo sobre la diversidad de los cultivos ya que un periodo de lluvias corto limita la siembra de genotipos de ciclo largo (20-150 días), característico de los genotipos nativos de frijol, que serían afectados por las bajas temperaturas, propias de los Valles Altos, antes de concluir su ciclo de desarrollo.

Del análisis con RAPDs se obtuvieron 121 bandas cuyo tamaño varió de 0.3 a 3 kb. El número de bandas generadas por primer varió de 7 a 16 y 89% fueron polimórficas. En el dendrograma generado con los datos RAPD, (figura no presentada por la complejidad para visualizar los datos debido al número de genotipos) se conformaron tres grupos, en los cuales se formaron subgrupos con tendencia a asociarse con el origen geográfico. El genotipo 165 (Ph. vulg. 393), originario del Estado de México se ubicó independiente a los demás grupos del dendrograma. Ésta variedad es de color amarillo mostaza, y es de las pocas de hábito IV.

Tamaño de grano, calidad culinaria y contenido de proteína

Se observó una gran diversidad entre tipos, en el tamaño de grano, medido como volumen, que osciló entre 12 y 48 mL. Ésta variable se relaciona directamente con el peso (r= 0.95**), el cual mostró un intervalo de 13 hasta 53.6 g / 100 semillas. La mayoría de los genotipos nativos fueron de tamaño mediano (de 25-40 gramos por 100 semillas) y existieron sólo tres de grano grande (> 40 g/100 semillas) en color amarillo mostaza, bayo y crema. La densidad, de los granos, la cual se relaciona con el espacio que la semilla requiere para su almacenamiento y probablemente también con las propiedades organolépticas varió entre 0.88 y 1.65 g/mL.

La capacidad de los genotipos para absorber agua fue de 9 a 108%. Existió una asociación negativa entre nivel de agua absorbida (r= -0.69**) con el tiempo de cocción, es decir que las muestras que absorbieron mayor cantidad de agua mostraron tiempos de cocción más breves, lo cual coincide con lo encontrado por Jacinto-Hernández et al. (2002a), quienes detectaron una correlación de r=-0.66** entre la capacidad del grano para absorber agua y el tiempo de cocción.

Las diferentes variedades se cocieron entre 55 a 126 min. Éste amplio intervalo en el tiempo de cocción puede deberse a la interacción genotipo- ambiente (Jacinto-Hernández et al., 2003).

Las variedades del tipo Flor de Mayo y alubia fueron las que en promedio requirieron mayor tiempo de cocción (99 y 97 min respectivamente), en comparación con los negro-opaco que fueron más suaves a la cocción (Cuadro 1). Al contrastar el tiempo de cocción del frijol negro opaco con el brillante se observó que las variedades con testa brillante mostraron tiempos de cocción más largos, lo cual podría relacionarse con el efecto de la capa de cera epicuticular que confiere el brillo de la testa; y cuyo grosor y uniformidad, según el estudio de Bushey et al. (2002), pueden influir en la capacidad de absorción de agua durante el remojo.

Sin embargo, algunos genotipos, como el tratamiento 31 (Ph. vulg. 1975) (negro brillante) y el tratamiento 110 (Ph. vulg. 6) (café brillante-acerado) fueron de cocción rápida (75 min), aun cuando presentaron baja capacidad para absorber agua, lo que se conoce como "testa dura", mientras que genotipos como el tratamiento 15 (Ph. vulg. 4823) (flor de mayo) y el tratamiento 11 (Ph. vulg. 1941) (alubia pequeña) embebieron más de 90% de agua, con relación a su peso, y mostraron tiempos de cocción superiores a 100 min. Lo anterior demuestra que las características de dureza a la cocción y permeabilidad de la testa pueden ser independientes.

Se observaron diferencias significativas en el espesor del caldo de cocción entre los tipos de frijol. El intervalo en el contenido de sólidos en el caldo estuvo entre 0.22% y 0.60%, lo cual indica una diversidad de opciones en el uso culinario. Éstos resultados coinciden con los reportados por Jacinto y Campos (1993), para variedades mejoradas. A mayor tiempo de cocción los caldos fueron más espesos, lo cual sugiere que cuando el tiempo de cocción se prolonga permite la lixiviación de mayor cantidad de sólidos del grano, principalmente carbohidratos, lo cual se relaciona con el sabor y consistencia. Los caldos más espesos contienen más sólidos y son preferidos por los consumidores (Jacinto-Hernández et al., 2002b).

Análisis de componentes principales con datos de calidad de grano

El análisis de componentes principales (CP), se realizó con datos de las siete características que incluyeron en los atributos físicos, de calidad culinaria y contenido de proteína. Los tres primeros componentes explicaron 81% de la variación total: el primero 39%; el segundo 28%; y el tercero 14%.

En el primer componente, las variables más importantes fueron el peso (0.5772) y volumen de 100 granos (0.5660). Lo anterior indica que el peso y el tamaño del grano, son caracteres que permiten discriminar entre genotipos. Por la alta correlación mostrada entre ambas variables, podría emplearse únicamente el peso del grano por ser más fácil de medir. En el segundo componente, las variables más importantes fueron la capacidad del grano para absorber agua durante el remojo (-0.5715), así como el tiempo de cocción (0.5576) y el espesor del caldo (0.4717), éstas son variables que miden la calidad culinaria, que es un parámetro determinante para la aceptación comercial. En el componente principal tres, las variables de mayor peso fueron el contenido de proteína (0.7993) y el porcentaje de testa (0.4968).

En la Figura 1, conformada por dos componentes principales, se observa que el mayor número de genotipos se ubica en los cuadrantes III y IV. Mientras que en el cuadrante I, se ubican el tratamiento 23 (Ph. vulg. 2 712) que se distingue por su dureza a la cocción; el tratamiento 38 (Ph. vulg. 7 260) y el 44 (Ph. vulg. 7 278); éstos dos últimos de grano grande (>55g por 100 semillas) y de tiempo de cocción intermedio (73-83 min); los tres genotipos presentan caldo espeso (>0.53 %) y pertenecen a la raza Durango.

En el cuadrante II, se ubicaron los tratamientos 27 y 32 (Ph. vulg. 1 978 y Ph.vulg. 1 954, respectivamente) provenientes de Oaxaca y los tratamientos 17 y 34 (Ph. vulg. 4 829 y Ph. vulg. 4 828), de Zacatecas. El tamaño de grano de los cuatro genotipos varía de pequeño a mediano, muestran baja capacidad para absorber agua y alto tiempo de cocción. El contenido de sólidos en el caldo de los genotipos Ph. vulg. 1 978 y la Ph. vulg. 1 954 es bajo (<0.27 %), mientras que el de Ph. vulg. 4 829 y Ph. vulg. 4 828 es superior (0.39 y 0.40% respectivamente).

En el cuadrante III el único que se separa es el tratamiento 64 (Ph. vulg. 7 273), alubia con alta capacidad para absorber agua, tiempo de cocción moderado y escaso contenido de sólidos en el caldo de cocción. Finalmente en el cuadrante IV el tratamiento 101 (Ph.vulg. 2 346), con grano beige, se separa se los demás por sus características de tamaño grande (40 g por 100 semillas), alta capacidad para absorber agua, rápida cocción (67 min), alto contenido de sólidos (0.47%), y además presenta bajo contenido de testa (8.9%) y alto contenido de proteína (25.3%), atributos que lo ubican como de calidad culinaria y nutrimental sobresaliente.

Análisis de agrupamiento de los dos tipos de frijol con mayor número de genotipos

Para determinar la variabilidad entre genotipos de un mismo color de grano se analizaron por separado los 22 genotipos amarillo mostaza y los 25 de color negro, incluidos brillantes y opacos, que representan los grupos con más individuos, tanto en los datos RAPD como en los de calidad.

En la Figura 2 se observa que en el agrupamiento por similitud genética de 22 genotipos de color amarillo mostaza se conformaron dos grupos, el I de seis genotipos y el II de 16. En el I se ubicaron cercanos entre sí los tratamientos 10 y 26 (Ph. vulg. 2 703 y Ph. vulg. 2 719), ambos de Veracruz y el 38 (Ph. vulg. 7 260) proveniente de Aguascalientes; así como los tratamientos 74, 88 y 93 (Ph.vulg. 2 857, Ph.vulg. 3 760 y Ph.vulg. 2 534) del estado de Puebla. En el grupo II se ubicaron genotipos de los estados de Puebla, uno de Hidalgo, y Estado de México.

En el dendrograma generado con los datos de calidad de grano (Figura 3), a semejanza del obtenido con datos RAPD, se conformaron también dos grupos con similar distribución de tratamientos.

El segundo grupo por su tamaño (18.9% del total) fue el de color negro brillante, que en conjunto con el negro opaco (3.6% del total), presentaron un 17.3 a 39.3 gramos por 100 semillas, tiempo de cocción entre 55 y 101 min, espesor del caldo desde 0.24 a 0.51% de sólidos; contenido de proteína de 18.8 a 24.8%.

El agrupamiento de los genotipos de color negro con base en los datos RAPD fue influido por el origen geográfico, los genotipos del estado de Puebla, y Estado de México se ubicaron cercanos y mezclados entre sí, mientras que los de Veracruz, Chiapas, Oaxaca y Aguascalientes se localizaron cercanos entre sí pero separados de los de Puebla y Estado de México. El dendrograma obtenido con los datos de calidad de grano mostró una agrupación semejante, con dos grupos, en el I se ubicaron los genotipos de Veracruz, Chiapas, Oaxaca, Aguascalientes y uno de Puebla mientras que en el II los de México y Puebla y sólo uno de distinta procedencia; el tratamiento 67 (Ph. vulg. 7 352) proveniente de Querétaro.

Conclusiones

Se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre tipos en cuanto a la forma y tamaño de grano, tiempo de cocción, espesor del caldo y contenido de proteína. Algunas variedades con características sobresalientes para ser utilizadas como progenitores en los programas de mejoramiento por sus atributos de calidad culinaria y contenido de proteína son los tratamientos 101 (Ph.vulg.2 346, beige), 168 (Ph.vulg.403, azufrado), 145 (Ph.vulg.2 435, bayo) y 176 (Ph.vulg.2 519, amarillo mostaza).

La influencia del origen geográfico en la agrupación con los datos de marcadores RAPD, como con datos de calidad culinaria sugiere que ha existido recombinación genética entre los frijoles nativos, aun cuando presentan diferencias morfológicas. Asimismo la selección realizada por los campesinos usando características morfológicas del grano, y la influencia del ambiente establece diferencias en los atributos de calidad del grano entre variedades de diferente procedencia.

Dado que entre los genotipos nativos de un mismo color algunos sobresalen por su contenido de proteína, sería posible introducir variedades de mayor aporte nutrimental en algunas regiones sin modificar los hábitos alimenticios, en las regiones con problemas de desnutrición.

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